Protocol voor single-cel dissociatie, RNA-sequencing en isolatie van myoepitheelcellen en fibroblasten uit de verouderde klieren van het klieren van het lakcrimale en speeksel.

Mijn laboratorium bestudeert hoe leeftijdsgebonden veranderingen in speeksel- en traanklieren verschillende celtypen beïnvloeden met behulp van flowcytometrie en single-cell RNA-sequencing. Standaard dissociatiemethoden halen fragiele epitheelcellen slecht terug uit verouderde speeksel- en traanklieren. En mijn protocol verbetert de levensvatbaarheid van cellen en maakt betrouwbare single-cell analyse en celsortering mogelijk.

Begin met het plaatsen van de geëuthanaseerde muis op rugligging op de dissectietafel. Met fijne pincet en schaar snijd je de huid tussen oog en oor in. Trek de huid voorzichtig terug om de traanklier bloot te leggen.

Met een doffe pincet tilt je de traanklier iets op. Scheid voorzichtig het omliggende bindweefsel door het voorzichtig in een cirkelvormige beweging weg te trekken. Identificeer de zichtbare grenzen van de traanklier en scheid deze van aangrenzende weefsels, waaronder de parotisklier.

Vervolgens doe je de traanklier over in een 35-millimeter petrischaal met twee milliliter koude PBS op ijs. Verwijder onder een dissectiemicroscoop het resterende vet en verwijder voorzichtig de bindweefselcapsule uit de traanklier. Zet een steriele 35-millimeter petrischaal op ijs.

Voeg 800 tot 1000 microliter koude PBS toe aan het midden van de schaal en breng één traanklier over in de PBS. Zorg ervoor dat het weefsel onder PBS blijft. Met twee steriele scalpels fijnhakken we de traanklier fijn in kleine stukjes totdat deze een zachte, pastaachtige consistentie krijgt.

Verzamel de weefselfragmenten aan één kant van de schaal. Aspireer het resterende PBS en was de fragmenten met één milliliter verse koude PBS. Breng de gewassen weefselfragmenten over in een plaat met 12 putjes die per put twee milliliter voorverwarmd verteringsmedium bevat.

Plaats het bord in een schudbad en bebroed het op 37 graden Celsius en 60 omwentelingen per minuut gedurende 30 minuten. Gebruik een breed, één milliliter pipettip om het weefsel voorzichtig 15 keer te tritureren. Zet het bord terug in het schudbad en laat het nog eens 30 minuten incuberen.

Vervolgens tritureert u met een gewone pipettip van één milliliter het monster voorzichtig 10 keer en laat het opnieuw 30 minuten incuberen. Tritureer het monster vervolgens voorzichtig 10 keer en breng de celsuspensie over in twee milliliter dolfijnmicrocentrifugebuizen. Voeg één milliliter koud blokkerend medium 1, of BM1, toe aan elke put van de plaat om het resterende verteringsmedium met resterende cellen op te vangen en de plaat op ijs te leggen tot de volgende stap.

Centrifugeer de buizen met de celsuspensie op 300 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Gooi het supernatant uit elke buis. Breng de BM1 van elke put van de plaat met resterende cellen over in de overeenkomstige buis.

Voeg vervolgens 600 microliter koud BM1 toe aan elke put om de resterende cellen te spoelen en de wash over te brengen in de bijbehorende buis om te combineren met de celsuspensie. Suspenseer de cel voorzichtig weer. Centrifugeer de buizen opnieuw op 300 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en gooi het supernatant weg.

Voeg één milliliter Accutase toe aan de celpellets en laat de cellen voorzichtig opnieuw ophangen. Incubeer de buis op 37 graden Celsius en 60 omwentelingen per minuut gedurende vijf tot tien minuten. Gebruik een pipettip van één milliliter en tritureer het monster voorzichtig 10 keer.

Voeg vervolgens één milliliter koud BM2 toe aan de buis om de enzymatische reactie te beëindigen door de Accutase te verdunnen. Centrifugeer de buis op 300 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en gooi het supernatant weg. Voeg medium met DNase 1 in een concentratie van 200 eenheden per milliliter toe aan de buis om de cellen opnieuw te laten suspenseren en de buis tot aan de bovenkant te vullen.

Incubeer de buis 10 minuten op kamertemperatuur en laat hem na vijf minuten voorzichtig opnieuw ophangen. Plaats ondertussen een 70-micrometer celfilter over een 15-milliliter conische buis en maak de zeef vooraf nat met één milliliter BM3. Na de incubatie breng je de celsuspensie over op de zef.

Voeg één milliliter BM3 toe aan de originele verzamelbuis om deze af te spoelen en spoel de spoeling over op dezelfde zef. Was de zeef met nog eens vijf milliliter BM3. Bepaal ten slotte de celconcentratie en levensvatbaarheid van de gefilterde celsuspensie met behulp van trypanblauwe kleuring en een geautomatiseerde celteller.

Ga verder met downstream toepassingen, zoals single-cell RNA-sequencing voor genexpressieprofilering, of flowcytometrie-gebaseerde celsortering van fluorescentie-gelabelde celpopulaties. UMAP-analyse van single-cell RNA-sequencinggegevens identificeerde goed vertegenwoordigde epitheliale en stromale populaties in de tranenklier, waaronder myoepitheelcellen en fibroblasten, evenals diverse populaties van immuuncellen. Verouderde traanklieren bevatten overvloedig plasma en geactiveerde B-cellen die IGHM en IGHD tot expressie brengen.

Sequentiële flowcytometrie-gating maakte een duidelijke scheiding mogelijk van EpCAM-positieve, GFP-positieve myoepitheelcellen van EpCAM-negatieve, GFP-positieve muurcellen. GFP-positieve fibroblasten die PDGFR alfa expressief uitdrukken, waren EpCAM-negatief, waardoor onderscheiding van epitheelcellen mogelijk was. Bij PDGFR alfa, EGFP-muizen, drukten alle GFP-positieve cellen ook collageen één uit, wat de identiteit van fibroblasten bevestigde.

Flowcytometrie-analyse toonde aan dat 99,6% van de GFP-positieve cellen correspondeerde met PDGFR alfa-immunogekleurde cellen. Dit protocol is ontworpen om levensvatbare individuele cellen uit traanklieren te isoleren voor moleculaire karakterisering van epitheel-, stromale en immuunpopulaties. De grootste uitdaging is het minimaliseren van mechanische en enzymatische stress tijdens de dissociatie van fragiel verouderd weefsel, terwijl tegelijkertijd een hoge cellevensvatbaarheid voor single-cell RNA-sequencing behouden blijft.

Na deze procedure kunnen geïsoleerde cellen worden gebruikt voor single-cell RNA-sequencing, bulk RNA-sequencing en moleculaire profilering van specifieke celpopulaties. Gesorteerde cellen kunnen ook worden gekweekt voor latere functionele assays.