Een continu kweek millifluidisch apparaat voor de studie van Escherichia coli onder lage en fluctuerende voedingsomstandigheden

Mijn onderzoek richt zich op het onderzoeken van hoe bacteriën zich fysiologisch aanpassen aan lage en fluctuerende voedingsomstandigheden die typisch zijn voor natuurlijke omgevingen. Conventionele teeltsystemen repliceren slecht de laag-dynamische nutriëntencondities, terwijl ons systeem teelt mogelijk maakt onder deze milieurelevante omstandigheden. Bereid de nachtkweek de dag voor het experiment voor.

Bereid een pre-cultuur voor door zes microliter van de nachtkweek toe te voegen aan een buis met zes milliliter volledig rijk gedefinieerd medium, of RDM. Verdeel het mengsel gelijkmatig in twee kweekbuizen van 15 milliliter en label deze als A en B. Incubeer beide buizen bij 37 graden Celsius, met schudden bij 200 RPM. Monitor de optische dichtheid op 600 nanometer met buis B en ga pas verder als de optische dichtheid ongeveer 0,5 bereikt.

Tijdens de incubatie bereid je het Low RDM-medium voor en verdeel je het totale volume over flessen voor verschillende tijdstippen. Sluit vervolgens elke fles af met doppen die zijn voorzien van drie buizen. Verbind de derde breedste siliconenbuis met een 0,2-micrometer ventilatiefilter voor steriele luchtuitwisseling.

Bevestig één uiteinde van elke peristaltische buis, voorzien van mannelijke Luer lock-connectoren, aan de siliconenbuizen met kleinere diameter. Laat de aluminiumfolie afdekking op de vrije mannelijke Luer-vergrendeling aan het andere uiteinde van de peristaltische buizen zitten totdat het experiment begint om besmetting te voorkomen. Plaats de flessen en de peristaltische pomp in een broedmachine die op 37 graden Celsius staat.

Bevestig alle peristaltische slangen in de kanalen van dezelfde pompkop, zodat de debiet over alle filters identiek is. Verdun de pre-cultuur in een verhouding van één op 10 door 600 microliter kweek toe te voegen aan een buis met 5,4 milliliter Low RDM. Met een pipet van één milliliter wordt één milliliter verdunde cultuur toegediend aan elk van zes 0,45-micrometer polyvinylidienfluoride- of PVDF-filters.

Na het spoelen van eenrichtingskleppen met autoclavisch ultrazuiver water, bevestig je ze aan elk uiteinde van de filters. Verwijder de aluminiumfolie-kappen van de buiskoppelingen. Verbind elk filter met de peristaltische buiskoppelingen.

Stel de debiet in op twee milliliter per minuut op de peristaltische pomp. Plaats een afvalcontainer onder de filters om de afvoer op te vangen en start de stroom. Na twee uur koppel je een van de filters die op de eenliterfles zijn aangesloten, schroef je de eenrichtingskleppen los en plaats je het filter in een 50-milliliter centrifugebuis met de inlaat naar beneden gericht.

Centrifugeer op 2.000 G gedurende twee minuten. Met een gesteriliseerde pijpsnijder oefent je zachte druk uit aan het uitlaatuiteinde van de plastic behuizing om het filter te openen. Laat de binnenste cilinder los en gooi het membraanhoudende gedeelte weg.

Spoel de binnenwanden van de filterbehuizing af met het verzamelde kweekmedium. Meet het totale verzamelde volume met een serologische pipet van vijf milliliter. Neem drie aliquots van 100 microliter uit het monster en fixeer ze met glutaraldehyde tot een eindconcentratie van 1,5% Koppel de bijbehorende filters op latere tijdstipten en herhaal de verzamelprocedure.

Label de verzamelde monsters volgens hun respectievelijke tijdstippen. Label de monsters met de fluorescerende DNA-kleurstof en tel de cellen met flowcytometrie. In de loop van de tijd volgden de log 10 getransformeerde celtellingen lineaire trajecten, wat wijst op exponentiële groei onder alle omstandigheden.

De groeisnelheden waren ongeveer 0,88 per uur voor de 0,5%RDM-conditie, 0,64 per uur voor de 0,25%-conditie en 0,18% per uur voor de 0,01%-conditie. De celtellingen liepen op tot één miljard cellen per monster, wat aantoont dat het millifluidische continue kweekapparaat, of MCCD, zowel exponentiële groei als een hoge biomassaopbrengst bij nanomolaire tot micromolaire nutriëntenconcentraties ondersteunt. Cellen gekweekt in 0,5% RDM hadden een grotere gemiddelde cellengte dan cellen gekweekt in 0,01% RDM.

De grootste uitdaging bij teelt met weinig nutriënten is het behouden van voldoende celdichtheden om verstopping, drukopbouw en uitputting van voedingsstoffen te voorkomen. Na deze procedure kunnen cellen worden geoogst voor andere downstream-analyses, waaronder proteomica, metabolomica en andere omics-benaderingen. Toekomstige studies kunnen microbiële aanpassing aan nutriëntenbeperkingen en fluctuaties onderzoeken door dit protocol te integreren met een kwantitatieve omic-analyse.