Lysosomale profilering met LysoTracker voor kwantitatieve beoordeling van cellulaire senescentie bij menselijke fibroblasten

We bestuderen cellulaire senescentie en de karakterisering daarvan, met de nadruk op hoe kenmerken zoals lysosomale veranderingen als senescentiemarkers kunnen dienen. Conventionele senescentiemarkers zijn vaak eindpunt-gebaseerd en binair, terwijl live-cel beeldvorming senescentie kan lezen als een continu kwantitatief signaal onder verschillende omstandigheden. Om te beginnen zaait je IMR-90 fibroblasten in een 24-well plaat en incubeer je ze bij 37 graden Celsius in een 5% kooldioxide-incubator totdat ze een subconfluente monolaag vormen.

Noteer de zaaidichtheid en de tijd tussen platen en lysosomale kleuring voor elk experiment. Verwarm het hele cultuurmedium tot 37 graden Celsius. Bereid een 75 nanomolaire LysoTracker Deep Red werkoplossing voor in het medium en bescherm deze tegen licht.

Meng de werkoplossing door een zachte inversie. Selecteer gematchte pre-senescent en senescent IMR-90 fibroblastcohorten, bereid met een gedefinieerde senescentie-inductiemethode. Bevestig het senescente fenotype door groeikenmerken en morfologie te monitoren.

Aspiraat het verbruikte medium uit elke put. Voeg voorzichtig de LysoTracker-werkoplossing toe langs de wand van elke put, zodat verstoring van de monolaag wordt voorkomen. Incubeer de cellen met LysoTracker gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius in een incubator met 5% kooldioxide.

Tijdens de laatste 10 minuten van de LysoTracker-incubatie voeg je Hoechst 33342 direct toe aan de putten van de fabrikant die de werkconcentratie aanbeveelt en meng door de plaat voorzichtig te wiegen. Verwijder het kleurmedium aan het einde van de incubatie en spoel de cellen één keer af met voorverwarmde PBS om achtergrondfluorescentie te verminderen. Voeg direct na de spoeling voorverwarmde fenol-roodvrije kweekmedium toe.

Ga direct door met live cell imaging, waarbij de tijd van bufferuitwisseling tot data-acquisitie consistent blijft over alle putten. Label de parallelle putten in de kweekplaat voor beta-galactosidase kleuring om sterk senescent cellen te vergelijken met de pre-senescent controles. Volledige live-cell imaging voor de validatieputten vóór fixatie.

Noteer de coördinaten van de fase tijdens live imaging om dezelfde velden na fixatie te verplaatsen. Voeg de fixatieoplossing uit de senescence beta-galactosidase kleuringskit toe die 2% formaldehyde en 0,2% glutaraldehyde bevat. Bedek het bord met het deksel en laat het 10 tot 15 minuten op kamertemperatuur incuberen.

Verwijder het fixatiemiddel en spoel de putten twee keer af met PBS. Voeg vervolgens de beta-galactosidase kleuroplossing met het X-gal substraat bij pH 6 toe aan elke put. Sluit de plaat af met parafilm om verdamping tijdens de incubatie te beperken, en plaats de plaat 12 tot 16 uur in een droog broedapparaat bij 37 graden Celsius zonder kooldioxide.

Na fixatie en kleuring plaats je de plaat op het microscooppodium en verplaats je dezelfde beeldvelden met behulp van de opgenomen coördinaten. Inspecteer de putten onder een brightfield-microscoop en documenteer het kleurpatroon. Maak representatieve beelden voor elke aandoening en bepaal het aandeel senescentie-geassocieerde beta-galactosidase positieve cellen per put.

Senescente cellen vertoonden heldere, ruimtelijk uitgebreide paranucleaire lysosoomverrijkte gebieden, terwijl pre-senescent controles een lager algemeen signaal vertoonden met discrete punctate structuren. Senescente omstandigheden toonden een hoger aandeel bèta-gal positieve cellen dan pre-senescent controles. Er werd een sterke correlatie waargenomen tussen de intensiteit van LysoTracker en het door de senescentie geassocieerde bèta-gal positieve gebied over de replicatieve putten.

De gemiddelde LysoTracker-intensiteit binnen het positieve masker was hoger in senescente culturen dan in pre-senescent culturen, waardoor het de meest robuuste veldniveau-scheidsfactor tussen de twee condities is. De geïntegreerde LysoTracker-intensiteit per kern was ook hoger in senescente culturen in het getoonde representatieve veld. Dit protocol stelt onderzoekers in staat om lysosomale remodellering in levende cellen te meten, waardoor een kwantificeerbare single-cel uitlezing van de senescentiebelasting en progressie wordt geleverd.

Het is belangrijk om de kleurings- en beeldinstellingen identiek te houden in alle putten, aangezien intensiteitsvergelijkingen alleen binnen één sessie geldig zijn. Toekomstige studies kunnen deze procedure uitbreiden naar driedimensionale modellen, extra celtypen en validatie over verschillende microscoopsystemen en workflows.