Name: Celvrije in vitro mRNA-translatie in Drosophila-lysaten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-12T15:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Leer celvrije mRNA-translatie in Drosophila-embryolysaten voor onderzoek naar eiwitbiosynthese en translationele controle. Dit protocol ondersteunt meerdere Drosophila-soorten en biedt waardevolle inzichten voor moleculair biologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<ol>
	<li>Marygold SJ, Attrill H, Lasko P. The translation factors of Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 2017;11(1):65-74.</li>
	<li>Hern&#225;ndez G, Vazquez-Pianzola P. eIF4E as a molecular wildcard in metazoans RNA metabolism. Biol Rev Camb Philos Soc. 2023;98(6):2284-306.</li>
	<li>Kong J, Lasko P. Translational control in cellular and developmental processes. Nat Rev Genet. 2012;13(6):383-94.</li>
	<li>Bayer LV, Milano SN, Bratu DP. The mRNA dynamics underpinning translational control mechanisms of Drosophila melanogaster oogenesis. Biochem Soc Trans. 2024;52(5):2087-99.</li>
	<li>Filipowicz W, et al. A protein binding the methylated 5&#8242;-terminal sequence, m7GpppN, of eukaryotic messenger RNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 1976;73(5):1559-63.</li>
	<li>Sondermeijer PJA, Lubsen NH. Heat-shock peptides in Drosophila hydei and their synthesis in vitro. Eur J Biochem. 1978;88(2):331-9.</li>
	<li>Hern&#225;ndez G, Vazquez-Pianzola P, Sierra JM, Rivera-Pomar R. Internal ribosome entry site drives cap-independent translation of reaper and heat shock protein 70 mRNAs in Drosophila embryos. RNA. 2004;10(11):1783-97.</li>
	<li>Zapata JM, Mart&#237;nez MA, Sierra JM. Purification and characterization of eukaryotic polypeptide chain initiation factor 4F from Drosophila melanogaster embryos. J Biol Chem. 1994;269(27):18047-52.</li>
	<li>Maroto FG, Sierra JM. Purification and characterization of mRNA cap-binding protein from Drosophila melanogaster embryos. Mol Cell Biol. 1989;9(5):2181-90.</li>
	<li>Andrews S, Snowflack DR, Clark IE, Gavis ER. Multiple mechanisms collaborate to repress nanos translation in the Drosophila ovary and embryo. RNA. 2011;17(5):967-77.</li>
	<li>Smibert CA, et al. Smaug, a novel and conserved protein, contributes to repression of nanos mRNA translation in vitro. RNA. 1999;5(12):1535-47.</li>
	<li>Gebauer F, et al. Translational control of dosage compensation in Drosophila by Sex-lethal: cooperative silencing via the 5&#8242; and 3&#8242; UTRs of msl-2 mRNA is independent of the poly(A) tail. EMBO J. 1999;18(21):6146-54.</li>
	<li>Pamudurti NR, et al. Translation of circRNAs. Mol Cell. 2017;66(1):9-21.e7.</li>
	<li>V&#225;zquez-Pianzola P, Hern&#225;ndez G, Suter B, Rivera-Pomar R. Different modes of translation for hid, grim and sickle mRNAs in Drosophila. Cell Death Differ. 2007;14(2):286-95.</li>
	<li>Hern&#225;ndez G, et al. Two functionally redundant isoforms of Drosophila eIF4B are involved in cap-dependent translation, cell survival and proliferation. Eur J Biochem. 2004;271(14):2923-36.</li>
	<li>Hern&#225;ndez G, et al. Functional analysis of the AUG initiator codon context reveals novel conserved sequences that disfavor mRNA translation in eukaryotes. Nucleic Acids Res. 2024;52(3):1064-79.</li>
	<li>Tuschl T, et al. Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro. Genes Dev. 1999;13(24):3191-7.</li>
	<li>Scott MP, Storti RV, Pardue ML, Rich A. Cell-free protein synthesis in lysates of Drosophila melanogaster cells. Biochemistry. 1979;18(8):1588-94.</li>
	<li>Clark IE, Wyckoff D, Gavis ER. Synthesis of the posterior determinant Nanos is spatially restricted by a novel cotranslational regulatory mechanism. Curr Biol. 2000;10(20):1311-4.</li>
	<li>Jeske M, et al. Rapid ATP-dependent deadenylation of nanos mRNA in a cell-free system from Drosophila embryos. J Biol Chem. 2006;281(35):25124-33.</li>
	<li>Jeske M, Moritz B, Anders A, Wahle E. Smaug assembles an ATP-dependent stable complex repressing nanos mRNA translation at multiple levels. EMBO J. 2011;30(1):90-103.</li>
	<li>Castagnetti S, Hentze MW, Ephrussi A, Gebauer F. Control of oskar mRNA translation by Bruno in a novel cell-free system from Drosophila ovaries. Development. 2000;127(5):1063-8.</li>
	<li>Gebauer F, Hentze MW. Studying translational control in Drosophila cell-free systems. Methods Enzymol. 2007;429:23-33.</li>
	<li>Hern&#225;ndez G, et al. Mextli is a novel eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein that promotes translation in Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol. 2013;33(15):2854-64.</li>
	<li>Lie YS, Macdonald PM. In vitro translation extracts prepared from Drosophila ovaries and embryos. Biochem Biophys Res Commun. 2000;270(2):473-81.</li>
	<li>Peng Y, Gavis ER. The Drosophila hnRNP F/H homolog Glorund recruits dFMRP to inhibit nanos translation elongation. Nucleic Acids Res. 2022;50(12):7067-83.</li>
	<li>Sanders MM, Triemer DF, Olsen AS. Regulation of protein synthesis in heat-shocked Drosophila cells: soluble factors control translation in vitro. J Biol Chem. 1986;261(5):2189-96.</li>
	<li>Storti RV, Scott MP, Rich A, Pardue ML. Translational control of protein synthesis in response to heat shock in Drosophila melanogaster cells. Cell. 1980;22(3):825-34.</li>
	<li>Kr&#252;ger C, Benecke BJ. In vitro translation of Drosophila heat-shock and non-heat-shock mRNAs in heterologous and homologous cell-free systems. Cell. 1981;23(2):595-603.</li>
	<li>Zhao F, Yu CH, Liu Y. Codon usage regulates protein structure and function by affecting translation elongation speed in Drosophila cells. Nucleic Acids Res. 2017;45(14):8484-92.</li>
	<li>Roy G, et al. The Drosophila poly(A) binding protein-interacting protein, dPaip2, is a novel effector of cell growth. Mol Cell Biol. 2004;24(3):1143-54.</li>
	<li>Wakiyama M, Yokoyama S. Posttranscriptional control of protein synthesis in Drosophila S2 cell-free system. Methods Mol Biol. 2014;1118:257-66.</li>
	<li>Spirin AS, Swartz JR. Cell-free protein synthesis systems: historical landmarks, classification, and general methods. In: Spirin AS, Swartz JR, editors. Cell-free protein synthesis. Weinheim: Wiley-VCH; 2008. p. 1-34.</li>
	<li>Gregorio NE, Levine MZ, Oza JP. A user&#8217;s guide to cell-free protein synthesis. Methods Protoc. 2019;2(1):24.</li>
	<li>Hern&#225;ndez G, Altmann M, Lasko P. Origins and evolution of the mechanisms regulating translation initiation in eukaryotes. Trends Biochem Sci. 2010;35(2):63-73.</li>
	<li>Hern&#225;ndez G, Proud C, Preiss T, Parsyan A. On the diversification of the translational apparatus across eukaryotes. Comp Funct Genomics. 2012;2012:256848.</li>
	<li>Lakovaara S. Malt as a culture medium for Drosophila species. Drosoph Inf Serv. 1969;44:128.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Aluminiumfolie</td><td>Reynolds</td><td>N/A</td><td>Standaard huishoudelijke aluminiumfolie; elk equivalent commercieel merk acceptabel.</td></tr><tr><td>Mengsel van aminozuren</td><td>Promega</td><td>L4461</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Appelcider azijn</td><td>Heinz</td><td>N/A</td><td>Commerciële appelcider azijn (5% zuurheid); elk equivalent merk acceptabel.</td></tr><tr><td>Appel- of druivensap</td><td>Jumex</td><td>N/A</td><td>Commercieel druivensap; of elk equivalent commercieel merk.</td></tr><tr><td>Bacteriologische agar</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>9002-18-0</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Boorzuur (H3BO3)</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>B6768</td><td>BioReagent, Molecular Biology grade, &ge;99.5%, poeder; gebruikt voor de bereiding van TBE-buffer.</td></tr><tr><td>Cap: Anti reverse cap (ARCA): 3’-O-Me-m7G(5’ )ppp(5’ )G RNA cap structuur</td><td>BioLabs</td><td>S1411S</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Cap: m7G(5')ppp(5')G RNA cap structuur analoog</td><td>New England Biolabs</td><td>S1404S</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Cap: Niet-functionele cap analoog G(5’ )ppp(5’ )A</td><td>New England Biolabs</td><td>S1406</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Centrifugebuis (15 mL)</td><td>Corning</td><td>430053</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Complete, EDTA-vrije protease-remmercocktail</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Creatinefosfokinase uit konijnsspier</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>C-3755</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Creatinefosforzuur, dinatriumzout</td><td>Merck</td><td>1120A47950</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Gedehydrateerde bakkersgist</td><td>Fleischmann’s</td><td>N/A</td><td>Commerciële actieve droge gist; elk equivalent merk acceptabel.</td></tr><tr><td>Di-ethylpyrocarbonaat</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>97%(NNR)</td></tr><tr><td>DNA Clean & Concentrator-5</td><td>Zymo Research</td><td>D4004</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Drosophila melanogaster wild-type stam Oregon-R</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center, Indiana, USA</td><td></td><td>https://bdsc.indiana.edu/index.html ; mutante stammen van Drosophila melanogaster, evenals wild-type referentiestammen van andere Drosophila-soorten, zoals virilis, pseudoscura, grinshawi, hydei, enz. worden ook door dit Stock Center geleverd.</td></tr><tr><td>Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td>ACS reagent, 99,4-100,6%, poeder; gebruikt voor de bereiding van TBE-buffer.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>SLBH4583V</td><td>99,5%(titratie)</td></tr><tr><td>Waterstofperoxide (H2O2)</td><td>Equate</td><td>N/A</td><td>Commercieel (~2,5-3,5% waterstofperoxide-oplossing; elk equivalent merk acceptabel.</td></tr><tr><td>In vitro transcriptie mMessage mMachine T7, T3 of SP6 Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1344 en AM1348</td><td>N/A</td></tr><tr><td>KOAc, ook wel KCH3COO genoemd</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>Meerdere</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Lb-bouillon (lennox)</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td>1kg</td></tr><tr><td>Luciferase-assaysysteem</td><td>Promega</td><td>E1501</td><td>N/A</td></tr><tr><td>MAXIscript T7, T3 of SP6 in vitro transcriptiekit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1316 en AM1312</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Mg(OAc)2, ook wel Mg(CH3COO)2 genoemd</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>Meerdere</td><td>N/A</td></tr><tr><td>NaCl (natriumchloride)</td><td>J.T Baker</td><td>B17W53</td><td>ACS Reagens</td></tr><tr><td>Oligonucleotiden</td><td>Elk bedrijf</td><td>N/A</td><td>Reeksspecifiek.</td></tr><tr><td>Passieve lysis 5X-buffer</td><td>Promega</td><td>E1941</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Pipetpunten</td><td>Axygen</td><td>T-200-Y</td><td>200 microliter gele punten.</td></tr><tr><td>Pipetpunten</td><td>Axygen</td><td>T-1000-B</td><td>1 ml blauwe punten.</td></tr><tr><td>Pipetpunten</td><td>Axygen</td><td>T-300</td><td>0,5-10 microliter heldere punten.</td></tr><tr><td>Propionzuur</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>79-09-04</td><td>ACS reagent-kwaliteit, &ge;99,5%, vloeistof.</td></tr><tr><td>PYREX® 5 mL glazen mortel weefselmolen</td><td>PYREX®</td><td>7724-5</td><td>N/A</td></tr><tr><td>QIAprep spin plasmid miniprep-kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>N/A</td></tr><tr><td>QIAquick gelextractiekit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Konijnsreticulocytenlysaat (RRL)</td><td>Promega</td><td>L4960</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Renilla luciferase (RLuc) assaysysteem</td><td>Promega</td><td>E2820</td><td>N/A</td></tr><tr><td>RNasin ribonuclease-remmer</td><td>Promega</td><td>N2111A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>RNeasy minielute RNA clean up-kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer dialysecassettes</td><td>Thermo Scientific</td><td>87735 (Hangt echter af van de moleculaire grootte van de cut-off).</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Natriumhypochloriet (bleekmiddel)</td><td>Clorox</td><td>N/A</td><td>Commercieel bleekmiddel (~5-6% NaOCl); elk equivalent commercieel merk met vergelijkbare concentratie acceptabel.</td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Merck</td><td>85558</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Roestvrijstalen zeef</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Elke commerciële leverancier.</td></tr><tr><td>Taq plus precision DNA-polymerase</td><td>Stratagene</td><td>600211-51</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Transfer ribonucleïnezuur (tRNA) uit bovien lever type XI</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>9014-25-9 of R4752</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Tris (Tris-base)</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70145</td><td>Moleculair biologie kwaliteit poeder; gebruikt voor de bereiding van TBE-buffer.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>SLBX9437</td><td>Labor

celvrije in vitro mrna-translatie in drosophila-lysaten

Cell-Free In Vitro mRNA Translation In Drosophila Lysates

Celvrije in vitro mRNA-translatie in Drosophila-lysaten

Cell-free mRNA in vitro translation has played a crucial role in the understanding of the protein synthesis process during gene expression across ...

Ons onderzoek maakt gebruik van een celvrij translatiesysteem van drosophila om eiwitsynthese en translationele onthulling te bestuderen tijdens verschillende stadia van de insectontwikkeling. Dit protocol recapituleert nauwkeurig in vivo translatiegebeurtenissen die specifiek zijn voor de insectontwikkeling, in tegenstelling tot lysaten van distant metazoa. Begin met het openen van de Benchling-cloningssoftware.Selecteer een geschikt plasmide om het construct in te voegen dat een five prime untranslated region, een vuurvlieg-luciferase of Fluc reporter-cistron, een three prime untranslated region en een polyadenylaat- of poly(A)-staart stroomafwaarts van een T7-promotor bevat. Gebruik de unieke restrictieplaats van KPN1 direct stroomafwaarts van de poly(A)-staart om elk plasmide-construct te lineariseren vóór de transcriptie. Verifieer de zuivere, goed opgeloste pieken van de verkregen constructen via sequencing voordat deze als templates voor in vitro transcriptie worden gebruikt.Scheid het gelineariseerde DNA via 1% agarosegelelektroforese bij 100 volt gedurende één uur. Isoleer het gelineariseerde DNA uit de gel. Plaats het in een microbuisje en voeg agarose-digestiebuffer of A

cell-free-in-vitro-mrna-translation-in-drosophila-lysates

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Hier beschrijven we een geheel gemonteerde...

Hele Mount RNA TL<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie van<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo&#39;s

We beschrijven hier de procedures voor de extractie en zuivering van mRNA en metabolieten...

Zuivering van Afschriften en metabolieten van<em&gt; Drosophila</em&gt; Hoofden

Het doel van deze publicatie is om te visualiseren en te discussiëren over de operatieve stappen van een Enhanced Northern Blot protocol op RNA geëxtraheerd uit Drosophila melanogaster embryo's, cellen en weefsels. Dit protocol is bijzonder bruikbaar voor de efficiënte detectie van kleine RNA species.

Verbeterde Northern Blot detectie van kleine RNA Species in Drosophila melanogaster

Controle van eiwitsynthese vindt voornamelijk plaats tijdens de initiatiefase van translatie, waarvan tekortkomingen zijn gekoppeld aan verschillende aandoeningen. Om de etiologie beter te begrijpen, beschreven we hier een protocol met Xenopus laevis eicellen dat de translatie van het mos-transcript beoordeelt in aanwezigheid van een mutant van translatie-initiatiefactor eIF4G1.

Xenopus laevis als een model te identificeren Vertaling Impairment

Het vertalen van Ribosoom Afiniteitszuivering (TRAP) kan de celtype-specifieke translatie van mRNA vastleggen. Hier rapporteren we het eerste TRAP-protocol dat zich richt op de isolatie van mRNA in zeldzame celpopulaties van Drosophila-embryo's.

TRAP-rc, vertalen Ribosoom Affiniteitszuivering van Rare Cell Populaties van<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo

Het doel van dit protocol is om een ​​eenvoudige en goedkope aanpak te geven voor het verzamelen van Drosophila embryo's op middelgrote schaal (0,5-1 g) en het bereiden van eiwit extracten die kunnen worden toegepast in stroomafwaartse proteomische toepassingen, zoals affiniteitszuivering-massaspectrometrie (AP-MS ).

Middelgrote voorbereiding van<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo Extracten voor Proteomische Experimenten

Een tandem RNA isolatie procedure (reis) voor herstel van endogeen gevormde mRNA-eiwitcomplexen wordt beschreven. Specifiek, RNA-eiwitcomplexen kruisverwijzende in vivo, polyadenylated RNAs zijn geïsoleerd uit extracten met oligo(dT) kralen en bepaalde mRNAs met gemodificeerde RNA antisense oligonucleotides worden vastgelegd. Eiwitten gebonden aan mRNAs worden gedetecteerd door analyse van de immunoblot.

Een Oligonucleotide gebaseerde Tandem RNA isolatie Procedure om te herstellen van eukaryotische mRNA-eiwitcomplexen

Hier presenteren we een protocol voor de visualisatie, detectie, analyse en tracking van endogene mRNA-handel in levende Drosophila melanogaster Eier kamer met behulp van moleculaire bakens, draaiende schijf confocale microscopie en open-source analyse Software.

Visualisering en opvolging van endogene Mrna's in levende Drosophila melanogaster Eier kamers

Dit artikel schetst een gedetailleerd protocol voor het gebruik van het RNA-targeting Cas13D-enzym (RfxCas13D) in vliegen.

Alomtegenwoordige en weefselspecifieke RNA-targeting in Drosophila Melanogaster met CRISPR/CasRx

Dit artikel neemt de phiC31-integrase-gemedieerde transgenese in Drosophila als voorbeeld en presenteert een geoptimaliseerd protocol voor micro-injectie van embryo's, een cruciale stap voor het creëren van transgene vliegen.

Embryo-micro-injectie voor transgenese bij Drosophila

Leer celvrije mRNA-translatie in Drosophila-embryolysaten voor onderzoek naar eiwitbiosynthese en translationele controle. Dit protocol ondersteunt meerdere Drosophila-soorten en biedt waardevolle inzichten voor moleculair biologisch onderzoek.

Celvrije in vitro mRNA-translatie in Drosophila-lysaten

Meer video's verkennen