Medium-throughput kolom DNA-extractie met behulp van 24-well racks

Ons onderzoek richt zich op 3D-geprinte rekken voor parallelle spin-kolom extractie van DNA en RNA, waarmee een brug wordt geslagen tussen handmatige en geautomatiseerde methoden. Deze benadering pakt de beperkingen van arbeidsintensieve handmatige spin-kolom methoden aan door het gelijktijdig verwerken van maximaal 116 DNA- of RNA-monsters mogelijk te maken. Gebruik om te beginnen een fused filament 3D-printer met een nozzle van 0,4 millimeter om het rek te printen.

Gebruik generiek polylactide, of PLA, polyethyleentereftalaatglycol, of PETG, of acrylonitrilbutadieenstyreen, of ABS-filament met 100% vulling. Stel de laaghoogte in op 0,1 millimeter en schakel oppervlakte-afgladding in. Pas de printinstellingen aan om waterdichtheid en mechanische stabiliteit te garanderen.

Test de racks op waterdichtheid voordat u ze voor het eerst gebruikt. Vul het geprinte reservoir met 70% ethanol om het voor gebruik te testen. Centrifugeer gedurende stapsgewijs toenemende tijdsduuren om de afwezigheid van lekkage of structurele schade te bevestigen.

Nadat het testen met lijm succesvol is verlopen, worden de componenten van het basisreservoir aan elkaar verbonden om een afgesloten eenheid te vormen. Inoculeer escherichia coli, of E.Coli transformanten, in drie tot vijf milliliters lysogeny broth, of LB-medium, waarin de juiste antibiotica zijn opgenomen. Incubeer de cultuur gedurende 12 tot 16 uur bij 37 °C onder schudcondities.

Centrifugeer 10 minuten bij 2000 G om de cellen te oogsten. Verwijder het supernatant. Voeg 250 microliter resuspensiebuffer toe aan het pellet.

Resuspendeer het pellet volledig door te vortexen of te pipetteren. Voeg 250 µL lysisbuffer toe. Meng voorzichtig door de buis vier tot zes keer om te keren of door de 24-wells plaat te schudden.

Voeg 350 µL neutralisatiebuffer toe en meng dit. Observeer de vorming van een wit neerslag om een succesvolle neutralisatie te bevestigen. Voeg lysisbuffer toe aan een buis die titaandioxidepoeder bevat.

Voeg een volume-massaverhouding van twee op één toe. Voeg 250 µL van de titaniumdioxide-suspensie toe aan het lysaat. Meng dit vervolgens door de buis te schudden.

Voeg 350 µL neutralisatiebuffer toe en meng grondig. Centrifugeer 10 minuten bij 2000 G. Observeer dat de celpellet volledig is neergeslagen in aanwezigheid van titaniumdioxide en dat het supernatant volledig transparant is.

Let bij afwezigheid van titaandioxide op de aanwezigheid van residu-sediment in het supernatant. Verzamel het supernatant zonder het precipitaat te verstoren en breng het over naar de bindingskolom. Plaats de DNA-bindingskolommen in de kolomhouderlaag van het rek.

Plaats de kolomdeksels in de daarvoor bestemde gleuven om ze tijdens het centrifugeren te fixeren. Plaats de clarificatie- of filterkolommen in de filterkolomlaag direct boven de bindingskolommen. Breng het voorbereide geneutraliseerde lysaat over in de filtratiekolommen.

Plaats het gemonteerde rek in een rotor met scharnierende emmers. Centrifugeer 1 minuut bij 2000 G op kamertemperatuur. Verwijder het rek uit de centrifuge en verwijder vervolgens de filterkolomlaag en gooi deze weg.

Giet de doorstroom uit het reservoir in een afvalbak. Plaats het rek met de bindingskolommen opnieuw samen. Voeg 500 tot 700 microliters wasbuffer toe aan elke bindingskolom.

Centrifugeer bij 2000 G gedurende één minuut. Verwijder de doorstroom uit het reservoir en herhaal de wasstap zoals eerder gedemonstreerd. Verwijder de bindingskolommen uit het rek en breng ze over naar opvangbuisjes van twee milliliter.

Centrifugeer gedurende één minuut bij 10.000 G of hoger om het membraan te drogen. Breng de kolommen over naar schone buisjes van 1,5 milliliter. Voeg 50 microliters elutiebuffer of water rechtstreeks toe aan het membraan en incubeer de kolommen gedurende één minuut bij kamertemperatuur.

Centrifugeer gedurende één minuut bij 10,000 G of hoger om het DNA te elueren. De totale plasmidopbrengst vertoonde geen significant verschil tussen de conventionele methode en extractie met gebruik van de rackconfiguraties. De plasmidbevestiging bleef behouden met vergelijkbare verdelingen van relaxed, gelineariseerd en supercoiled DNA.

De distributie van de kleurstof was beperkt tot het afvalgebied direct onder de beladen kolommen, waarbij geen zichtbaar signaal werd gedetecteerd in aangrenzende wells of op naburige kolomtoppen, wat aangeeft dat het ontwerp van het rek de kans op spatten en overdracht tussen kolommen vermindert. Amplificatie werd uitsluitend gedetecteerd in eluaties van kolommen waaraan het amplicon was toegevoegd. Dit onderdeel stelt onderzoekers in staat om plasmid-DNA van hoge kwaliteit te verkrijgen voor downstream-applicaties, waaronder klonering, sequencing en PCR-analyse.

Het belangrijkste aandachtspunt bij het uitvoeren van dit protocol is het voorkomen van kruiscontaminatie door het gebruik van een waterdicht, niet-overlopend, 3D-geprint reservoir. Daarnaast kunnen deze racks na deze procedure worden gebruikt voor elke analyse van zuurnucleïnextractie op basis van kolommen.