Senescentiedetectie met behulp van gereflecteerd licht in de vetachtige stromale vaatfractie

We bestuderen de adipocytensenescentie bij verschillende vetdepots en metabole aandoeningen, zoals obesitas en hyperinsulinemie. Traditionele SABG-assays in Brightfield staan multiplexing eigenlijk niet toe en zijn erg subjectief. Ons nieuwe protocol is minder subjectief en staat multiplexing toe.

Om te beginnen haal je de buis met het menselijk vetweefsel op. Homogeniseer 10 gram vetweefsel en voeg dit toe aan een buis met 0,05% type 1 collageen-enzym om ongeveer een miljoen stromale vaatfractie- of SVF-cellen te verkrijgen. Ongeveer 500.000 cellen in elke 1,5 milliliter microcentrifugebuis.

Voeg één milliliter 2% paraformaldehyde toe aan de buis voor celfixatie. Daarna incubeer je op een schommelstoel op kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Centrifugeer op 600G gedurende 10 minuten en verwijder het supernatant.

Bereid de X-Gal kleuroplossing voor met behulp van de senescence beta-galactosidase kleurkit volgens de instructies van de fabrikant. Voeg één milliliter van de kleuroplossing toe aan drie verse tubes. En stel de pH in op vijf, zes en acht met één molair zoutzuur of één molaire natriumhydroxideoplossing.

Gebruik een gekalibreerde pH-meter om de pH te controleren. Voeg de pH-aangepaste X-Gal kleuroplossing toe aan elk van de gelabelde buizen met 500.000 cellen. Incubeer 24 uur bij 37 graden Celsius zonder kooldioxide.

Centrifugeer de cellen op 600G gedurende 10 minuten. Na het verwijderen van het supernatant was je de cellen met PBS. En centrifugeer opnieuw op 600G gedurende 10 minuten.

Zodra de supernatant is verwijderd, om endotheelcellen binnen de heterogene SVF te identificeren, incubeer je de cellen met endotheelcel-specifieke CD31 of controleer je IgG-primaire antilichamen bij vier graden Celsius gedurende de nacht. Was de cellen drie keer met 0,1% PBST gedurende 10 minuten op kamertemperatuur op een schommelaar om losstaande primaire antistoffen te verwijderen. En centrifugeer op 600G gedurende 10 minuten.

Na het weggooien van het supernatant, incubeer je de cellen met een secundair antilichaam gedurende een uur op kamertemperatuur op een schommelstoel. Centrifugeer op 600G gedurende 10 minuten om secundaire antistofkleuringsoplossing te verwijderen. Was de cellen drie keer met PBST en centrifugeer daarna zoals eerder gedemonstreerd.

Suspendeer cellen opnieuw in de antifade mountant. Pipetteer de celsuspensie op microscoopglaasjes en hard het 's nachts uit bij kamertemperatuur om de cellen te immobiliseren. Voeg de volgende dag 100 microliter glycerol toe.

Leg een deksel erop en sluit het af met nagellak. Plaats het voorbereide preparaat op het podium van een confocale microscoop. Selecteer in de microscoop-softwareinterface de optie Lichtpad en stel de bundelsplitter in op T90R10.

Controleer vervolgens de cutoff-golflengtewaarden voor de secundaire dichroïsche spiegels, of SDM's, in de Spiegel-instelling. Klik in het detectormenu op de optie Kleurstof en Detector Select om kanalen en excitatiegolflengten toe te wijzen. Stel vervolgens de laservermogensintensiteitswaarden in voor elke specifieke laser in het bereik van 10 tot 15%. In het Series-menu, onder de LSM-sectie, zet de Z-optie op Aan. Stel de Z-stapgrootte in op het systeemoptimum van 0,74 micrometer.

Voer vervolgens onder het Z-sectiemenu het start-invoerveld in en definieer een Z-stack op basis van het membraansignaal om het volledige celvolume vast te leggen. Voer onder het Acquire-paneel de bestandsnaam en de bestandsopslaglocatie in in het LSM-invoerveld. En klik op LSM Start om beeldacquisitie te starten.

En sla de bestanden op in het oorspronkelijke microscoopformaat. Na het verkrijgen gebruik je de Z-navigatiepijlen om het signaal en de focale verdeling van verschillende kleurstoffen over de gehele Z-stack te verifiëren. Upload het opgeslagen oir-bestand naar Image J.In het pop-up venster Bio-Formats Import Options, klik op Oké.

Klik op het Afbeeldingsmenu om het bestand te openen. En kies in de dropdown-opties Kleur, daarna de optie Split Channels om de verschillende kanalen als aparte vensters te openen. Pas vervolgens het helderheidscontrast aan en optimaliseer de LUT-waarden met de optie Aanpassen onder het Afbeeldingsmenu voor een verbeterde visualisatie van het beeld.

Gebruik de Z-as scrollbalk onderaan het frame om de optische secties te doorlopen en cellulaire kenmerken door de hele stack te verifiëren. Kies onder het afbeeldingsmenu Stack. Selecteer vervolgens de Z-projectfunctie om opgetelde intensiteitsprojecties van het driedimensionale confocale beeld te genereren.

Definieer in het dialoogvenster Z Projection de start- en stop-slice-bereiken. Selecteer het projectietype en klik op Oké om het uiteindelijke 2D-composietbeeld te verkrijgen. Ga vervolgens naar het afbeeldingsmenu.

Selecteer de type-optie om het afbeeldingstype aan te passen naar 16-bit. Sla vervolgens de afbeeldingen op en exporteer ze als 16-bit TIF-bestanden. Importeer de opgeslagen afbeeldingen in CellProfiler versie 4.2.8 voor geautomatiseerde celsegmentatie, kwantificatie van de gereflecteerde lichtintensiteit per cel en het exporteren van de intensiteitsmetingen naar een spreadsheet.

In de spreadsheet definieer je de drempel voor senescence-geassocieerde bèta-galactosidase positiviteit als de som van de gemiddelde gereflecteerde lichtintensiteit van de pH 8-conditie plus drie standaardafwijkingen. Classificeer de cellen in de pH 6-conditie als senescence-geassocieerd beta-galactosidase-positief als hun intensiteitswaarden de vastgestelde drempel overschrijden. Gereflecteerd licht geassocieerde beta-galactosidase-kleuring van menselijke SVF-cellen leverde duidelijke en reproduceerbare patronen op over drie pH-niveaus.

Bij pH 5 vertoonden de meeste cellen een sterk signaal door hoge endogene enzymactiviteit. Bij de assaystandaardwaarde van pH 6 daalden de signaalintensiteit en frequentie, waardoor de specifieke identificatie van senescence-geassocieerde bèta-galactosidasecellen mogelijk was. Bij pH 8 was het signaal minimaal, en dit diende als referentie om de drempel voor positiviteit te bepalen.

Detectiegevoeligheidstests toonden aan dat de reflecteerde lichtbeeldvorming beter presteerde dan Brightfield onder alle pH-condities. Bij pH 5 toonde gereflecteerd licht sterke X-Gal-neerslagen, terwijl Brightfield alleen de grootste afzettingen opving. Bij pH 6 identificeerde gereflecteerd licht positieve cellen die te zwak of te gediffuseerd waren om in Brightfield te zien.

Bij pH 8 detecteerde reflectielichtbeeldvorming minimaal signaal, wat consistent is met lage enzymatische activiteit, waarmee Brightfield beter presteerde in het identificeren van X-Gal-precipitaten bij intermediaire en lagere activiteitsniveaus. Al met al integreert deze reflecteerlichtbeeldvorming de gelijktijdige detectie van pH-afhankelijke senescentie-geassocieerde bèta-galactosidase en fluorescentie-gebaseerde markers, zoals CD31, waardoor multi-feature senescentiebeoordelingen met enkelcelresolutie binnen heterogene SVF-populaties mogelijk worden. Dit protocol maakt gevoelige en kwantitatieve SABG-activiteitsmetingen mogelijk, terwijl tegelijkertijd zowel andere senescence-markers als andere cellulaire markers worden toegestaan.

De grootste uitdaging, zou ik zeggen, is de eerste microscopie-installatie. Maar zodra dat geoptimaliseerd is, kun je dezelfde acquisitieparameters gebruiken in alle experimenten. Toekomstige studies kunnen deze test combineren met andere subcellulaire markers om te zien hoe SABG zich verhoudt tot verschillende cellulaire processen.