Name: Lysosomale profilering met LysoTracker voor kwantitatieve beoordeling van cellulaire senescentie bij menselijke fibroblasten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-17T12:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 40 s
Description: Leer lysosomale profilering met LysoTracker Deep Red voor kwantitatieve beoordeling van cellulaire senescentie in levende IMR-90 menselijke longfibroblasten. Deze methode biedt een praktische, indirecte maatstaf voor senescentiebelasting.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<table><tbody><tr><td>24-well tissue culture plate (flat bottom, TC-treated)</td><td>CellTreat Scientific Products</td><td>229124</td><td>Elke heldere-bodem multi-well kweekplaat die compatibel is met live-cel fluorescentie beeldvorming (bijv. 6-, 12-, of 24-well TC-behandelde polystyreen platen; glasbodem beeldvorming platen kunnen de voorkeur worden gegeven voor hogere resolutie beeldvorming).</td></tr><tr><td>Beta-galactosidase kleuringskit (senescentie assay)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9860</td><td>Elke commerciële SA-β-galactosidase kit met geverifieerde kleuringsbuffer op pH 6.0. Ter referentie bevat de fixatieoplossing 2% formaldehyde en 0,2% glutaaraldehyde in PBS, en de kleuringsoplossing bevat 1 mg/mL X-gal in DMF, 40 mM citraat/fosfaat pH 6.0, 5 mM kaliumferrocyanide, 5 mM kaliumferricyanide, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2.</td></tr><tr><td>BioRender (wetenschappelijke illustratie software)</td><td>BioRender</td><td>N/A &mdash; web applicatie</td><td>Gebaat om schematische figuren te maken (Figuren 1&ndash;3). https://www.biorender.com</td></tr><tr><td>Koolstofdioxide gas (CO2), gecomprimeerde cilinder</td><td>Airgas (of soortgelijke leverancier)</td><td>N/A</td><td>Medisch kwaliteits CO2 gebruikt om een 5% atmosfeer te handhaven in celkweek incubator en on-stage beeldvormingskamer.</td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum (FBS), warmte-geïnactiveerd</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10082147</td><td>Elk celkweek-kwaliteit FBS, warmte-geïnactiveerd bij 56 &deg;C; gebruikt bij 10% v/v in compleet kweekmedium.</td></tr><tr><td>Fluorescentie microscoop met live-cel mogelijkheid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMF7000</td><td>Elke widefield of confocale fluorescentie microscoop met live-cel temperatuur en CO2 controle, filtersets voor far-red (excitatie ~647 nm / emissie ~670 nm) en DAPI/Hoechst (excitatie ~405 nm / emissie ~460 nm) kanalen, en een 20&times;-40&times; objectief met voldoende NA voor het oplossen van lysosomale kenmerken. De EVOS M7000 Imaging System werd gebruikt in deze studie.</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 nucleaire kleuring</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td>Cel-doorlaatbare DNA kleurstof voor live-cel nucleaire kleuring (blauwe fluorescentie, excitatie ~405 nm). Niet verwisselbaar met DAPI, dat niet cel-doorlaatbaar is onder fysiologische omstandigheden.</td></tr><tr><td>Beeldanalyse software</td><td>Python Software Foundation</td><td>N/A</td><td>Elke wetenschappelijke computing omgeving die nucleus segmentatie, nucleus-naar-cel gebiedsuitbreiding, intensiteitsdrempelstelling en basis beeld statistieken ondersteunt (bijv. Python met scikit-image, MATLAB, ImageJ/Fiji, CellProfiler). De SenTrack pipeline (zie Aanvullend Bestand S1) werd ontwikkeld voor deze studie.</td></tr><tr><td>IMR-90 menselijke long fibroblasten (cel lijn)</td><td>ATCC</td><td>CCL-186</td><td>Normale humane foetale long diploïde fibroblasten cel lijn gebruikt om replicatieve senescentie te modelleren; elke soortgelijk gekarakteriseerde humane fibroblasten lijn mag worden vervangen.</td></tr><tr><td>LysoTracker Deep Red</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>L12492</td><td>Acidotroop fluorescentie kleurmiddel voor live-cel kleuring van zure organellen; geleverd als 1 mM stock in DMSO. Werkconcentratie is 75nM in bereide celkweek media.&nbsp; Far-red emissie (ex 647 nm / em 668 nm) minimaliseert overlap met lipofuscine autofluorescentie maar elimineert deze niet.</td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium (MEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>11-095-080</td><td>Basmaal kweekmedium voor IMR-90 fibroblasten; aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine. Elke standaard formulering van Eagle's Minimum Essential Medium met Earle's zouten en L-glutamine mag worden vervangen.</td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine oplossing (100&times;)</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>15140122</td><td>Antibioticum supplement voor compleet kweekmedium; gebruikt bij 1% v/v (eindconcentratie 100 U/mL penicilline, 100 μg/mL streptomycine). Elke standaard pen-strep oplossing mag worden vervangen.</td></tr><tr><td>Fenol rood-vrij beeldvormingsmedium</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>A1896701</td><td>Fenol rood-vrij DMEM of HBSS gebruikt voor live-cel beeldvorming om achtergrond fluorescentie tijdens acquisitie te verminderen. FluoroBrite DMEM is een veelgebruikte optie; elk fenol rood-vrij beeldvormingsbuffer aangevuld met 10% FBS mag worden vervangen.</td></tr><tr><td>Fosfaat-gebufferd zout (PBS), pH 7.4 (1&times;)</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10010023</td><td>Isotone buffer voor cel wassen en reagens verdunning; elke steriele 1&times; PBS bij pH 7.4 mag worden vervangen.</td></tr><tr><td>SenTrackLite v0.5.0 (software)</td><td>Open-Source (Estrada / Melendez Lab)</td><td>v0.5.0</td><td>Open-source enkele-bestand Python / Tkinter applicatie voor lysosomale senescentie beeldanalyse. Gedistribueerd als Aanvullend Bestand S1. Gearchiveerd bij Zenodo, doi:10.5281/zenodo.19701255. MIT licentie. Bron: https://github.com/goldbader-hub/Sentrack</td></tr><tr><td>Stage-top omgevingskamer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMC2000</td><td>Omgevingskamer voor on-microscoop live-cel beeldvorming met temperatuur (37 &deg;C) en CO2 (5%) controle. De EVOS Onstage Incubator werd gebruikt in deze studie; elke gelijkwaardige stage-top incubator mag worden vervangen.</td></tr></tbody></table>

lysosomale profilering met lysotracker voor kwantitatieve beoordeling van cellulaire senescentie bij menselijke fibroblasten

Lysosomal Profiling With LysoTracker For Quantitative Assessment of Cellular Senescence In Human Fibroblasts

Lysosomale profilering met LysoTracker voor kwantitatieve beoordeling van cellulaire senescentie bij menselijke fibroblasten

Cellular senescence is a stable cell-cycle arrest state associated with characteristic phenotypes, including enlarged cell morphology, altered secretory ...

lysosomal-profiling-with-lysotracker-for-quantitative-assessment

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video illustrates a flow cytometry-based assay for quantifying therapy-induced senescent cancer cells with dual senescence markers. The detection and quantification of senescent cells involve using a β-galactosidase substrate. The substrate is cleaved by active lysosomal β-galactosidase within the senescent cells, producing a fluorescent product that, in conjunction with autofluorescent lipofuscin granules, marks the senescent cancer cells.

Flow Cytometry-Based Quantification of Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Of veroudering voorkomt of bevordert het ontstaan ​​van tumoren blijft controversieel. Sinds chemotherapeutische drugs kankercellen ertoe kunnen bewegen senesce, studeren veroudering is essentieel voor het voorstellen van nieuwe therapieën. De standaard en breed gebruikt β-galactosidase test geeft belangrijke nadelen. We stellen hier een snelle en gevoelige flowcytometrie gebaseerde bepaling senescentie kwantificeren.

Een gevoelige methode om Senescent kankercellen kwantificeren

Cellular veroudering, de onomkeerbare toestand van de celcyclus, kan worden geïnduceerd door verschillende cellulaire stress. Hier beschrijven we protocollen bij cellulaire veroudering en methoden ertoe te brengen markers van veroudering te beoordelen.

Technieken voor het induceren en te kwantificeren Cellulaire senescentie

Hier bespreken we een serie van protocollen voor de inductie en validatie van cellulaire senescentie in gekweekte cellen. Wij richten op verschillende senescentie-inducerende prikkels en de kwantificering van gemeenschappelijke senescentie-geassocieerde markers te beschrijven. Wij bieden technische details met behulp van fibroblasten als een model, maar de protocollen kunnen worden aangepast aan verschillende cellulaire modellen.

Inductie en validatie van cellulaire senescentie in primaire menselijke cellen

Intracellulaire ROS heeft aangetoond dat een belangrijke rol spelen in de inductie van cellulaire senescentie. Hier beschrijven we een gevoelige assay voor het kwantificeren van ROS niveaus tijdens cellulaire senescentie. We bieden ook protocollen voor de beoordeling van het senescentie-geassocieerde secretoire fenotype, die naar verluidt aan verschillende leeftijdsgebonden disfuncties bijdraagt.

Een kwantitatieve meting van reactieve zuurstof soorten en senescentie-geassocieerde secretoire fenotype in normale menselijke fibroblasten tijdens oncogen-geïnduceerde senescentie

Cellulaire senescentie is de belangrijkste factor in de ontwikkeling van chronische leeftijdsgebonden pathologieën. Identificatie van therapeutische middelen die gericht zijn op senescentie cellen tonen belofte voor het verlengen van gezonde veroudering. Hier presenteren we een nieuwe assay voor de identificatie van senotherapeutica op basis van meting van senescentie geassocieerde β-galactosidase activiteit in enkelvoudige cellen.

Op SA-β-galactosidase gebaseerde screeningstest voor de identificatie van Senotherapeutische geneesmiddelen

Dit protocol beschrijft de workflow voor metabole etikettering van senescente en niet-delende cellen met gepulste SILAC, ongerichte massaspectrometrie-analyse en een gestroomlijnde berekening van eiwithalfwaardetijden.

Meting van eiwitomloopsnelheden in senescente en niet-delende gekweekte cellen met metabole etikettering en massaspectrometrie

Hier presenteren we een op flowcytometrie gebaseerde methode voor visualisatie en kwantificering van meerdere senescentie-geassocieerde markers in enkele cellen.

Gelijktijdige beeldvorming en flowcytometrie-gebaseerde detectie van meerdere fluorescerende senescentiemarkers in therapie-geïnduceerde senescente kankercellen

Een protocol voor fluorescerende, flowcytometrische kwantificering van senescente kankercellen geïnduceerd door chemotherapiegeneesmiddelen in celkweek of in muizentumormodellen wordt gepresenteerd. Optionele procedures omvatten co-immunostaining, monsterfixatie om grote batch- of tijdpuntanalyse te vergemakkelijken en de verrijking van levensvatbare senescente cellen door flowcytometrische sortering.

Verrode fluorescentie-geassocieerde β-galactosidase-sonde voor identificatie en verrijking van senescente tumorcellen door flowcytometrie

Multiplexed immunofluorescentie maakt sequentiële labeling van meerdere antilichaammarkers binnen één weefselsectie mogelijk om ruimtelijke analyse van weefselarchitectuur en celpopulaties te ondersteunen. Hier wordt een workflow gepresenteerd voor multiplexdetectie van senescentie-geassocieerde, structurele en immuunmarkers, inclusief handmatige en geautomatiseerde preparat, iteratieve beeldvorming en single-cell analyse met behulp van digitale pathologiesoftware.

Multiplexed Immunofluorescentietest voor ruimtelijke beoordeling van senescence-markers in vivo

Dit protocol biedt gereflecteerd licht confocale microscopie voor objectieve, enkelceldetectie van senescence-geassocieerde bèta-galactosidase (SA-β-gal) activiteit in de stromale vasculaire fractie die is geïsoleerd uit menselijk vetweefsel. De methode is compatibel met immunocytochemie, bevat pH-controles voor kwantitatieve beoordeling en biedt bovendien een gevoeliger en minder subjectief alternatief voor conventionele SA-β-gal kleuring.

Senescentiedetectie met behulp van gereflecteerd licht in de vetachtige stromale vaatfractie

Leer lysosomale profilering met LysoTracker Deep Red voor kwantitatieve beoordeling van cellulaire senescentie in levende IMR-90 menselijke longfibroblasten. Deze methode biedt een praktische, indirecte maatstaf voor senescentiebelasting.

Lysosomale profilering met LysoTracker voor kwantitatieve beoordeling van cellulaire senescentie bij menselijke fibroblasten

Meer video's verkennen