Herprogrammering van geïnduceerde pluripotente stamcellijnen uit bevroren Buffy Coat-monsters

Het doel van dit protocol is het herprogrammeren van menselijke bevroren buffy coats of PBMC's tot geïnduceerde pluripotente stamcellen. Dit protocol zuivert buffycoats uniek na het ontdooien en identificeert een somatische celmorfologie die duidt op succes in herprogrammering. Om te beginnen, haal de bevroren buffy-vacht die is gemaakt van menselijk bloed en leg deze op ijs.

Draai het monster voorzichtig in een waterbad bij 37 graden Celsius en haal het flesje eruit als er nog maar een klein ijskristal overblijft. Breng de inhoud van het flesje druppelgewijs over in een kegelvormige buis met 12 milliliter DPBS. Spoel het flesje af met één milliliter DPBS en voeg de spoeling toe aan de conische buis met de teruggehaalde cellen.

Centrifugeer het monster met een schanderende emmerrotor op 200 g bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Verwijder voorzichtig het supernatant en suspendeer de celpellet opnieuw in vier milliliter DPBS met 1% FBS. Vervolgens laag je het buffy coat-mengsel voorzichtig over drie milliliter dichtheidsgradiëntoplossing, waarbij je mengt aan de grens vermijdt.

Centrifuge met een schwenkbare rotor van 800 g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur zonder rem. Met een pipet verwijder en verwijder je de bovenste plasmalaag zonder het plasma-naar-gradiëntinterface te verstoren. Verwijder vervolgens de perifere mononucleaire cel van het bloed, of PBMC, aan de grens en breng deze over in een schone buis van 15 milliliter.

Was de PBMC's door drie milliliter expansiemedium toe te voegen en te centrifugeren op 200 g gedurende 10 minuten op kamertemperatuur. Verwijder voorzichtig het supernatant en suspendeer de pellet opnieuw in twee milliliter expansiemedium met cytokines zoals SCF, IL-3, EPO en IGF-1. Plat de cellen in één put van een plaat met 12 gaten.

Kweek de cellen op 37 graden Celsius met 5% kooldioxide en 20% zuurstof gedurende 10 tot 14 dagen. Vervang om de dag de helft van het medium totdat een dichte populatie heldere, ronde erythroblasten is waargenomen, wat aangeeft dat de cellen klaar zijn voor transductie. Drie dagen na transductie met het Sendai-virus dat de Yamanaka-factoren draagt, wordt de cellen op muizenembryonale fibroblasten geplaatst met twee milliliter per put.

Bred de culturen ongeveer zeven dagen uit en voed opkomende kolonies om de dag met hESC-media. Plaats de plaat met de getransduceerde cellen en uitkomende kolonies onder een dissectiemicroscoop. Gebruik de microscoop om één kolonie te lokaliseren om het deksel van de plaat te openen en op te tillen om de put bloot te leggen.

Open de spuit aseptisch en maak de naald bloot. Geleid door de microscoop gebruik je de naaldpunt om de kolonie los te maken van de omliggende voedercellen door de omtrek van de kolonie te volgen. Gebruik de naaldpunt om de kolonie in een paar even grote stukken te snijden.

Als de stukjes niet losgeraakt zijn, gebruik dan de zijkant van de naald om ze van het bord te scheppen of te schrapen totdat ze drijven. Gebruik nu een P200-pipet, lokaliseer de gekozen kolonie onder de microscoop, aspiraat de drijvende kolonie met de pipet en breng deze over in een put van de voorbereide 24-put plaat. Zorg ervoor dat de hele kolonie wordt overgebracht zonder andere kolonies of voedercellen te verzamelen.

Plaats de plaat in de broedmachine op 37 graden Celsius met 5% kooldioxide en 20% zuurstof totdat de gewenste samenvloeiing is bereikt. Identificeer kolonies die groot, rond zijn en gloeiende randen vertonen en klaar zijn om te splitsen. Aspiraat het medium uit de put en spoel het monster één keer af met één milliliter DPBS.

Verwijder dan de DPBS en voeg 500 microliter 0,5 millimolaire EDTA dissociatiebuffer toe. Incubeer het monster twee minuten op 37 graden Celsius met 5% kooldioxide totdat de kolonies losser worden en de cellen zich afronden. Verwijder vervolgens de plaat uit de broedmachine en aspireer de EDTA-dissociatiebuffer.

Met een P1000-pipet verzamel je de cellen met één milliliter humaan pluripotent stamcelmedium door voorzichtig op en neer te pipetteren totdat de kolonies losgekoppeld en licht worden opgesplitst. Overbreng de één milliliter medium en cellen naar een nieuwe zes-wellplaat met één milliliter verse menselijke pluripotente stamcelmedium. Plaats de cellen in de broedmachine op 37 graden Celsius met 5% kooldioxide en 20% zuurstof.

Voed dagelijks geïnduceerde pluripotente stamcellen totdat de put samenvloeit en klaar is om te splitsen. Bedek ondertussen een schaal van 10 centimeter met 7 milliliter van vijf microgram per milliliter vitronectine-oplossing, bereid in DPBS, en incubeer deze een uur op kamertemperatuur. Om verder te splitsen, voeg je 7 tot 10 milliliter humaan pluripotent stamcelmedium toe aan de 10-centimeter schaal en breng je cellen van de zes-well-plaat over naar de schaal in een verhouding van 1:1, en incubeer je zoals eerder gedemonstreerd.

Controleer of de cellen in de 10-centimeter schotel samenvloeien voordat je de cellen opnieuw splitst. Pas de splitsingsverhouding aan op basis van celmorfologie en dichtheid, meestal met een verhouding van 1:10, en let op het passagenummer bij elke passage. Karakteriseer ten slotte geïnduceerde pluripotente stamcellen door de NANOG-expressie van de stammarker te bevestigen met behulp van immunofluorescentie.

Differentieer de cellen in ectoderm-, mesoderm- en endodermlijnen met behulp van gedefinieerde kweekvoorwaarden. Beoordeel differentiatiepotentieel door te kleuren voor PAX6, Brachyury en SOX17, samen met verlies van NANOG-expressie. Aan het einde van de expansie diversifieerden PBMC's zich tot erythroblasten die verschenen als heldere, ronde cellen van grote en kleine grootte.

Terwijl culturen zonder deze cellen of die dood leken, waarschijnlijk niet succesvol werden herprogrammerd. Succesvolle transductie en herprogrammering werden gekenmerkt door het ontstaan van geïnduceerde pluripotente stamcelkolonies op bestraalde feedercellen, die vervolgens de typische stamcelmorfologie ontwikkelden. Terwijl cellen die geen stamcelachtige morfologie aannamen, niet succesvol werden herprogrammeerd.

Succesvol geïnspireerde pluripotente stamcellen vertoonden dichte, ronde kolonies met gladde, heldere randen. Subklonen met minder ideale morfologie, zoals spontane differentiatie of dichte centra, werden opgeschoond door splitsingsvoorwaarden aan te passen. Sommige gekozen koloniën breidden zich niet succesvol uit.

Naast morfologie vertoonden geïnduceerde pluripotente stamcellen stamheid, zoals blijkt uit de expressie van stammarker NANOG. Geïnduceerde geïnduceerde pluripotente stamcellen toonden differentiatiepotentie in ectoderm, mesoderm en endoderm. Dit protocol biedt gedetailleerde checkpoints om het succes van herprogrammering te volgen en te voorspellen.

Om verder te bevestigen dat een iPSC-lijn geschikt is voor gebruik, moeten karyotypering, genotypering en reguliere mycoplasmatests worden uitgevoerd. Dit protocol maakt herprogrammering mogelijk van bestaande patiëntenpopulaties met biobanked buffy coats, waardoor het nut van iPSC-technologie wordt vergroot.