Isolatie en zuivering van het pancreaseiland door Lewisratten met behulp van enzymatische vertering en dichtheidsgradiëntscheiding
3 april 2026
Dit protocol beschrijft een gestandaardiseerde methode voor chirurgische oogst, enzymatische vertering en dichtheidsgradiëntzuivering van Lewis rat-pancreaseilandjes, waardoor hoogopbrengst- en hoogzuiverheidspreparaten mogelijk zijn voor direct gebruik in transplantatie- of in vitrostudies .
Ons onderzoek richt zich op het ontwikkelen van een gestandaardiseerd Lewis Rat oogletisolatieprotocol met hoge doorvoer om opbrengst, zuiverheid, levensvatbaarheid en functionele levensduur te optimaliseren. Bestaande methoden leveren variabele onzuivere, kortlevende oogjes op. Dit protocol standaardiseert vertering, zuivering en pooling om consistentie en levensduur te verbeteren.
Om te beginnen plaats je een geëuthanaseerde rat onder een microscoop. Maak met een huidschaar een V-vormige incisie, beginnend bij de schaamsynthese richting elke laterale ribbenkast om toegang te krijgen tot de buikholte. Met een platte tang trekt u de dunne en dikke darm naar de linkerkant van het dier om de buikruimte vrij te maken.
Gebruik vervolgens de platte pincet en gebogen hemostaten om het bovenste duodenum uit te vouwen. Zorg ervoor dat de gemeenschappelijke galweg en de hepatische portaalader binnen het gezichtsveld liggen. Gebruik nu de gebogen hemostaten om de lever in de cephalonrichting terug te trekken.
Klem de gemeenschappelijke galweg en levervena één tot twee millimeter van de lever af. Onder de microscoop, met platte tangen en vlakke hemostaten, mobiliseer je voorzichtig de inhoud in de twaalfvingerige darm om de sluitspier van Audi te zuiveren. Klem vervolgens voorzichtig de duodenum ongeveer vijf millimeter van elke kant van de sluitspier van audi af om het omliggende gebied te isoleren.
Zorg voor minimale compressie om de weefselintegriteit te behouden. Steek voorzichtig de naald van een spuit met steriel WDM door de wand van de twaalfvingerige darm. Steek de naald door het sluitspierlichaam en breng deze naar het hoofdkanaal van de alvleesklier voor perfusie.
Bij constante druk perfuseert u zeven tot tien milliliter WDM in de alvleesklier met een snelheid van ongeveer 500 microliter per seconde totdat de alvleesklier volledig is opgezwollen. Verwijder nu beide platte hemostaten uit de twaalfvingerige darm. Vervolgens ontleed en bevrijd voorzichtig de alvleesklier van omliggende structuren, beginnend bij de milt, maag, dikke darm, duodenum en mesentair.
Til voorzichtig de doorbloede alvleesklier op met een platte pincet en gebruik fijne dissectieschaar om eventuele resterende bindweefselaanhechtingen door te snijden. Breng de verwijderde alvleesklier onmiddellijk over in een petrischaaltje met ijskoude spoeloplossing en ga verder met het oogsten van de volgende alvleesklier terwijl de verwijderde alvleesklier wordt gereinigd. Om de alvleesklier te reinigen, gebruik een paar fijn gebogen pincetten en een fijne dissectieschaar om lymfeklieren, vetweefsel, mesentiaire en grote vaaten uit de doorbloedde alvleesklier te verwijderen indien aanwezig.
Overbreng de gereinigde alvleesklier in een steriele beker van 600 milliliter met 25 milliliter koude WDM. Bedek de beker met steriele aluminiumfolie om de netheid te behouden tijdens de overgang van de chirurgische werkruimte naar de celcultuurwerkruimte. Breng de beker over in een orbitale shaker-waterbad dat is ingesteld op 130 omwentelingen per minuut gedurende 10 minuten.
Na vijf minuten draai je de beker handmatig met de klok mee en vervolgens tegen de klok in om de weefseldissociatie te bevorderen. Na 10 minuten verplaats je de beker snel en dompel je hem onder in ijs om de enzymactiviteit te vertragen. Voeg vervolgens een gelijke hoeveelheid afkoelbuffer toe aan de oplossing in de beker om de vertering te stoppen.
Met een 50 milliliter spuit met een 14 gauge spinale naald aspireert en verdrijft u de weefselsuspensie herhaaldelijk om grote weefselfragmenten te dissociëren. Breng de vering over in 200 milliliter conische buizen. Na het centrifugeren van de suspensie, giet je voorzichtig het supernatant over en suspendeer je de pellet opnieuw in 100 milliliter wasmedium.
Filter nu de suspensie door een steriele zeef van 500 micrometer die over een steriele beker van 600 milliliter wordt geplaatst om groot onverteerd weefsel te verwijderen. Breng het filtraat over in nieuwe 200 milliliter conische buizen voordat je opnieuw centrifugeert. Voor oogjeszuivering gebruik je een vooraf gekoppelde 10 milliliter serologische pipet om elke weefselpellet opnieuw te suspenderen in 15 milliliter gradiëntoplossing per twee milliliter pelletvolume.
Meng voorzichtig tot de suspensie uniform is. Doseer voorzichtig 15 milliliter van de celsuspensie in de bodem van elke 50 milliliter conische buis, waarbij contact met de buiswanden wordt voorkomen om schone gradiënten te garanderen. Gebruik vervolgens een spuitpomp om 10 milliliter van elke gradiënt af te geven met een snelheid van vijf milliliter per minuut, terwijl je de 16 gauge naaldpunt tegen de binnenwand van de buis plaatst om mengen te voorkomen.
Na het centrifugeren van de buizen identificeer je de ooglaag die zich bevindt op de grensvlakken tussen de gradiëntlagen. Met een gekoppelde voor-pipet, verzamel je de oogjeslaag en breng je de verzamelde oogjes over in een voorgekoelde 200 milliliter conische buis met vijf milliliter wasmedium. Verhoog het volume tot 200 milliliter met wasmedium en voer de volgende was- en centrifugatiestappen uit.
Daarna wordt de oogjes gelijkmatig gedekt in niet-weefselkweekbehandelde 100 millimeter petrischaaltjes met één bord per vijf verwerkte alvleesklieren. Over de testisolatie heen was de opbrengst 3.330 oogjesequivalenten per alvleesklier met een mediane oogdiameter in de 50 tot 100 micrometer kamer. Geautomatiseerde dimensionering leverde 98.832 objecten op, wat sterk correleerde met handmatige ooglidequivalenten gemeten op dag nul.
De endocriene zuiverheid was ongeveer 98,56% op basis van dithozonkleuring op dag één. De stimulatie-indices waren 9,37 op dag één, 8,34 op dag drie en 6,7 op dag zeven, zonder significante verschillen tussen tijdstippen. Deze methode maakt het mogelijk om oogjestransplantatie, bètacelfunctie, diabetesomkering, oogjesinkapseling en interacties tussen oogjes en interacties tussen oogjes en micro-omgevingen te bestuderen.
Dit protocol kan toepasbaar zijn op preklinische transplantatie, diabetesmodellering, encapsulatiestudies en invitro functionele assays die hoge zuiverheid van Lewis Rat oogjes vereisen.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een gestandaardiseerd high-throughput protocol voor het isoleren van pancreaseilandjes uit Lewis-ratten, ontworpen om de opbrengst, zuiverheid, levensvatbaarheid en functionele levensduur te maximaliseren. De methode integreert chirurgische winning, enzymatische digestie en zuivering via dichtheidsgradiënt, waardoor de efficiënte preparatie van hoogwaardige eilandjes mogelijk wordt die geschikt zijn voor zowel preklinisch diabetesonderzoek als transplantatiestudies.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Islet-biologie
- Diabetesonderzoek
- Transplantatiewetenschap
- Celisolatietechnieken
Achtergrond
- Alvleeskliereilandjes zijn cruciaal voor diabetesonderzoek en transplantatie.
- Bestaande isolatiemethoden leveren vaak variabele, onzuivere en kortlevende eilandjes op.
- Opkomende therapieën vereisen grotere, zuivere en meer gestandaardiseerde eilandjespreparaten.
- Standaardisatie is nodig om de reproduceerbaarheid en functionele uitkomsten te verbeteren.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een reproduceerbaar high-throughput protocol voor het isoleren van levensvatbare pancreaseilandjes met een hoge zuiverheid uit Lewis-ratten.
- Het optimaliseren van de opbrengst en de functionele levensduur van de eilandjes voor onderzoek en transplantatie.
- Het minimaliseren van handmatige handelingen en variabiliteit bij de preparatie van eilandjes.
Gebruikte methoden
- Chirurgische blootstelling en perfusie van de pancreas via de ductus pancreaticus hoofdgang met behulp van een steriele buffer.
- Enzymatische digestie in een orbitale schudwattenbad, gevolgd door quenching en mechanische dissociatie.
- Filtratie en dichtheidsgradiëntcentrifugatie voor de zuivering van eilandjes.
- Kwantificering met behulp van zowel handmatige telling op basis van aliquoten als semi-geautomatiseerde beeldvorming van de volledige preparatie.
- Beoordeling van de zuiverheid via dithizonkleuring en van de viabiliteit/functie via assays voor glucose-gestimuleerde insulinesecretie.
Belangrijkste resultaten
- Handmatige telling leverde ongeveer 3.300 islet-equivalenten (IEQ) en 2.700 absolute eilandjes per pancreas op (~39.600 totale IEQ uit 12 pancreases).
- Geautomatiseerde analyse rapporteerde 16.350 totale IEQ (1.362 IEQ/pancreas), wat de variabiliteit in kwantificering benadrukt.
- Grootteverdeling van de eilandjes: 62% (50-100 μm), 17% (100-150 μm), 10% (150-200 μm), 5% (200-250 μm), 6% (>250 μm).
- De zuiverheid was ongeveer 98% via dithizon-kleuring; de levensvatbaarheid bleef in vitro 98% op dag 3 en 7.
- Functionele beoordeling toonde een 9- tot 10-voudige toename in insulinesecretie bij glucosestimulatie, die gedurende 7 dagen werd gehandhaafd.
Conclusies
- Dit protocol maakt een efficiënte, reproduceerbare isolatie mogelijk van hoogzuivere, levensvatbare en functioneel robuuste eilandjes van Langerhans uit Lewis-ratten.
- De eilandjes blijven tot zeven dagen na isolatie geschikt voor in vitro-assays en in vivo-transplantatie.
- De methode ondersteunt grootschalige studies in diabetesmodellering, transplantatie, inkapseling en eilandjesbiologie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Gestandaardiseerde, high-throughput isolatie van pancreaseilanden uit Lewis-ratten pakt een kritiek knelpunt aan in diabetesonderzoek en preklinische transplantatiestudies. Dit protocol levert reproduceerbare, hoogzuivere en functioneel robuuste eilandpreparaten, wat schaalbare in vitro en in vivo workflows ondersteunt. Een betrouwbare levering van eilandjes verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid en maakt risico-gecorrigeerde vooruitgang mogelijk in vroege discovery- en translationele onderzoekspijplijnen.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt onderzoek naar de functie van bètacellen en diabetesmechanismen mogelijk in gecontroleerde, ziekterelevante systemen.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door consistente, hoogzuivere eilandjes te leveren voor mechanistische studies.
- Faciliteert functionele targetvalidatie via robuuste assays voor glucosegestimuleerde insulinesecretie.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Levert gestandaardiseerde eilandjes-preparaten voor reproduceerbare compound-screening en assay-ontwikkeling.
- Vermindert handmatige variabiliteit, wat kwantitatieve en schaalbare assay-outputs ondersteunt.
- Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream high-throughput screening-platforms.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Maakt preklinische transplantatie en diabetesmodellering mogelijk met functioneel intacte eilandjes.
- Ondersteunt de continuïteit van in vitro functionele assays naar in vivo werkzaamheidsstudies.
- Sluit aan bij translationele biomarkerstrategieën door de levensvatbaarheid en functie van de eilandjes in de loop van de tijd te behouden.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit protocol is geïntegreerd in het continuüm van ontdekking tot prekliniek en biedt een basis voor leadidentificatie, mechanistische risicovermindering en translationele validatie in diabetesonderzoek.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verhelderen van signaalpaden met behulp van hoogwaardige eilandjes.
- Screening: Maakt reproduceerbare, kwantitatieve read-outs mogelijk voor de evaluatie van verbindingen en assay-standaardisatie.
- Analytics: Biedt zowel handmatige als semi-geautomatiseerde kwantificeringsmethoden voor een robuuste gegevensvergelijking.
- Translationeel Onderzoek: Behoudt de functie en levensvatbaarheid van eilandjes voor preklinische transplantatie en biomarker-afstemming.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een schaalbare, herbruikbare workflow voor doorlopende studies naar diabetes en eilandjesbiologie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in diabetesmodellen.
- Operationele waarde: Standaardiseert de isolatie van eilandjes, waardoor de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid over studies heen worden verbeterd.
- Strategische waarde: Maakt betere go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie mogelijk door betrouwbare biologische input te garanderen.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en de voortgang van diabetesonderzoeksprogramma's.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in chirurgische technieken en enzymatische weefselverwerking.
- Toegang tot gespecialiseerde instrumentatie voor perfusie, gradiëntscheiding en op beeldvorming gebaseerde kwantificering is noodzakelijk.
- Standaardisatie tussen teams is vereist om reproduceerbaarheid en vergelijkbaarheid van gegevens te waarborgen.
- Aanpassing aan andere knaagdierstammen kan protocoloptimalisatie en validatie vereisen.
- Variabiliteit in opbrengst en kwantificering tussen handmatige en geautomatiseerde methoden moet worden meegewogen in de experimentele planning.
