Identificatie van potentiële anti-TB-kandidaten: Een stapsgewijze gids voor synthese, MIC-bepaling en cytotoxiciteitsbeoordeling in zoogdiercellen

De focus van ons onderzoek ligt op de ontwikkeling en validatie van nieuwe anti-tuberculosemedicijnkandidaten die gericht zijn op het bevorderen van therapeutische strategieën. De preventieve fenotypische screeningspijplijn kan worden gebruikt bij het zoeken naar nieuwe geneesmiddelen tegen mycobacterium tuberculosis-stammen. Verzamel om te beginnen de benodigde reagentia en ga verder met het bereiden van het reactiemengsel met de gegeven verhoudingen.

Roer het reactiemengsel 16 uur op 85 graden Celsius. Gebruik een roterende verdamper om het oplosmiddel te verwijderen. Voeg ongeveer 20 milliliter verzadigde natriumbicarbonaatoplossing toe aan het residu.

Filter deze suspensie met een 11 micrometer cellulose kwalitatief filterpapier om de restvaste stoffen op te vangen. Los de restvaste stoffen op in 50 milliliter chloroform. Gebruik een scheidingstrechter om de chloroformoplossing drie keer te spoelen met 15 milliliter water.

Elke keer verwijder ik de waterlaag. Voeg anhydre natriumsulfaat toe aan de organische fase om het resterende water te verwijderen en het te drogen. Na het verdampen van het oplosmiddel was je het resulterende groene vaste stof vier keer met 10 milliliter heet hexaan bij ongeveer 50 graden Celsius.

Voeg één milligram Verbinding 6 toe aan één milliliter van een één-op-één mengsel van acetonitril en methanol om een voorraadoplossing te maken. Verdun de voorraadoplossing tot 0,5 milligram per milliliter en filter deze voordat je deze analyseert. Laad het monster in het HPLC-systeem.

Gebruik chromatografie-dataverzamelsoftware om de data te verzamelen en te verwerken. Stel de chromatografische methode in op een 250 bij 4,6 millimeter omgekeerde fase C18-kolom met deeltjesgrootte vijf micrometer. Stel de debiet in op 1,5 milliliter per minuut en stel UV-detectie in op 254 nanometer.

Stel een gradiënt op zoals gepresenteerd met geprogrammeerde veranderingen in de mobiele fasecompositie. Breng ongeveer 15 tot 20 milligram verbinding 6 over in een kernmagnetische resonantie- of NMR-buis. Los het op in een passend volume van DMSOD6.

Zodra de verwervingsparameters zijn ingesteld zoals gepresenteerd, verkrijg je het proton NMR-spectrum met behulp van een standaard pulssequentie. Pas de acquisitieparameters aan. Start het proton- en koolstof-13 NMR-spectrum en rapporteer chemische verschuivingen in delen per miljoen.

Visualiseer en verwerk de NMR-gegevens met het vrije inductievervalbestand dat uit het experiment is verkregen. Voor chromatografie-gebaseerde zuivering van Verbinding 6, vul een kolom met silicagel. Laad de ruwe Compound 6 op de kolom.

Eluteer de verbinding en verzamel fracties. Monitor de fracties met dunne laagchromatografie en combineer de fracties die het zuivere product bevatten. Voeg 100 microliter 7H9-bouillon aangevuld met 10% albumine-dextrose catalase of ADC toe aan kolom 12 van de 96-well plaat.

Vervolgens breng je 100 microliter 7H9-bouillon met 10% ADC en 5% DMSO over naar kolom 11. En dan opeenvolgend van kolom negen naar één. Voeg 200 microliter van de verbindingsoplossing toe aan kolom 10, waarbij je één rij per verbinding toewijst.

Pipetteer 100 microliter van de samengestelde oplossing met twee keer de hoogste testconcentratie naar kolom 12 van de 96-wellplaat plaat. Draag 100 microliter over van kolom 10 naar kolom negen en meng goed door te pipetten om een tweevoudige graanverdunning te starten. Ga de seriële verdunning sequentieel voort tot kolom één.

Voeg 100 microliter van de bacteriële suspensie van mycobacterium tuberculosis achtereenvolgens toe van kolom 11 naar kolom één en bedek de plaat. Sluit de plaat af met parafilm en incubeer zeven dagen bij 37 graden Celsius. Voeg vervolgens 60 microliter 0,01% resazurineoplossing toe aan elke put van de plaat en bedek deze af.

Sluit de plaat af met parafilm en incubeer deze 48 uur bij 37 graden Celsius. Controleer daarna op de kleurverandering van blauw naar roze. Bereid een werkoplossing voor van 0,5 milligram per milliliter MTT in serumvrije DMEM.

Laat Vero- en HEPG2-cellen behandeld met Verbinding 6 gedurende 48 uur en inspecteer deze om de behandelingseffecten te beoordelen. Aspireer het medium van de platen en voeg 50 microliter MTT-werkoplossing toe aan elke put onder lage omgevingslichtomstandigheden. Na een incubatie van drie uur voeg je 100 microliter DMSO toe aan elke put om de Formazan-kristallen onder lage omgevingslichtomstandigheden op te lossen.

Plaats de plaat op een orbitale shaker op 100 toeren per minuut gedurende 15 minuten, terwijl je hem beschermt tegen licht. Inspecteer de controleputten om volledige kristaloplossing te bevestigen. Plaats de plaat in een microplaatlezer.

Stel de referentiegolflengte in van 630 tot 690 nanometer en controleer de absorptie op 570 nanometer. Bereid een neutrale rode werkoplossing van 40 microgram per milliliter voor in serumvrije DMEM. Bereid vervolgens de neutrale rode desorptieoplossing voor met 1% glaciale azijnzuur, 49% ethanol en 50% ultrazuiver water per volume.

Zodra het effect van verbinding 6 op Vero- en HEPG2-cellen is beoordeeld, verwijder je het medium en voeg je 100 microliter van de gefilterde neutrale rode werkoplossing toe aan elke put. Incubeer de plaat twee uur bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide. Spoel na het verwijderen van de neutrale rode werkoplossing elke keer goed af met 150 microliter steriele PBS.

Voeg 150 microliter van de neutrale rode desorptieoplossing toe aan elke put. Plaats de plaat op een orbitale shaker op 150 toeren per minuut gedurende 15 minuten om de kleurstof te verwijderen. Controleer de controleputten om de volledige kleurstofextractie te bevestigen.

Meet de absorptie op 540 nanometer met een microplaatlezer. Het HPLC-chromatogram toonde aan dat verbinding 6 een retentietijd van 14,11 minuten had en een zuiverheid van 99%. Het proton-NMR-spectrum toonde karakteristieke signalen voor de piperidinegroep tussen 1,50 en 3,13 delen per miljoen. Een methylsinglet met 2,38 delen per miljoen.

En aromatische signalen, waaronder dubbelen van 6,97 en 7,17 delen per miljoen en een multiplet van 7,63 tot 7,75 delen per miljoen. Het koolstof 13 NMR-spectrum toonde een methylkoolstofsignaal van 23,81 delen per miljoen, en piperidine-gerelateerde signalen tussen 24,85 en 49,70 delen per miljoen. De MTT-plaat toonde een duidelijke kleurgradiënt over de verbindingsconcentraties, wat aangeeft dat cytotoxiciteit het hoogst was bij hoge verbindingconcentraties bij doorschijnende putten en het laagst bij lage verbindingen bij diepe paarse putten.

De neutraal rode opnameplaat toonde een duidelijke kleurgradiënt over de verbindingsgroepen, wat aangeeft dat cytotoxiciteit het hoogst was bij hoge verbindingsconcentraties met doorschijnende putten en het laagst bij lage verbindingsconcentraties met dieproze putten. Dit protocol vormt een pijplijn voor de ontwikkeling van medicijnkandidaten tegen tuberculose op basis van fenotypische screening. Het is belangrijk om bij het toepassen van het protocol rekening te houden met en te evalueren hoe laag de opgeloste kwaliteit van de gesynthetiseerde verbindingen is.

Dit onderzoek kan dienen als basis voor toekomstige biobeschikbaarheid, macrofageninfecties en in vivo studies.