Het evalueren van het effect van gecoate filters en voorfilters op de infectiviteit en concentratie van aerosoliseerd phi6-virus

We onderzoeken het effect van voorfilters en antivirale coatings op het verminderen van de infectie en concentraties van het luchtgedragen virus in binnenruimtes. Stroomnaderingen missen realistische luchtstroomdynamiek. Ons protocol recreëert aerosolcondities en meet zowel infectieuze virussen als de totale virale lading.

Om te beginnen verdun je de gezuiverde phi6-bacteriofaagvoorraad in een 20 millimolaire kaliumfosfaatbuffer met één millimolair magnesiumchloride aangepast op pH 7,2. Assembleer alle filter-, voorfilter- en antivirale coatingmaterialen in de bioveiligheidskast om de oppervlaktetests uit te voeren. Beoordeel de antivirale activiteit van alle coatingmaterialen die gebaseerd zijn op koper- of koper- en zilveractieve componenten die zijn ingesloten in gepatenteerde matrices, namelijk A6, B4, VS en VS B, op vlakke teststukken.

Vervolgens pipetteer je 20 microliter verdunde phi6-bacteriofaagoplossing op gecoate teststukken om de oppervlakte-levensvatbaarheidstest uit te voeren. Verspreid het monster gelijkmatig over een oppervlak van twee bij twee centimeter met behulp van een steriele glazen driehoek. Incubeer de monsters bij 22 graden Celsius tot vier tijdstippen, waaronder één minuut, vijf minuten, één uur of drie uur.

Voeg 180 microliter verse LB-bouillon toe aan het oppervlak om de virussen na elk tijdstip te herstellen. Was het oppervlak door 10 tot 20 keer herhaald te pipetten om het monster te verzamelen. Gebruik een plastic petrischaal als bedieningsoppervlak.

Kwantificeer de antivirale effectiviteit van de oppervlaktecoatings met behulp van plaque-assay om het aantal infectieuze virale deeltjes te meten en de kwantitatieve reverse transcriptase-polymerasekettingreactie, of qRT-PCR, om het aantal virale genoomkopieën te bepalen. Verdun de gezuiverde en geconcentreerde phi6-bacteriofaag-suspensie zoals eerder aangetoond om een virale concentratie te verkrijgen in het bereik van 2,5 keer 10 tot de kracht 10, tot 4,08 keer 10 tot de kracht van 11 plaquevormende eenheden per milliliter. Vervolgens assembleer je de experimentele aerosolkamer met behulp van een cilindrisch glazen lichaam met een bijpassend deksel.

Plaats de interne metalen steiger in de kamer en sluit isolerende pakkingen vast om een luchtdichte afdichting te garanderen. Gebruik een vernevelaar in combinatie met een luchtpomp om een stabiele en reproduceerbare invoer van virale aerosolen te genereren. Titreer de virusoplossing die in de vernevelaar wordt gebruikt voor en na elk experiment om de stabiliteit te monitoren.

Stel de aerosolstroom in op acht liter per minuut binnen de kamer. Om de luchtvochtigheid tijdens langdurige metingen te verminderen, richt ongeveer driekwart van de aerosolstroom naar de uitlaat via een hoogefficiënt deeltjesluchtfilter, of HEPA. Laat het resterende kwart van de stroom, overeenkomend met twee liter per minuut, de kamer binnenkomen.

Gebruik een trechter om de aerosolstroom naar het filter- of voorfilteroppervlak in de kamer te leiden. Ontvochtig de uitgaande luchtstroom met een desiccator om het HEPA-filter en de doorstroommeter te beschermen tegen overmatig vocht. Met behulp van de externe pomp creëer je een negatieve druk binnen het systeem en ondersteun je de luchtstroom verder om een efficiënte uitlaat via de uitlaatopening te garanderen.

Evalueer de antivirale eigenschappen van ongecoate of VS B-gecoate polyester- en bulpre-voorfilters naast dubbellaagse glasvezelmaterialen in de aerosolkamer. Om het antivirale effect te evalueren door impactiemonsters, plaats u een petrischaal met een 20 millimolaire HEPES-buffer bij pH 7,2 direct onder het testvoorfilter om de deeltjesafzetting te maximaliseren. Alternatief, om het antivirale effect van GF2-filters te testen, kunt u een drievoudige glazen draaiimpinger met drie mondstukken opstellen die is aangesloten op een externe pomp voor aerosolverzameling.

Houd de luchtstroom via het testvoorfilter of filter op twee liter per minuut. Verhoog de totale luchtinstroom tot 10 liter per minuut met een extra klep na de kameruitlaat. Vang de aerosolen op in vijf milliliter van een 20 millimolaire HEPES-buffer.

En vul elke 30 minuten de verdampte buffer aan. Voor driedubbele bemonstering voert u controleruns uit zonder voorfilters of filters gedurende 15 minuten voor en na elk experiment. Na de controle vóór het experiment plaats je het filter of voorfilter in de kamer en laat je het systeem drie uur draaien.

Verzamel virale aerosolen door elke 30 minuten één milliliter suspensie terug te winnen uit petrischalen met 20 milliliter buffer. Verwijder het filter en voer een controlerun na het experiment uit. Verzamel elke 30 minuten monsters tijdens het experiment om acht qRT-PCR- en titratiemonsters per experiment te verkrijgen.

Bij impinger-experimenten verzamel je titratiemonsters slechts één keer aan het einde van de drie uur durende run. Gebruik 800 microliter van het verzamelde monster voor qRT-PCR-analyse en de resterende 200 microliter voor virustitratie. Snap freeze qRT-PCR-monsters in vloeibare stikstof en bewaar ze bij 80 graden Celsius.

Verwerk virustitratiemonsters onmiddellijk met een plaque-assay. De oppervlakte-levensvatbaarheidstests toonden aan dat alle geteste coatings het virus succesvol inactiveerden, met significante reducties binnen de eerste vijf minuten. De kopergebaseerde oppervlaktecoating, B4, bereikte de snelste reductie, verminderde infectieuze tellingen met drie ordes van grootte binnen vijf minuten, en bereikte volledige inactivatie met detectielimiet onder de 100 plaquevormende eenheden per milliliter met 15 minuten.

De A6-coating bereikte totale virusinactivatie binnen 25 minuten, en VS B binnen 60 minuten. VS-coating vertoonde het langzaamste inactivatietempo van de geteste materialen. De bestudeerde prefilters BP6, S11 en FMR5 waren even effectief in het verlagen van het aantal infectieuze virussen, waarbij ze met 1,5 tot 2 ordes van grootte doorheen gingen vergeleken met de controle zonder filter.

De GF2-filters toonden superieure prestaties, waarbij de virale lading met minstens zes ordes van grootte werd verlaagd, en er werden geen infectieuze phi6-virusplaques binnen de detectiegrens gedetecteerd. De VS B-coating had geen significante invloed op de filtratie van infectieuze virussen vergeleken met ongecoate voorfilters. De qRT-PCR-resultaten toonden aan dat prefilters het aantal kopieën van het virale genoom met maximaal twee ordes van grootte verlaagden.

Het GF2-filter liet een afname van tot vier ordes van grootte zien vergeleken met de controle zonder filter. Hoewel de verschillen tussen voorfilters en regeling in de eerste 30 minuten onbeduidend bleven, nam de efficiëntie van mechanische filtering toe vanaf het tijdstip van 60 minuten. Bovendien had de toepassing van de VS B-coating geen meetbaar effect op het aantal virale genomen dat door het filtratiemedium ging.

Dit protocol stelt onderzoekers in staat om virale inactivatie, filtratie-efficiëntie en verschillen tussen infectieuze deeltjes en de totale virale lading te kwantificeren. Een belangrijke uitdaging is de zeer korte contacttijd van het virusoppervlak tijdens de luchtstroom, wat de effectiviteit van antivirale coatings beperkt. Toekomstige studies kunnen onderzoeken hoe coatings gecombineerd worden met UV of prestaties worden getest in echte ventilatiesystemen en met diverse virussen.