Goedkope optie voor het onderzoeken van sociale voorkeur bij zebravissen (Danio rerio) met behulp van de 3-kamer open-tank free-swim taak

Dit protocol valideert een goedkope en open source 3-kamer open-tank vrijzwemtest om sociale voorkeur bij zebravis te onderzoeken. Dit protocol kan worden gebruikt bij verschillende soorten en stelt studenten in staat om sociale voorkeur te onderzoeken met minimale middelen. Begin met het voorbereiden van de open-tank opstelling met een centrale experimentele kamer en twee flankerende stimuluskamers.

Installeer het achtergrondverlichtingssysteem. Gebruik ondoorzichtige scheidingswanden en polarisatiefilters om de visuele isolatie en het videocontrast te optimaliseren. Monteer en richt de camera's voor de kamers uit met behulp van het cameradragersysteem.

Sluit de verduisteringsgordijnen en handhaaf stabiele houdomstandigheden voordat u het experiment start. Download de Open Broadcaster Software en installeer deze op een lokale computer met Windows. Voer na het opstarten van de software de configuratiewizard uit om de instellingen te optimaliseren voor de specifieke opnamebehoeften, hardwarebronnen en netwerkomstandigheden.

Verifieer de basisinstellingen vóór de cameraconfiguratie. Stel de resolutie van het basiscanvas zo in dat deze overeenkomt met de beeldschermresolutie en stel de juiste geschaalde outputresolutie in. Maak vervolgens een scène aan door met de rechtermuisknop in het vak voor scènes te klikken en Selecteer Scène Toevoegen.

Wijs een naam toe aan de scène en gebruik deze om de lay-out van de stream te definiëren. Voeg een nieuwe bron toe en selecteer Video Capture Device om een webcam toe te voegen. Wijs aan elke camera een unieke naam toe, zoals Camera Center, en herhaal dit proces voor de extra camera.

Positioneer en pas de grootte van de bronnen aan in het voorvertoningsvenster. Controleer of de camera in de bronnenlijst staat. Breng het camerabeeld naar het midden van het canvas door control plus D in te drukken. Pas 'passen aan scherm' toe door control plus F in te drukken, of rek het scherm uit door control plus S in te drukken. Snijd de bron bij door de alt-toets ingedrukt te houden terwijl u het begrenzingskader versleept.

Dubbelklik vervolgens op de geselecteerde camera en klik op Configure Video. Pas de helderheid en het contrast van de video aan in het eigenschappenmenu. Vul alle drie de kamers met water uit de kweekbakken en pas de watertemperatuur aan voordat de vissen worden geïntroduceerd.

Zorg ervoor dat de ondoorzichtige barrières tussen de kamers gedurende de gehele acclimatisatieperiode op hun plaats blijven. Plaats één volwassen Danio rerio in de centrale kamer en laat deze gedurende ten minste één uur acclimatiseren. Plaats de kunstmatige sociale stimuli in de flankerende linkerstimulatiekamer.

Verplaats vervolgens een kleine groep van vier vissen, bestaande uit twee mannetjes en twee vrouwtjes van vergelijkbare grootte, leeftijd en bekendheid, naar de rechter stimuluskamer. Voorzie tijdens de acclimatisatie alle kamers met levende dieren van een onderdompelbare verwarmingselement ingesteld op 26 °C, een bruissteen verbonden met de aquariumluchtpomp en een tankdeksel om stabiele houdomstandigheden te handhaven. Verwijder de verwarmingselementen en bruisstenen voordat de experimentele sessie wordt gestart.

Start de enkele camera op de centrale tank. Start de software en pas de grootte van het centrale camerabeeld aan zodat dit het scherm vult door de hoeken van de video te verslepen. Selecteer vervolgens Start Recording onder de bedieningselementen.

Verwijder onmiddellijk de ondoorzichtige barrières. Beëindig na 10 minuten de sessie door onder de bedieningselementen Opname stoppen te selecteren. Open de opgenomen sessies door in het menu linksboven Bestand te selecteren en in het uitklapmenu Opnames weergeven te kiezen.

Laad vier tot vijf video's in een softwareapplicatie voor bewegingsanalyse, zoals DeepLabCut, en extraheer 20 tot 30 frames uit elke video. Definieer ten minste drie primaire trackingpunten, zoals de kop, de staart en de romp. Train het netwerk om deze punten over de frames heen te volgen.

Gebruik een neuraal netwerk gebaseerd op ResNet-101 om het model te trainen. Bepaal het aantal iteraties dat nodig is om de training te voltooien. Implementeer vervolgens het volledig getrainde DeepLabCut-model op de overige experimentele video's en extraheer de positiegegevens voor elke trial volgens de gebruikershandleiding.

Gebruik vervolgens een coderingssoftware zoals Python om de beweging over de drie verticale arena-zones van gelijke breedte te definiëren en te analyseren om de voorkeur te kwantificeren. Meet de tijd in elke zone met behulp van ten minste twee lichaamspunten binnen de geïdentificeerde zone om trackingruis te verminderen. Bereken de totale tijd in elke zone door het totaal aantal frames in de zone te delen door het totale aantal frames.

Gebruik dezelfde coderingssoftware om de tijd dat het dier bewegingsloos is, zoals bij freezing, te definiëren en te meten. Stel de bewegingsdrempel in op 2 tot 5 pixels per frame met een minimaal aantal opeenvolgende frames van 15 frames. Compileer tot slot de metingen en exporteer deze voor statistische analyse en visualisatie.

Proefpersonen brachten significant meer sessietijd door in de rechterzone dichtst bij de levende school, dan in de middelste zone of de linkerzone dichtst bij de kunstmatige mobiele stimulus. Het verschil in doorgebrachte tijd tussen de middelste zone en de linkerzone was statistisch niet significant. Proefpersonen brachten significant minder sessietijd bewegingloos door in de middelste zone dan in de rechterzone dichtst bij de levende school of de linkerzone dichtst bij de mobiele stimulus.

Dit protocol kan door onderzoekers worden gebruikt om de neiging van een zebravis om visueel interactie te zoeken met twee verschillende sociale stimuli te onderzoeken en te bepalen welke stimulus wordt verkozen. Onderzoekers kunnen verschillende soorten of stimulusconfiguraties gebruiken, en daarnaast andere reacties onderzoeken, zoals wegschieten of onregelmatig zwemgedrag. Het systeem biedt een platform om translationele modellen voor sociale functionele eigenschappen te bestuderen en kan worden ingezet voor het verkennen van farmacologische en omgevingsmanipulaties.