Name: Evaluatie van 3D-sferoïden voor AAV-transductiestudies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-14T13:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Leer een 3D-sferoïdenplatform evalueren voor AAV-transductiepotentie en transgenexpressiekinetiek. Deze methode ondersteunt kwantitatieve, real-time beoordeling van vectorprestaties voor gentherapieontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs danken Morten Seirup en Trish Hoang voor het verstrekken van het plasmide voor de productie van AAV nanoluciferase en de reagentia voor het levende substraat. Dit project werd ondersteund door een aanstelling bij het ORISE Research Participation Program bij het CBER, U.S. Food and Drug Administration, beheerd door het Oak Ridge Institute for Science and Education onder een interagentschapovereenkomst tussen het Amerikaanse Ministerie van Energie en de FDA.

<ol>
	<li>Mendell JR, et al. Current Clinical Applications of In Vivo Gene Therapy with AAVs. Mol Ther. 2021;29(2):464-88.</li>
	<li>Byrne BJ, et al. Current clinical applications of AAV-mediated gene therapy. Mol Ther. 2025;33(6):2479-516.</li>
	<li>Najera SS, et al. AAV2 delivery of the saCas9 gene results in presentation of an HLA-A*02:01-restricted T cell epitope potent to induce T cell cytotoxicity. Mol Ther Methods Clin Dev. 2025;33(3):101506.</li>
	<li>Alhakamy NA, Curiel DT, Berkland CJ. The era of gene therapy: From preclinical development to clinical application. Drug Discov Today. 2021;26(7):1602-19.</li>
	<li>Arutyunyan IV, et al. Gene Expression Profile of 3D Spheroids in Comparison with 2D Cell Cultures and Tissue Strains of Diffuse High-Grade Gliomas. Bull Exp Biol Med. 2023;175(4):576-84.</li>
	<li>Cashen P, Manser B. Quality by design (QbD) for adeno-associated virus (AAV): A framework for a QbD assessment for AAV products within the chemistry manufacturing and controls (CMC) documentation [Internet]. Port Washington (NY): Pall Corporation; 2021. Available from: https://www.pall.com/.</li>
	<li>Center for Biologics Evaluation and Research. Potency Assurance for Cellular and Gene Therapy Products: Draft Guidance for Industry [Internet]. Silver Spring (MD): U.S. Food and Drug Administration; 2023. Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/potency-assurance-cellular-and-gene-therapy-products.</li>
	<li>Fu Q, Polanco A, Lee YS, Yoon S. Critical challenges and advances in recombinant adeno-associated virus (rAAV) biomanufacturing. Biotechnol Bioeng. 2023;120(9):2601-21.</li>
	<li>Martinez RA, et al. A versatile cell line for establishing potency of cell type-specific AAV transgenes. Mol Ther Methods Clin Dev. 2025;33(1):101401.</li>
	<li>Zengel J, et al. Development of cell lines with increased susceptibility to diverse adeno-associated viral vectors to enable in vitro potency assays. Mol Ther Methods Clin Dev. 2025;33(1):101416.</li>
	<li>Marconi GD, et al. Three-Dimensional Culture System: A New Frontier in Cancer Research, Drug Discovery, and Stem Cell-Based Therapy. Biology (Basel). 2025;14(7):875.</li>
	<li>Bialkowska K, Komorowski P, Bryszewska M, Milowska K. Spheroids as a Type of Three-Dimensional Cell Cultures-Examples of Methods of Preparation and the Most Important Application. Int J Mol Sci. 2020;21(17):6225.</li>
	<li>Ducker M, Millar V, Ebner D, Szele FG. A Semi-automated and Scalable 3D Spheroid Assay to Study Neuroblast Migration. Stem Cell Reports. 2020;15(3):789-802.</li>
	<li>Hiller T, et al. Generation of a 3D Liver Model Comprising Human Extracellular Matrix in an Alginate/Gelatin-Based Bioink by Extrusion Bioprinting for Infection and Transduction Studies. Int J Mol Sci. 2018;19(10):3129.</li>
	<li>Jakeman PG, et al. Improved in vitro human tumor models for cancer gene therapy. Hum Gene Ther. 2015;26(5):249-56.</li>
	<li>Kapalczynska M, et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Arch Med Sci. 2018;14(4):910-9.</li>
	<li>Gunti S, Hoke ATK, Vu KP, London NR Jr. Organoid and Spheroid Tumor Models: Techniques and Applications. Cancers (Basel). 2021;13(4):874.</li>
	<li>McRobb LS, Lee VS, Faqihi F, Stoodley MA. A Simple Model to Study Mosaic Gene Expression in 3D Endothelial Spheroids. J Cardiovasc Dev Dis. 2024;11(10):305.</li>
	<li>Ohguro H, et al. 3D Spheroid Configurations Are Possible Indicators for Evaluating the Pathophysiology of Melanoma Cell Lines. Cells. 2023;12(5):759.</li>
	<li>Casey G, et al. Self-complementarity in adeno-associated virus enhances transduction and gene expression in mouse cochlear tissues. PLoS One. 2020;15(11):e0242599.</li>
	<li>Hutt JA, et al. Scientific and Regulatory Policy Committee Points to Consider: Nonclinical Research and Development of In Vivo Gene Therapy Products, Emphasizing Adeno-Associated Virus Vectors. Toxicol Pathol. 2022;50(1):118-46.</li>
	<li>El Harane S, et al. Cancer Spheroids and Organoids as Novel Tools for Research and Therapy: State of the Art and Challenges to Guide Precision Medicine. Cells. 2023;12(7):1001.</li>
	<li>Najera SS, et al. Targeting NAD+ Metabolism Vulnerability in FH-Deficient Hereditary Leiomyomatosis and Renal Cell Carcinoma with the Novel NAMPT Inhibitor OT-82. Mol Cancer Ther. 2025;24(2):200-13.</li>
	<li>Huang HL, et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J Biomed Sci. 2010;17(1):36.</li>
	<li>Ripa I, Andreu S, Lopez-Guerrero JA, Bello-Morales R. Membrane Rafts: Portals for Viral Entry. Front Microbiol. 2021;12:631274.</li>
	<li>Habanjar O, Diab-Assaf M, Caldefie-Chezet F, Delort L. 3D Cell Culture Systems: Tumor Application, Advantages, and Disadvantages. Int J Mol Sci. 2021;22(22):12200.</li>
	<li>Kaiser VM, Gonzalez-Cordero A. Organoids - the future of pre-clinical development of AAV gene therapy for CNS disorders. Gene Ther. 2025;Mar 27. Epub ahead of print. PMID: 40148593.</li>
	<li>Ramamurthy RM, Atala A, Porada CD, Almeida-Porada G. Organoids and microphysiological systems: Promising models for accelerating AAV gene therapy studies. Front Immunol. 2022;13:1011143.</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te melden.

Wij presenteren hier een gestroomlijnd in vitro&#160;3D-platform voor de ontwikkeling en potentietest van AAV. Dit platform maakt gebruik van verbeterde transductie, een hoge sensitiviteit en een betere translationele voorspelbaarheid door gebruik te maken van driedimensionale celkweek die nauwer aansluit bij de architectuur van menselijk weefsel. Dit systeem maakt succesvol onderscheid in transductie-efficiëntie tussen AAV-serotypes en regulatoire elementen, inclusief enkelstrengs en zelf-complementaire vectoren, in meerdere cellijnen. Wij merken op dat, in tegenstelling tot conventionele 2D-assays, waarbij transductie-efficiëntie vaak wordt gedefinieerd als het percentage transgene-positieve cellen, het 3D-sferoïdensysteem geen kwantificering met enkelcelresolutie toelaat. Daarom wordt de transductie-efficiëntie in deze studie gedefinieerd als de bulk-reportersignaalintensiteit (fluorescent of luminescent), wat de gecombineerde bijdragen weerspiegelt van het aandeel getransduceerde cellen en het niveau van transgene expressie per cel. De hoge sensitiviteit van de sferoïden vermindert de behoefte aan grote producthoeveelheden aanzienlijk, waardoor het kosteneffectief, veelzijdig en fysiologisch relevant is voor AAV-onderzoek en -ontwikkeling.
Deze benadering pakt belangrijke uitdagingen aan van traditionele 2D-celkweekassays, die afhankelijk zijn van adhesie aan kunstmatige oppervlakken en een gebrek aan cellulaire organisatie vertonen, wat mogelijk&#160;leidt tot onnauwkeurige voorspellingen van de vectorprestaties in klinische settings. Het 3D-sferoïdensysteem bootst de weefselstructuur en drugdistributiepatronen beter na, waardoor gegevens over het vectorgedrag worden verkregen die nauwer aansluiten bij werkelijke biologische omstandigheden22,23. Het protocol maakt gebruik van eenvoudige ultra-low attachment platen, waardoor het gemakkelijk reproduceerbaar is in standaard laboratoriumomgevingen.
Dit aanpasbare systeem kan worden gebruikt voor AAV-neutralisatieassays, om AAV-penetratie te bestuderen en om complexere co-culturexperimenten te ontwikkelen om de effecten van verschillende cellulaire omgevingen op AAV-transductie te onderzoeken. Daarnaast kunnen high-throughput drug- en vectorscreeningsplatforms eenvoudig worden geïntegreerd met het sferoïdenplatform, wat automatisering en kostenreductie mogelijk maakt in workflows voor vectorontdekking voor de ontwikkeling van meer gerichte producten.
Een groot praktisch voordeel van sferoïden is hun vermogen om wekenlang continu te groeien zonder dat celpassage nodig is, wat uitgebreide studies naar AAV-activiteit mogelijk maakt. Dit stabiele cultuursysteem behoudt belangrijke cel-celinteracties en matrixcomponenten, waardoor de onderbrekingen die worden veroorzaakt door de herhaalde celwinning die bij 2D-culturen vereist is, worden voorkomen24. De behouden cellulaire omgeving ondersteunt de natuurlijke eiwitorganisatie en membraanstructuren die essentieel zijn voor het evalueren van de AAV-binding en de entry in cellen25.
Hoewel 3D-sferoïden een groot potentieel vertonen voor het beoordelen van AAV-transductie, presenteren ze ook enkele translationele tekortkomingen vergeleken met in vivo&#160;modellen, primair vanwege hun vereenvoudigde structuur ten opzichte van natuurlijke weefsels. Sferoïden missen kritische fysiologische componenten, waaronder vasculatuur voor de aflevering van vectoren, immuuncellen voor het beoordelen van immunogeniciteit en weefselspecifieke barrières zoals de bloed-hersenbarrière, die de AAV-prestaties aanzienlijk kunnen beïnvloeden26. Deze beperkingen geven aan dat sferoïden, ondanks het feit dat ze een tussenliggend complexiteitsniveau bieden tussen conventionele 2D-culturen en in vivo diermodellen, onvoldoende blijven om de fysiologische micro-omgeving die nodig is voor een uitgebreide AAV-beoordeling volledig te recapituleren.
Het hier gepresenteerde spheroid-protocol beschrijft telkens één enkel celtype. Dit protocol kan worden uitgebreid om 2–3 aanvullende celtypen te bevatten die aggregeren tot een basis driedimensionale structuur. Complexere 3D-modellen, zoals organoïden of microfluidica, zijn multicellulaire systemen die de cellulaire diversiteit en organisatie van specifieke organen nabootsen, met 10 of meer verschillende celtypen die zijn gerangschikt in weefselachtige patronen. Dergelijke geavanceerde 3D-organoïden kunnen meerdere cellen bevatten27, hydrogel-ingebedde culturen, hanging drop-technieken en microfluidische platforms11,27,28. Hoewel deze methoden een complexere weefselarchitectuur bieden die ons begrip van de AAV-biologie verder zou kunnen bevorderen, vereisen ze doorgaans gespecialiseerdere reagentia, apparatuur en aanzienlijke technische expertise. Aan de andere kant zijn 3D-spheroiden gevormd in ultra-low attachment plates aanzienlijk eenvoudiger en geschikt voor veel laboratoria vanwege hun kosteneffectiviteit en reproduceerbaarheid.
Kritieke stappen voor een succesvolle uitvoering van dit protocol zijn onder meer het handhaven van een hoge celviabiliteit, aangezien beschadigde cellen de sferoïdvorming en de transductie-efficiëntie kunnen belemmeren. Het gebruik van ultra-low attachment plates en de optimalisatie van de centrifugatie zijn eveneens cruciaal voor het bereiken van een compacte sferoïde. Het optimaliseren van de MOI voor elk celtype en AAV-serotype is essentieel om zwakke signalen of verzadiging te voorkomen. De selectie van de juiste detectiemethode is ook van groot belang, met name voor kinetische analyses, waarbij compatibiliteit met systemen voor continue live-cell imaging vereist is. Diverse technische overwegingen zijn belangrijk voor een nauwkeurige interpretatie van de AAV-transductie in 3D-sferoïden.
Een zwak of afwezig transductiesignaal kan het gevolg zijn van een lage virale titer, een suboptimale MOI of een onvoldoende incubatietijd; dit kan worden opgelost door virale titers te verifiëren, de MOI te optimaliseren en de incubatietijd te verlengen (doorgaans 3–5 dagen). Zwakke fluorescentie- of luminescentiesignalen kunnen wijzen op een lage expressie van het transgen of beperkte penetratie van reagentia binnen de 3D-structuur, wat kan worden verbeterd door de belichtingsinstellingen te optimaliseren of door extra tijd toe te staan voor substraatdiffusie. Een belangrijke uitdaging bij bepaalde cellijnen, zoals HeLa-cellen, is autofluorescentie, wat kan leiden tot een hoog achtergrondsignaal en een verminderde gevoeligheid bij fluorescentie-gebaseerde assays. Om deze beperking aan te pakken, hebben we een op luminescentie gebaseerd nanoluciferase-reporter-systeem geïmplementeerd, dat een verbeterde signaal-ruisverhouding biedt en een nauwkeuriger detectie van transductie in autofluorescerende achtergronden mogelijk maakt. Daarnaast kan het achtergrondsignaal ontstaan door onjuiste drempelwaardebepaling of media-gerelateerde fluorescentie en dient dit te worden gecontroleerd met onbehandelde wells (MOI = 0) om de basiswaarden te definiëren. Tot slot kan signaalverzadiging bij hoge MOI's optreden door een overmatige virale input of detectorbeperkingen; dit kan worden beperkt door het MOI-bereik te verkleinen en de belichtingsinstellingen van de detector te optimaliseren om metingen binnen het lineaire dynamische bereik te houden.
Over het algemeen biedt deze 3D-sferoïdenmethode een gestroomlijnd, reproduceerbaar systeem voor het evalueren van AAV-transductie, potentie en kinetiek. Door de kloof tussen conventionele 2D-assays en in vivo-studies te overbruggen, maakt dit een meer geïnformeerde vectorontwikkeling mogelijk en ondersteunt het de vooruitgang van klinisch relevante gentherapiestrategieën.

AAV-vectoren zijn een van de geprefereerde systemen voor genoverdracht geworden voor in vivo toepassingen vanwege hun veiligheidsprofiel en het vermogen om persistente genexpressie te bereiken1. AAV-gentherapie blijkt succesvol bij de behandeling van meerdere zeldzame ziekte-indicaties, met honderden producten in de ontwikkelingspijplijn2. Bovendien omvatten opkomende toepassingen de in vivo levering van componenten voor genoomredigering zoals Cas9, wat een groot potentieel heeft om te helpen bij de behandeling van moeilijk behandelbare indicaties3. Belangrijke ontwikkelingsuitdagingen zijn onder meer de hoge productiekosten en de beperkte voorspellende capaciteit van huidige in vitro assays voor het bepalen van de productkwaliteit en klinische effectiviteit4.
De vooruitgang van AAV-therapeutica wordt fundamenteel beperkt door het gebrek aan voorspellende, gestandaardiseerde activiteitsassays die de klinische prestaties nauwkeurig kunnen voorspellen4,5. Deze assays zijn een cruciaal onderdeel van de ontwikkelingspijplijn, aangezien ze voor meerdere doeleinden worden gebruikt, waaronder het screenen van bibliotheken met engineered vectoren, het optimaliseren van capsid-modificaties voor verbeterde targeting en het evalueren van weefselspecifiek tropisme. Ze dienen daarnaast om de invloed van regulatoire sequenties op de expressie van het transgen te karakteriseren6. Naast de selectie van kandidaten ondersteunen AAV-transductieassays ook de cruciale kwaliteitscontrole bij de productie via potentie-assays die worden gebruikt voor lot-vrijgave, lot-vergelijkbaarheidsstudies en stabiliteitsbeoordelingen6,7.
De wetenschappelijke uitdaging ligt in het ontwikkelen van assays die de complexiteit van vector-gastheerinteracties vastleggen, terwijl de praktische haalbaarheid voor routinematig gebruik behouden blijft7,8. Huidige benaderingen omvatten het gebruik van geïmmortaliseerde cellijnen die het doelorgaan representeren in traditionele 2D-monolaagculturen. Deze kweekcondities missen fysiologische relevantie en vereisen hoge doses geneesmiddelen. Dit creëert een aanzienlijke kloof tussen laboratoriumvoorspellingen en klinische translatie. Nieuwe genetisch gemodificeerde cellijnen, zoals AAVR-overexpresserende of CRISPR-geactiveerde systemen, vormen belangrijke vorderingen, maar slagen er niet in de driedimensionale architectuur en interacties van de extracellulaire matrix te recapituleren die kenmerkend zijn voor natuurlijke weefsels9,10,11. Modellen van de volgende generatie die in vivo micro-omgevingen beter simuleren, zouden deze translationele kloof kunnen overbruggen12,13,14.
Onlangs hebben we een 3D-sferoïdensysteem ontwikkeld dat is geoptimaliseerd voor AAV-transductie om de transleerbaarheid van AAV-transductie-assays te verbeteren. Dit systeem verhoogt de AAV-transductie-efficiëntie aanzienlijk over meerdere cellijnen en AAV-serotypes vergeleken met de gouden standaard van 2D-assays. Naast de verbeterde gevoeligheid en het behoud van het in de assay gebruikte product, verbeteren deze modellen de 2D-monolagen door realistische cel-celinteracties te bieden die variëren afhankelijk van de cellulaire locatie binnen de sferoïden. Ze maken daarnaast een betekenisvol onderzoek mogelijk naar drugpenetratie die werkelijke organomstandigheden simuleert11,15,16. Bovendien biedt deze sferoïdenaanpak praktische voordelen ten opzichte van complexere organoïde- of co-culturesystemen, aangezien er standaard laboratoriumapparatuur wordt gebruikt en gespecialiseerde medium- of steigervereisten worden vermeden. Deze eenvoud waarborgt de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid, waardoor het systeem zeer geschikt is voor routinematige gentherapietests en workflows voor vectorontwikkeling17.
Dit 3D-sferoïdeplatform is bijzonder goed geschikt voor toepassingen waarbij een gevoelige detectie van AAV-transductie bij lage doses en een vergelijkende evaluatie van vectorgenoomontwerpen vereist zijn. Het ondersteunt daarnaast de beoordeling van serotype-afhankelijk tropisme. Het is vooral voordelig voor cellijnen met een relatief lage transductie-efficiëntie waarvoor hoge AAV-doses nodig zijn in conventionele 2D-culturen. In deze contexten zijn de verhoogde gevoeligheid en de verbeterde fysiologische relevantie van het 3D-platform essentieel. Echter kan dit systeem minder geschikt zijn voor studies waarbij immuuncomponenten, vasculaire toediening of volledige weefselcomplexiteit vereist zijn. Dit komt omdat sferoïden de in vivo&#160;omgeving niet volledig nabootsen.
Hier presenteren wij een rechtvooruit 3D-sferoïdprotocol dat is geoptimaliseerd voor AAV-transductie-assays, met twee kritische en complementaire read-outs: transductie-efficiëntie (hier gedefinieerd als het totale reportersignaal per sferoïd) en transductiekinetiek. Deze methode biedt een kosteneffectief, fysiologisch relevant en informatief platform voor de evaluatie van AAV-potentie, vectorontwerp en neutralisatie-assays.

<table><tbody><tr><td>37°C incubator</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#51025983</td><td>Standaard kweekcondities</td></tr><tr><td>A375-cellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-1619</td><td>Cellijn</td></tr><tr><td>AAV1-plasmide</td><td>Addgene</td><td>112862</td><td>AAV-plasmide</td></tr><tr><td>AAV2-plasmide</td><td>Addgene</td><td>104963</td><td>AAV-plasmide</td></tr><tr><td>AAV5-plasmide</td><td>Addgene</td><td>104964</td><td>AAV-plasmide</td></tr><tr><td>AAV8-plasmide</td><td>Addgene</td><td>112864</td><td>AAV-plasmide</td></tr><tr><td>AAV9-plasmide</td><td>Addgene</td><td>112865</td><td>AAV-plasmide</td></tr><tr><td>BioTek GEN5 plate reader</td><td>Agilent Technologies</td><td>NA</td><td>End-point meting voor fluorescentie of luminescentie</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#TSO-MX1R</td><td>Behouden van sferoïde-suspensie</td></tr><tr><td>Corning&amp;trade; Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1X)</td><td>Fisher Scientific</td><td>#MT21040CMX</td><td>PBS om cellen te spoelen</td></tr><tr><td>DMEM high glucose, GlutaMAX supplement, pyruvaat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#10569010</td><td>Compleet groeimedium</td></tr><tr><td>Extracellulaire NanoLuc-inhibitor&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>N235B</td><td>Onderdrukt elk Nanoluc&amp;reg;-signaal afkomstig uit de extracellulaire omgeving&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Foetaal kalfsserum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#F4135-500mL</td><td>Levert groeifactoren</td></tr><tr><td>HEK293T-cellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>Cellijn</td></tr><tr><td>HeLa-cellen</td><td>ATCC</td><td>CRM-CCL-2</td><td>Cellijn</td></tr><tr><td>HEP3B-cellen</td><td>ATCC</td><td>HB-8064</td><td>Cellijn</td></tr><tr><td>HEPG2-cellen</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td>Cellijn</td></tr><tr><td>Huh7-cellen</td><td>ABM</td><td>T8973</td><td>Cellijn</td></tr><tr><td>IncuCyte S3 omgekeerde microscoop</td><td>Sartorius</td><td>NA</td><td>Monitoren van sferoïde-vorming/groei</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum Imager</td><td>Spectralinvivo</td><td>NA</td><td>End-point meting voor luminescentie</td></tr><tr><td>Nano-Glo&amp;reg; Live Cell Assay&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>N2013</td><td>Luminescent substraatreagens voor detectie van levende cellen</td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine (10.000 U/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td># 15140122</td><td>Voorkomen van bacteriële contaminatie</td></tr><tr><td>T75 weefselkweekflessen met ventilatie</td><td>Fisher Scientific</td><td>#NC0509296&amp;nbsp;</td><td>Flessen voor celkweek</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,05%)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#25300120</td><td>Enzymatische detachering van cellen</td></tr><tr><td>Platen met ultra-lage adhesie</td><td>Corning</td><td>#7007</td><td>Voorkomen van celadhesie om sferoïde-vorming te bevorderen</td></tr></tbody></table>

evaluatie van 3d-sferoïden voor aav-transductiestudies

Evaluation of 3D Spheroids for AAV Transduction Studies

Adeno-geassocieerde virussen (AAV's) zijn krachtige vectoren die worden gebruikt voor genoverdracht in gentherapeutische producten. Hun ontwikkeling vereist in vitro&#160;systemen die betrouwbaar verschillen in vectorontwerp, serotypeprestaties, sterkte van regulatoire elementen en expressiekinetiek kunnen detecteren. Deze systemen moeten daarnaast toepassingen ondersteunen zoals potentiebeoordeling en vectoroptimalisatie. Hier beschrijven we een gestroomlijnd driedimensionaal sferoïdenplatform dat is geoptimaliseerd voor het evalueren van AAV-potentie, transgene expressiekinetiek en serotype-specifieke transductie-efficiëntie in diverse cellijnen. Uniforme sferoïden worden gegenereerd met behulp van ultra-low attachment platen en in stand gehouden onder omstandigheden die een stabiele architectuur en langetermijnbeeldvorming ondersteunen. Na AAV-transductie worden fluorescente of luminescente readouts in real-time gemonitord met behulp van live-cell imaging systemen. Dit maakt kwantitatieve beoordeling van het reportersignaal, doserespons, activiteit van regulatoire elementen en de aanlooptijd mogelijk via continue kinetische beeldvorming. Het platform maakt effectief onderscheid tussen potente en zwakke vectorgenoomontwerpen en tussen meerdere AAV-serotypes. Deze methode vertoont robuuste prestaties in zowel langzaam als snel delende cellijnen. Deze resultaten bevestigen de bruikbaarheid ervan als een schaalbaar en fysiologisch relevant systeem voor preklinische evaluatie en ontwikkeling van gentherapie.

Driedimensionale sferoïde-cultuursystemen vormen een verbetering ten opzichte van conventionele 2D-modellen voor de ontwikkeling van AAV-gentherapie. Deze methodologie maakt een gevoelige detectie van AAV-transductie bij lage doses mogelijk, biedt een verbeterde fysiologische relevantie en maakt robuuste monitoring op lange termijn mogelijk. Het platform ondersteunt potentiebeoordeling, high-throughput screening en vectoroptimalisatie voor diverse cellijnen en AAV-serotypen.

Evaluatie van 3D-sferoïden voor AAV-transductiestudies

Adeno-geassocieerde virussen (AAV's) zijn krachtige vectoren die worden gebruikt voor genoverdracht in gentherapieproducten. De ontwikkeling ervan vereist in vitro-systemen die ...

We hebben een gevoelig, fysiologisch relevant 3D-sferoïdenplatform ontwikkeld om de AAV-transductieactiviteit te evalueren en de voorspelling van de vectorprestaties voor gentherapie te verbeteren. Dit protocol is toepasbaar voor het evalueren van AAV-activiteit bij vectorpotentietests, serotype-screening, transgeen-optimalisatie, neutralisatiestudies en in vitro preklinische gentherapie.Begin met het kweken van de cellen in een T75-celkweekfles tot ze onder standaardcondities een confluentie van 70% bereiken. Bereid na het trypsiniseren van de cellen een 1 op 10 verdunning voor voor routinematige celpassaging. Incubeer de cellen opnieuw tot ze een confluentie van 70% bereiken en oogst ze vervolgens. Beoordeel de celviabiliteit en pipetteer de celsuspensie grondig om een goede menging te garanderen. Voer tweevoudige seriële verdunningen van de cellen uit in een 96-wells plaat met ultra-lage hechting, beginnend met 1 × 10⁴ cellen per well in 200 µL. Voeg, volgens het getoonde experimentele schema, 1 volume compleet medium toe aan alle rijen, behalve aan de bovenste rij. Voeg vervolgens twee volumes van 1 × 10⁴ cellen per well toe aan de bovenste rij. Verdun rij 1A serieel door één volume van rij 1A aan rij 1B toe te voegen en ga op dezelfde wijze verder. Centrifugeer de plaat met ultra-lage hechting bij 350 ×g gedurende vijf minuten om de cellen naar het centrum te trekken en het cel-celcontact te bevorderen. Incubeer gedurende 24 tot 48 uur bij 37 °C, zonder verstoring, voor de vorming van sferoïden. Laat de diameter in drie dagen tijd ongeveer 400 µm bereiken. Controleer de uniformiteit van de sferoïdgrootte en zorg ervoor dat de cellen gelijkmatig zijn geresuspendeerd en de platen vlak liggen. Monitor de morfologie van de sferoïden. Selecteer volwassen sferoïden die een sterke cel-celadhesie vertonen in plaats van losse celaggregaten.Zodra de cel-suspensies zijn gecentrifugeerd, wordt de plaat overgebracht naar een incubator van 37 degrees Celsius die is uitgerust met een live-cell imaging-instrument. Log in op de acquisitiesoftware. Selecteer Schedule to acquire en Scan on schedule, en selecteer vervolgens Create vessel naar New. Kies daarna het scantype en selecteer spheroid. Kies de gewenste kanalen. Selecteer phase met bright field. Kies vervolgens groen of rood. Stel de gewenste vergroting in op 10x. Kies het plaatmodel en de positie ervan in de lade. Selecteer de wells die gefotografeerd moeten worden en voer de experimentnaam in. Selecteer bij de analyse-instellingen Differ analysis until later. Stel in dat er elke zes uur scans worden toegevoegd en scan onbeperkt. Controleer dagelijks de groei van de sferoïden door in te loggen op de imaging-software. Selecteer View recent scans en dubbelklik op het gewenste experiment. Nadat Brightfield in het paneel voor beeldkanalen is geselecteerd, wordt de functie Measure image gebruikt om de diameters van de sferoïden te meten. Verwijder de plaat op de dag van optimale sferoïdevorming en gebruik deze voor transductie met adeno-geassocieerd virus, of AAV.Bereid een 96-wells plaat met ronde bodem voor met 297 µL DMEM aangevuld met 2% FBS zonder antibiotica. Voeg 33 µL AAV-stock toe aan het medium om een startmultipliciteit van infectie, of MOI, van 1 × 10⁶ te verkrijgen. Bereid vervolgens 10-voudige seriële verdunningen door 33 µL van elke verdunning over te brengen naar 297 µL medium. Aspireer al het medium uit de eerder bereide sferoïdenplaat met een meerkanaals pipet. Breng 100 µL van de gewenste MOI van AAV van de verdunningsplaat over naar de behandelplaat met een meerkanaals pipet. Plaats de platen terug in het imaging-apparaat. Start de monitoring van de transductie door de groene fluorescentie-intensiteit gedurende 72 uur te volgen. Voeg elke drie dagen 100 µL compleet DMEM per well toe om de voedingsstoffen aan te vullen. Plaats de plaat terug in het imaging-apparaat en begin met het registreren van de transductie-efficiëntie elke zes uur. Analyseer de gegevens door een analysedefinitie op te stellen die specifiek is voor de cellen en reportergenen van belang. Voer een eindpuntanalyse uit met fluorescentie-uitlezingen. Voer op аналогиe wijze AAV-transductie uit in 3D-sferoïden met luminescente reporters, gevolgd door een transductieanalyse middels bioluminescentie-imaging.Elke cellijn vertoonde kenmerkende morfologische eigenschappen en variërende graden van compactie na drie dagen zaaien. Hepatische cellijnen vormden compactere, dichtere sferoïden dan de andere cellijnen. HEK293T vormde een zeer ronde sferische structuur met een duidelijke necrotische kern. A375 vormde een onregelmatig gevormd celaggregaat. Sferoïden waren zeer gevoelig voor AAV-transductie, waarbij sterke transductie werd gedetecteerd bij zeer lage AAV-titers voor zelfcomplementair GFP over verschillende cellijnen heen. Sferoïdtransductie van enkelstrengs GFP werd waargenomen op lagere niveaus dan zelfcomplementair GFP. Een 100-voudig verschil in relatieve fluorescentie werd waargenomen tussen de zelfcomplementaire en enkelstrengse transgenen bij een MOI van 10⁶ in HEK293T-cellen. Een drievoudig verschil in relatieve fluorescentie werd waargenomen tussen de zelfcomplementaire en enkelstrengse transgenen in HEP3B-cellen. Alle vier de AAV-serotypes werden succesvol gedetecteerd met behulp van zowel de fluorescente platenlezer als het live-cell imaging-systeem. AAV2 vertoonde de hoogste transductie-efficiëntie, gevolgd door AAV1 in beide cellijnen. Alle AAV-serotypes vertoonden efficiënte transductie met behulp van het luminescente systeem, wat een nauwkeurige differentiatie van de transductie-efficiëntie mogelijk maakte. AAV2 was het meest effectieve serotype in HeLa-sferoïden, terwijl AAV9 de laagste transductie-efficiëntie had. AAV2 zelfcomplementaire GFP-transductie was detecteerbaar bij infectiegraden zo laag als 10¹, met een merkbare toename van het signaal na ongeveer 34 uur vergeleken met onbehandelde cellen. Het AAV2 enkelstrengse GFP-signaal was zwakker en trager dan het zelfcomplementaire GFP-signaal.De belangrijkste uitdaging bij het uitvoeren van dit protocol is het behouden van een hoge celviabiliteit, het produceren van uniforme, compacte sferoïden en het optimaliseren van de AAV-dosering voor elk celtype en serotype. Met dit protocol kan de expressie en functionaliteit van het transgen worden beoordeeld middels RT-qPCR, Western blotting, ELISA's, somatische activiteitsassays en kinetische analyse van de aanvangstijd. Toekomstige studies kunnen co-culturen, organoïden, microfluïdica, immuuncellen of vasculatuur integreren om de in vivo micro-omgeving beter na te bootsen.

evaluation-of-3d-spheroids-for-aav-transduction-studies

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In dit artikel beschrijven we de identificatie van het adeno-geassocieerd virus serotype 3 (AAV3) als de meest efficiënte vector voor het richten van de menselijke lever kankercellen.

High-Efficiency transductie van leverkanker met behulp van recombinant adeno-geassocieerd virus serotype 3 Vectoren

We tonen de basistechniek om moleculair ingenieur en synthetische adeno-geassocieerde virale (AAV) gentherapievectoren evolueren via DNA-familie shuffelen. Bovendien geven we algemene richtlijnen en representatieve voorbeelden voor de selectie en analyse van individuele chimere capsiden met verbeterde eigenschappen op doel cellen in cultuur of in muizen.

Engineering en Evolutie van synthetische adeno-geassocieerd virus (AAV) gentherapievectoren via DNA Family Shuffling

Om de permeabiliteit van de bloed-retinabarrière en de integriteit van de binnenste begrenzingsmembraan in diermodellen van retinale aandoeningen te onderzoeken, hebben we verschillende adeno-geassocieerde virus (AAV) varianten gebruikt als hulpmiddelen om retinale neuronen en gliacellen te labelen. Virusgemedieerde reportergenexpressie wordt vervolgens gebruikt als een indicator van de permeabiliteit van de retinabarrière.

Met behulp van adeno-geassocieerd virus als een instrument om retinale Barrières in ziekte te bestuderen

Hier beschrijven we een efficiënte en reproduceerbare strategie om te produceren, titer en kwaliteitscontrole batches van adeno-associated virus vectoren. Het stelt de gebruiker om de voorbereiding van een vector met hoge-titer (≥1 x 1013 vector genomen/mL) en een hoge zuiverheid, in vitro of in vivo gebruiksklaar.

Productie, zuivering en kwaliteitscontrole voor Adeno-associated Virus gebaseerde vectoren

Deze methode kan worden gebruikt om sarcomere verkorting te onderzoeken met behulp van pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten met fluorescerende sarcomere-eiwitten.

Sarcomere Verkorting van Pluripotente Stamcel-Afgeleide Cardiomyocyten met behulp van Fluorescerende-Tagged Sarcomere Eiwitten.

Het huidige protocol beschrijft het genereren van 3D-tumorcultuurmodellen van primaire kankercellen en het evalueren van hun gevoeligheid voor geneesmiddelen met behulp van cel-levensvatbaarheidstests en microscopische onderzoeken.

Het vaststellen van 3-dimensionale sferoïden uit van de patiënt afgeleide tumormonsters en het evalueren van hun gevoeligheid voor geneesmiddelen

Hier wordt een op suspensie HEK293-cel gebaseerd AAV-productieprotocol gepresenteerd, wat resulteert in minder tijd en arbeid die nodig is voor vectorproductie met behulp van componenten die beschikbaar zijn voor onderzoeksdoeleinden van commerciële leveranciers.

Productie van Adeno-geassocieerde vectorbatches met hoog rendement met behulp van HEK293-suspensiecellen

Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol voor het genereren en zuiveren van adeno-geassocieerde virale vectoren met behulp van een geoptimaliseerde op heparine gebaseerde affiniteitschromatografiemethode. Het biedt een eenvoudige, schaalbare en kosteneffectieve aanpak, waardoor ultracentrifugatie niet nodig is. De resulterende vectoren vertonen een hoge zuiverheid en biologische activiteit, wat hun waarde bewijst in preklinische studies.

Isolatie van adeno-geassocieerde virale vectoren door middel van een eenstaps en semi-geautomatiseerd heparine-affiniteitschromatografieprotocol

Hier beschrijven we een geoptimaliseerd protocol voor laterale staartaderinjectie bij muizen om adeno-geassocieerd virus (AAV) systemisch toe te dienen bij volwassen muizen. Daarnaast beschrijven we protocollen van veelgebruikte assays om AAV-transductie te beoordelen.

Consistente toediening van adeno-geassocieerd virus via laterale staartaderinjectie bij volwassen muizen

Dit rapport beschrijft de gelokaliseerde injectiemethode van AAV-vectoren via het nierbekken voor effectieve en veilige genoverdracht naar de nier van de muis.

Effectieve en veilige genafgifte aan de nier van de muis via langzame retrograde injectie van nierbekken van adeno-geassocieerde virusvectoren

Leer een 3D-sferoïdenplatform evalueren voor AAV-transductiepotentie en transgenexpressiekinetiek. Deze methode ondersteunt kwantitatieve, real-time beoordeling van vectorprestaties voor gentherapieontwikkeling.

Evaluatie van 3D-sferoïden voor AAV-transductiestudies

Meer video's verkennen