Een methode om Euglena gracilis aan cassave-gebaseerde substraten voor heterotrofe teelt aan te passen

Ons onderzoek richt zich op het aanpassen van nieuwe Euglena gracilis-bladeren aan cassaveafval en het bestuderen van groei, cyanide-reductie en eiwitrijke biomassaproductie. Dit protocol kan worden toegepast bij duurzame cassaveverwerking, het waarderen van landbouwafval, de productie van voedervoer en goedkope biotechnologiesystemen. Begin met het labelen van steriele 500-milliliter ventilatiedoppen met het substraattype garri.

Markeer de juiste doelconcentratie op de fles. Label de fles met de replicatieve identificatie en geplande sterilisatieconditie als autoclaaf of niet-autoclaved. Plaats een weegboot op de analytische balans.

Na het indrukken van tare weeg je de garri zodat het uiteindelijke werkvolume overeenkomt. Voeg de gewogen garri aseptisch toe aan een steriele 500-milliliter fles met 300 milliliter gedeïoniseerd of gedestilleerd water. Breng de geventileerde dop opnieuw aan op elke kolf.

Meng elke suspensie drie minuten totdat het mengsel gehomogeniseerd is. Als magnetisch roeren wordt gebruikt, plaats je de kolf op een roerplaat en stel je de snelheid in op 200G om een ondiepe vortex te vormen zonder te spetteren. Laat de suspensie 10 minuten ongestoord hydrateren bij 25 graden Celsius.

Draai de ventilatiedop direct voor fermentatie strak aan en draai de kolf met de hand vijf keer om het mengsel voorzichtig te homogeniseren en het bezonken materiaal opnieuw te laten ophangen. Om extra cassave-product te bereiden, labelen de flesjes en wegen de substraat zoals eerder aangetoond om 30 gram per liter te bereiken op basis van het werkvolume. Voeg het gewogen substraat aseptisch toe aan een steriele kolf met 300 milliliter gedeïoniseerd of gedestilleerd water.

Breng de geventileerde dop opnieuw aan op elke kolf. Hydrateer en meng de suspensie zoals eerder aangetoond. Controleer of de flessen zijn uitgerust met een steriele, gasdoorlatende ventilatiedop om gasuitwisseling mogelijk te maken en milieuvervuiling te minimaliseren.

Plaats de kolven rechtop bij 25 graden Celsius op een aangewezen plek, weg van direct zonlicht en druk verkeer, en breng de flessen uit zonder onrust gedurende minimaal 72 uur. Noteer de startdatum en -tijd van de fermentatie voor elke kolf en conditie. Controleer of elke 500-milliliter kolf na fermentatie niet meer dan 300 milliliter vloeistof bevat om overkook tijdens sterilisatie te voorkomen.

Zodra de geventileerde dop losgemaakt is tot een vingerstrakke positie, breng je autoclave-indicatortape op de kolf. Na het laden van de flessen in een autoclave-veilige tray, plaats je de tray in de autoclaaf en selecteer je de P13 vloeistofcyclus. Stel de sterilisatieparameters in op 121 graden Celsius gedurende 30 minuten voor vloeibare sterilisatie.

Start de autoclavecyclus. Laat na voltooiing van de cyclus de druk van de autoclaafkamer terugkeren naar atmosferische druk en open de autoclavedeur langzaam. Gebruik hittebestendige handschoenen, haal de flessen weg en laat ze afkoelen tot kamertemperatuur.

Bewaar de gekoelde flessen een nacht op kamertemperatuur vóór de inoculatie. Gebruik het gefermenteerde cassavemedium direct zonder autoclavatie om inheemse microbiële gemeenschappen te behouden. Inoculeer het niet-autoclaveerde medium direct na de 72-uur fermentatieperiode om onbedoelde milieuvervuiling te minimaliseren.

Houd consistente behandeling over replica's door hetzelfde type 500-milliliter geventileerde dopkolven te gebruiken, hetzelfde werkvolume en dezelfde fermentatieduur voor alle substraatcondities. Inoculeer Euglena gracilis in een vers heterotrofe voedingsmedium. Bred de culturen uit in volledige duisternis bij 28 graden Celsius met continu orbitale schuddingen bij 120G totdat de culturen de mid-logaritmische groei bereiken.

Met een compound light microscoop in brightfield-modus wordt de culturen onderzocht bij een totale vergroting van 100x tot 400x en wordt de actieve motiliteit, verlengde celmorfologie en lage niveaus van aandringen bevestigd. Sluit culturen uit die overmatig cellulair afval, abnormale morfologie of verhoogde aandringen vóór aanpassingsexperimenten vertonen. Na het voorzichtig homogeniseren van de starterculturen door de ventilatiedop aan te draaien, draai je de kolven met de hand gedurende 15 seconden om een gelijkmatige celverdeling te garanderen zonder enorme spanning te veroorzaken.

Met een Neubauer-hemocytometer bepaal je de celdichtheid. Zodra de cultuur is gemengd door de kolf 15 seconden te draaien, pipetteer je één milliliter cultuur in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Maak de hemocytometer en de deksel schoon met 70% ethanol en laat de hemocytometer en de deksel aan de lucht drogen.

Pipette 10 microliter kweek op de twee roosters van de hemocytometer en plaats de deksel op het natte monster. Met brightfield-microscopie en een 10x-objectief richt je je op het raster en tel je de cellen binnen een gedefinieerde set vierkanten op het grote raster door de standaard grensregels toe te passen. Herhaal de celtellingen in de tweede kamer en bereken het gemiddelde aantal cellen per milliliter en de celdichtheid.

Pas de inoculatievolumes aan om een uiteindelijke inoculum van 5% volume per volume te bereiken in alle experimentele media. Bereid aparte inocula voor elke behandelingsconditie om consistente initiële celdichtheden tussen experimentele groepen te behouden. Voeg het bereide E. gracilis inoculum toe aan geautoclaveerde en niet-autoclaveerde cassavemedia, bereid bij uiteindelijke garriconcentraties van 10, 20 en 30 gram per liter.

Gebruik gelijke inoculatievolumes over alle behandelingscondities om de initiële celdichtheid te standaardiseren. Na het aandraaien van de geventileerde dop draai je de kolf voorzichtig in een cirkelvormige beweging gedurende 15 seconden om de cellen te verdelen. Bred de culturen uit in volledige duisternis bij 25 graden Celsius om heterotrofe groei te initiëren.

Minimaliseer de beweging van het niet-autoclaveerde medium om de structuur van de inheemse microbiële gemeenschap en de stratificatie van het substraat te behouden. Meng alle culturen eenmaal per dag met voorzichtig handmatig draaien gedurende 15 seconden om contact te houden tussen E. gracilis-cellen en het suspendeerde cassavemateriaal. Met een steriele pipettip wordt elke 48 uur aseptisch één milliliter monsters van elke cultuur genomen.

Draai de geventileerde dop strak aan en draai de kweekkolf voorzichtig 15 seconden voordat je bemonstert om een gelijkmatige verdeling van cellen en suspente materialen te garanderen. Na het overbrengen van een aliquot van cultuur in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 milliliter, verdun je het monster met gedeïoniseerd water indien nodig om de visualisatie van individuele cellen te verbeteren. Bereid een natmontering microscopieglaasje voor door 10 microliter van het verdund monster op een schone microscoopglaasje te pipetteren en het monster af te dekken met een deksel.

Met een samengestelde lichtmicroscoop in brightfield-modus wordt de monsters onderzocht bij een totale vergroting van 100x tot 400x en wordt celmotiliteit, morfologie en frequentie van aandringen beoordeeld als indicatoren van adaptatiestatus. Elke zeven dagen wordt 20% volume per volume van elke cultuur aseptisch overgebracht naar vers bereide cassavemedia met dezelfde garri-concentratie en sterilisatieomstandigheden. Houd consistente overdrachtsvolumes tussen passages en herhaal seriële passaging totdat de culturen consistente groei, aanhoudende motiliteit en lage aandringingsfrequentie vertonen in 30 gram cassavemedium per liter.

Na adaptatie van hoge concentratie cassave en vergelijkende groeianalyse gebruik je colorimetrische stroken om cyanideniveaus te beoordelen en de ontwikkelde kleur te observeren. Na centrifugatie oogst je biomassa voor downstream analyse. Onder volledig donkere teeltomstandigheden vertoonden culturen met 30 gram garri per liter een hogere geïntegreerde groei dan lagere concentraties.

Lagere garriconcentraties van 10 tot 20 gram per liter vertoonden detecteerbare maar verminderde en meer variabele groei. Hogere concentraties van 40 tot 50 gram per liter bereikten verhoogde piekceldichtheden, maar vertoonden vertraagde stabilisatie en grotere variabiliteit. Trypan blue exclusion-assays gaven aan dat culturen die werden gehandhaafd op 30 gram per liter garri een hoge levensvatbaarheid behielden over de bemonsterde tijdstippen.

Hogere garri-concentraties toonden tijdelijke afnames in levensvatbaarheid, gevolgd door gedeeltelijk herstel met verhoogde variabiliteit in de loop van de tijd. Positieve uitkomsten omvatten afgeronde of semi-geïnstaldeerde cellen met verminderde motiliteit die intact bleven bij herhaald subculturatie. Aangepaste E. gracilis-culturen vertoonden reproduceerbare groei over meerdere substraattypen en vertoonden eerdere stabilisatie met verminderde achteruitgang in het late stadium ten opzichte van wildtype-culturen.

Succesvolle implementatie van het protocol leverde E. gracilis-biomassa op met meetbaar ruwe eiwitgehalte, gekwantificeerd door externe laboratoriumanalyse met behulp van de verbrandingsmethode van Dumas. De eiwitpercentages waargenomen in aangepaste culturen waren vergelijkbaar met die gemeten in wildtype-culturen, met een hogere totale eiwitproductie die overeenkwam met een verhoogde biomassa-accumulatie. Dit protocol stelt onderzoekers in staat om de groei van Euglena, cyanide-reductie, biomassaproductie en voedingspotentieel in verschillende cassave-gebaseerde omgevingen te bestuderen.

De cruciale uitdaging bij dit protocol is het behouden van een stabiele temperatuur, consistente kweekomstandigheden en een evenwichtige microbiële gemeenschap voor Euglena-groei. Toekomstige studies kunnen dit protocol optimaliseren en opschalen, de eiwitopbrengst verbeteren en verschillende industriële toepassingen testen met diverse cassaveafvalstromen op grote schaal.