Mapping van de morfologie van hepatische stellate cellen in muismodellen van leverfibrose

Dit protocol biedt een uitgebreide beeldvormingspijplijn om de morfologie van leverstellate cellen in intact leverweefsel te visualiseren en te modelleren. De huidige 2D-beeldvorming mist de volledige morfologie van de stellate cellen, wat structurele en functionele inzichten beperkt. Dit protocol maakt robuuste vastleggingen van complexe 3D-architectuur mogelijk.

Om te beginnen knijp je in de handpalmen van een verdoofde muis om een juiste verdoving te garanderen. Spuit de buik in met 70% ethanol om de vacht nat te maken. Met een tang pak je de huid in het midden van de buik, uitgelijnd met de achterpoten, en begin je de huid te snijden om de buik te onthullen.

Gebruik vervolgens wattenstaafjes die met PBS zijn bevochtigd om darmen en andere organen opzij te bewegen en de linker kwab op te tillen. Snijd voorzichtig het membraan door dat tussen de linker kwab en de caudaatkwab zit. Gebruik vervolgens een hechting om de bovenste basis van de linker lob vast te maken.

Knip de linker lob onder de hechtingsknoop en leg deze apart voor het verzamelen en verwerken van weefselmonsters. Gebruik met PBS natgemaakte wattenstaafjes om de lever te bewegen en de portader bloot te leggen. Steek vervolgens voorzichtig de katheternaald in de portaalader ongeveer halverwege de lengte.

Verwijder de katheternaald. Zorg voor een terugstroom van bloed door de katheter om succesvolle plaatsing aan te geven. Verbind de gevulde slang van de lopende perfusiepomp met de katheter en perfusie de lever met 20 milliliter PBS.

Klem de longslagader boven de lever af met een hemostaat om te voorkomen dat de PBS door het hart gaat. Snijd de inferieure vena cava door om de drukopbouw los te laten. Stel de pompsnelheid aan op vijf milliliter per minuut.

Na 15 minuten stop je de pomp om het reservoir te vervangen naar 4% paraformaldehyde en perfuseer je de lever met 25 milliliter 4% paraformaldehyde. Zodra de perfusie voltooid is, verwijder je de lever uit de omliggende organen door de verbindende weefsels te snijden. Plaats de lever in een 50-milliliter kegelvormige buis gevuld met 25 milliliter 4% paraformaldehyde.

Plaats de buis horizontaal op een platform waar je 's nachts op een bank kunt schommelen in een koelkamer bij vier graden Celsius bij 1,5 omwentelingen per minuut. De volgende dag was je de lever drie keer in PBS op een bank-schodelplatform gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur bij 1,5 omwentelingen per minuut. Zet de lever over naar 20 milliliter PBS met 0,02% natriumazide en bewaar bij vier graden Celsius.

Snijd de levermonsters in stukken van ongeveer 0,5 tot 1 kubieke centimeter. Breng de levermonsters over in glazen flesjes met schroefdeksels. Dehydrateer de monsters in een waterverdunde methanolreeks van 20% tot 80% op een wielrotator met acht omwentelingen per minuut gedurende één uur bij kamertemperatuur.

Na het bleken van het monster, permeabilisatie, immunolabeling en clearing, incubeer je het monster een nacht in dibenzylether bij kamertemperatuur voordat de beeldvorming wordt genomen. Monsters kunnen tot een jaar in dibenzylether worden opgeslagen zonder verlies van het kleuringssignaal. Voor confocale beeldvorming plaats je het gezuiverde monster in een schaal met glazen bodem van 35 millimeter en een glazen bodem van 1,5.

Vul het schaaltje met ethylcinnamat om het monster volledig onder te dompelen. Plaats vervolgens de schotel op het podium van de confocale microscoop. Neem een tegelafbeelding op het helderste vlak om een groot gebied van het monster vast te leggen met het 1024 bij 1024 formaat en een snelheid van 600.

Op basis van de tegelafbeelding selecteer je interessegebieden om een Z-scan met hogere resolutie te verzamelen. Vervolgens verkrijg je een Z-stack die de volledige diepte van het verwijderde weefsel beslaat met de hoogste resolutie die door de microscoop wordt ondersteund, in een 1024 bij 1024 formaat en een scansnelheid van 600. Succesvolle perfusie en fixatie van de muizenlever resulteerde in een uniforme bleek, beige gele kleur.

Onjuiste perfusie resulteerde in donkerrode of bruine gebieden van bloedstolsels, wat de optische helderheid verminderde en leidde tot een sterk achtergrondsignaal in deze gebieden. Volledige optische transparantie werd bereikt na incubatie in dibenzylether, waarbij het weefsel helder leek vergeleken met voor het zuiveren. Hoge resolutie Z-stacks onthulden fijne dendritische processen die uitstaken vanuit het cellichaam van individuele hepatische stellate cellen.

Zowel controle- als chronische koolstoftetrachloride-levermonsters vertoonden sterke en stabiele fluorescerende signalen onder confocale microscopie. Deze pijplijn brengt de morfologie van stellate cellen reproduceerbaar in kaart in de complexe server van de microomgeving, waarbij dendritische processen en ruimtelijke relaties met naburige cellen worden vastgelegd. Tijdsinvestering is een belangrijke overweging bij het uitvoeren van het protocol.

Het clearingproces duurt ongeveer drie weken, wat geavanceerde planning vereist. Door nauwkeurige 3D-morfometrische analyse mogelijk te maken, koppelt dit platform fibroblaststructuur aan functies, wat inzicht geeft in weefselhomeostase en een Z-mechanisme.