Generatie van het vroeg-zwangerschapsmodel van moederlijke immuunactivatie om prenatale ontsteking op de neuroontwikkeling te beoordelen

Ons laboratorium onderzoekt hoe prenatale ontsteking de biologie van microglia verandert, de immuuncellen van de hersenen die bijdragen aan nadelige neuro-ontwikkelingsuitkomsten. Bestaande MI-modellen richten zich op halverwege de zwangerschap. We presenteren echter een vroeg gestationeel protocol dat bovendien kwaliteitscontrole-indicatoren bevat om de overleving en consistentie te verbeteren.

Het model kan worden toegepast op elk wild type of genetisch muismodel om de impact van omgevingsontsteking op hersenontwikkeling te onderzoeken. Om te beginnen zet je twee vrouwelijke muizen van acht tot tien weken oud C57 BL6 op met C57 BL6 fokmannetjes in de late middag of avond. Controleer de volgende ochtend de vrouwelijke muizen op vaginale plugs en blijf ze dagelijks controleren totdat ze stoppen.

De stekkers zijn tijdelijk en kunnen er 's middags uitvallen, als ze 's ochtends niet worden gecontroleerd. Na het bevestigen van een vaginale plug weeg je de vrouwelijke muis en registreer je het gewicht om de zwangerschapsstatus te monitoren door de gewichtstoename tijdens de zwangerschap te volgen. Scheid de vrouwtjes in individuele kooien en houd ze onder standaard huisvestingsomstandigheden met ad libium toegang tot voedsel en water.

Wijs verstopte vrouwen aan als embryonale dag 0,5 en registreer de datum van de vaginale plug om een nauwkeurige tracking van de zwangerschapsduur te garanderen. Om gelyofilieerde poly-IC te reconstitueren tot een hooggeconcentreerde voorraadoplossing, los deze op in steriele zoutoplossing of steriel water volgens de instructies van de fabrikant. Vortex de hoogconcentratie stockoplossing.

Verdun vervolgens de oplossing in zoutoplossing om een bouillon met lage concentratie te maken. Om herhaalde vriesdooicycli te voorkomen, aliquot ongeveer 125 microliter van de lage concentratie in 1,5 milliliter buizen en bewaar je de buizen bij 20 graden Celsius of 80 graden Celsius. Direct voor de injectie op embryonale dag 9,5.

Verdun de laaggeconcentreerde poly-IC-voorraad met steriele zoutoplossing om een werkconcentratie te verkrijgen. Verwarm de werkkolf 10 minuten op 65 graden Celsius om een goede reanealing van de dubbelstrengs ribonucleïnezuurstructuur te garanderen. Daarna vortex of pipet de oplossing om een homogeen mengsel te garanderen vóór de injectie.

Om zwangerschap te bevestigen, weeg je de dam op de ochtend van embryonale dag 9,5. Bereken het poly-IC injectievolume voor moederlijke immuunactivatie, of MIA, en het 0,9% zoutoplossingsinjectievolume voor controles. Trek het juiste volume van de voorbereide poly-IC werkoplossing of zoutoplossing in een steriele spuit van 27 gauge of kleiner.

Zet nu de dam goed vast om pijn en stress te minimaliseren. Injecteer het poly-IC-zuur of zoutoplossing intraperitoneaal in de linker- of rechterkwadrant net boven de heuphoogte of bij de tweede set tepels. Gooi daarna de spuiten weg in een BioSafety Sharps-container.

Noteer ook de injectiekant om consistentie in de hele cohort te behouden. Breng de dam onmiddellijk terug naar de kooi van het huis en houd in de gaten op tekenen van stress. Vul daarna de kooi aan met hydrogel gedurende minstens 24 uur na de injectie om uitdroging door ziektegedrag te voorkomen.

Daarna noteer je het geïnjecteerde volume van de poly-IC dosis, injectiedatum en -tijd, zwangerschapsduur en poly-IC lotnummer. Drie uur na de injectie observeer je elke muis afzonderlijk gedurende één minuut en beoordeel je gedrag zoals verminderde activiteit, gebogen houding, grimassen in het gezicht of waterige ontlasting met een driepuntsschaal. Classificeer muizen die een of meer van deze gedragingen vertonen als vertonend acuut ziektegedrag.

Vervolgens wordt met een minimaal invasieve methode zoals staartbloeding zorgvuldig moederbloed van de geïnjecteerde moeder verzameld. Verzamel ongeveer 50 microliter bloed. Na bevestiging van hemostase breng je de dam terug naar de thuiskooi.

Laat het verzamelde bloed 30 minuten stollen bij kamertemperatuur. Centrifugeer het monster op 2000 G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur om het serum van het stolsel te scheiden. Na het opnieuw centrifugeren van het monster, verzamel je zorgvuldig de heldere bovenste serumlaag zonder het stolsel te verstoren.

Bewaar het serum op 20 graden Celsius, totdat het klaar is voor downstream cytokine-analyse. Na de injectie weeg je de dammen dagelijks gedurende drie dagen om de reactie op poly-IC zuur te monitoren. Op de dag van verwachte bevalling registreer je nestuitkomsten, waaronder nestgrootte, puplevensvatbaarheid of geen nest, om een mislukte dracht aan te geven.

Verwijder onmiddellijk overleden welpen en verwijder ze volgens de institutionele bioveiligheidsrichtlijnen. Gebruik ELISA of multiplex-assays om ontstekingscytokines zoals IL-6 en TNF-alfa te kwantificeren in maternale serum na MIA of controle-injecties volgens de instructies van de fabrikant. Na kwantificering wordt de resultaten gebruikt om een representatieve drempel voor de MIA-respons vast te stellen.

Voer tot slot een statistische analyse uit met onze software om de relatie tussen maternale serum IL-6 en TNF alfa-niveaus te beoordelen. Na toediening van poly-IC op embryonale dag 9,5 vertoonden MIA-dammen significant verhoogde IL-6-niveaus ten opzichte van controledammen. TNF-alfaniveaus vertoonden een sterke positieve correlatie met de IL-6-niveaus van de moeder.

Tussen embryonale dag 0,5 en embryonale dag 9,5 kwamen moeders die succesvol een nest ter wereld brachten, aanzienlijk meer gewicht aan dan moeders die geen nest kregen. Een dag na de injectie verloren MIA-dammen gewicht, terwijl zoutbehandelde controledammen aankwamen. Maar op embryonale dag 12 vertoonden beide groepen vergelijkbare gewichtstoename.

Het gewicht vóór de zwangerschap beïnvloedde de effectiviteit van het nest niet in noch bij zoutbehandelde controledieren als bij MIA-dammen. C57 BL6-muizen afkomstig van Jackson Labs hadden echter meer succesvolle nesten dan C57 BL6-muizen afkomstig uit Charles River tijdens de MIA-procedure. Daarentegen had de bron van de poly-IC geen invloed op de effectiviteit van het zlitter.

Bovendien hadden dieren afkomstig van Jackson Labs een krachtigere maternale ontstekingsreactie, gemeten met serum IL-6, vergeleken met dieren afkomstig uit Charles River. Daarentegen was de ontstekingsreactie van de moeder hetzelfde tussen verschillende bronnen van poly-IC. Het protocol maakt het mogelijk om het vroege MIA-model te reproduceerbaar te genereren en de ernst van de moederlijke ontsteking te correleren met experimentele uitkomsten van de nakomelingen. Het is cruciaal om gedetailleerde gegevens bij te houden, lotaantallen reagentia bij te houden en de cytokineresponsen van de moeder in alle dammen te evalueren om reproduceerbare resultaten te garanderen.