Gebruik van oplossings-NMR om biomoleculaire condensaten onder bifasische omstandigheden te karakteriseren

We ontwikkelden NMR-methoden om biomoleculaire condensaten te bestuderen. Deze zijn essentieel voor cellulaire organisatie, maar hun hele informatie wordt geïmpliceerd in meerdere aandoeningen. Met onze methoden onderzoeken we de eigenschappen van condensaatmateriaal, analyseren we het mechanisme van hun vorming en monitoren we langetermijnveranderingen zoals condensaatrijping of pathologische fibrilleren van biomoleculen.

Om te beginnen bereid je het uiteindelijke bifasische monster voor dat gestabiliseerd is door agarosehydrogel door de eiwitvoorraden, RNA-voorraden of beide te mengen met de respectievelijke warme agarosebuffer in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Het uiteindelijke eiwit, of RNA-concentratie, is typisch 50 tot 500 micromolair voor NMR-detectie. Breng het voorbereide bifasische monster in een spectrometer in, vergrendel, shim, match en stem het protonkanaal zoals gewoonlijk af.

Kalibreer de 90 graden pulslengte op het protonkanaal met behulp van de algemene kalibratieprocedure. Neem vervolgens een eendimensionaal water onderdrukt spectrum op en controleer of het spectrum sterke biomoleculaire signalen bevat. Als er geen of zeer weinig signaal wordt waargenomen, ga dan niet door met REDIFINE, maar gebruik in plaats daarvan de CONDENSE-MT.

Neem een diffusie-geordende spectroscopie-experiment op om de diffusiegradiëntsterkte te verdelen van 2 tot 95% in 16 lineaire stappen. Om gegevens voor de volledige REDIFINE-set te blijven verzamelen, maak je negen nieuwe stappen PPP GPQ GPQ S19-experimenten door de parameters van het initiële experiment dat zojuist is uitgevoerd te kopiëren. In elk opeenvolgend experiment wordt alleen de D20-diffusievertraging in variabele stappen aangepast om het bereik te beslaan van 100 tot 1000 milliseconden.

Voer elk van deze experimenten uit met het juiste commando. Gebruik de laatste N om de ontvangerversterking gedurende de 10 experimenten te behouden. Stel Q-teken in met SSB2 als vensterfunctie.

Haal vervolgens het vijfde stuk uit met het juiste commando. Fase het eendimensionale spectrum en sla de faserparameters op in de tweedimensionale dataset. Verwerk de tweedimensionale dataset met de XF2 en voer de basiscorrectie uit met ABS2.

Daarna extraht u de 16 plakjes met split 2D. Herhaal dezelfde procedure voor de overige negen experimenten. Controleer ten minste de eerste vier tot vijf sneden om de juiste fasing en correctie van de basislijn te waarborgen.

Corrigeer indien nodig handmatig de fasering en baseline. Gebruik vervolgens de geschikte MATLAB-code voor de analyse. In de code passen de diffusietijden aan, stellen de PG-waarden in volgens de sterkte van de probe-gradiënt en wijs experimenten één tot en met tien toe op basis van het totale aantal experimenten.

Pas vervolgens de gegevens aan volgens het REDIFINE-model met deze code. Noteer het 1D wateronderdrukte spectrum. Als er zeer weinig signaal wordt waargenomen, ga dan door met het CONDENSE-MT-experiment.

Bepaal de R1-snelheid van water door T1-inversieherstel voor kwantitatieve CONDENSE-MT. Kopieer de meegeleverde pulsvolgorde en VD-lijst naar de respectievelijke mappen. Na het kalibreren van de proton 90 graden puls, stel NS in op 2, DS op 0, D1 op 20 seconden, SW op 10 delen per miljoen.

TD2 naar 16K en TD1 naar 24. Voor het CONDENSE-MT-experiment kopieer je de meegeleverde Bruker parameterset, volgorde en frequentielijst naar de Bruker-specifieke mappen. Pas vervolgens de frequenties en het vermogen aan volgens de spectrometer.

Stel P1 in op de gekalibreerde pulslengte van 90 graden en P4 op één microseconde voor de excitatiepuls om stralingsdemping te voorkomen. Stel NS in op 2, DS op 16, D1 op vier seconden, SW2 op 20 delen per miljoen, TD2 op 8k en TD1 op de lengte van de frequentielijst. Stel SPNAM10 in op Squa100, 000, en stel P10 in op vijf seconden.

Vind de SP10-stroom die 100 hertz bestraling oplevert. Pas de SP10-kracht van de bestralingspuls dienovereenkomstig aan. Voer het pseudo-tweedimensionale experiment uit met het juiste commando en stel een reeks van deze pseudo-2D-experimenten op, waarbij je de SP10-bestralingskrachten varieert.

Na het aanpassen van alle parameters voer je de code uit om het NMR-spectrum te lezen, dat het watersignaal integreert en opslaat in een nieuwe variabele. In het herstelsysteem van code inversie past u het pad aan naar de juiste data en controleert u het waterintegratiegebied. Pas vervolgens het experimentnummer aan met de inversieherstelgegevens.

Stel alle experimentele parameters in en voer de eerder verkregen agarose-lege poolwaarden in door de agarose-dataset op vergelijkbare wijze te passen. Voer het eerste gedeelte van de gecondenseerde lege code uit om de fit voor waterlongitudinale relaxatie te verkrijgen. Voer vervolgens het condenseer lege fittinggedeelte uit om de live figuur te starten die de minimalisatie van de fittingfunctie laat zien.

Voer het volgende gedeelte van de code uit om de onzekerheden te bepalen en plot de gegevens. De REDIFINE-fit bepaalde de diffusiecoëfficiënten in de verdunde en gecondenseerde fasen, de populatie van eiwitten in de gecondenseerde fase, de gemiddelde druppelgrootte en de interfasepermeabiliteit voor het FUS N-terminale domeinmonster. Het NMR-signaal van het FUS N-terminale domein bleef detecteerbaar in de gecondenseerde fase.

Er werd geen verschil waargenomen in het magnetisatieoverdrachtsprofiel tussen de agarosereferentie en het FUS N-terminale domein per fasisch monster. Voor CAG-herhalings-RNA-condensaten wordt geen NMR-signaal waargenomen. Dienovereenkomstig verschilt het magnetisatieoverdrachtsprofiel aanzienlijk van de agarosereferentie.

Het CONDENSE-MT-experiment leverde dynamische karakterisering van herhaalde expansie-RNA-condensaten. De CONDENSE-MT-analyse leverde de protonuitwisselingskinetiek tussen het condensaat en bulkwater op. De CONDENSE-MT-analyse leverde ook de transversale relaxatietijd van het RNA in het condensaat en de schijnbare transversale relaxatiesnelheid van bulkwater op.

In dit protocol kunnen we de condensaateigenschap karakteriseren in een bifasische toestand zonder dat een chemische tag nodig is. De druppels bestaan naast een verdunde omgeving, waardoor uitwisseling tussen de twee fasen mogelijk is en zo de cellulaire omgeving nabootst. Onze methoden, gericht op condensaatkarakterisering, kunnen worden aangevuld met conventionele NMR-methoden om interacties en dynamiek tussen moleculaire structuren over fasen te bestuderen.

In toekomstige studies streven we ernaar complexere condensaatmodellen te ontwikkelen, waarbij we de methodologie aanpassen aan complexere systemen, en uiteindelijk condensaat direct in hun cellulaire omgevingen bestuderen.