CRISPR/Cas9-gemedieerde endogene fluorescerende tagging van kiemlijnspecifieke genen in Caenorhabditis elegans
29 mei 2026
Een CRISPR/Cas9 microinjectieworkflow voor endogene fluorescerende tagging in de Caenorhabditis elegans kiemlijn om homozygote knock-in-lijnen te verkrijgen voor in vivo eiwitlokalisatieanalyse.
We gebruiken CRISPR-gebaseerde endogene tagging om de lokalisatie en dynamiek van kiemlijneiwitten in C.elegans te bestuderen. Conventionele transgenen kunnen de expressie van de kiembransel beïnvloeden, maar dit protocol taggt eiwitten op de endogene locus onder native controle. Om te beginnen identificeer je de kandidaatgenen met overheersende expressie in de gonade of kiemcellen met behulp van openbare databases en gepubliceerde literatuur.
Na het openen van de UniProt-invoer voor het doeleiwit, klik je op Structuur om structurele kenmerken en eiwitdomeinen te evalueren en een geschikte fluorescerende taggingplaats te identificeren. Scroll naar beneden en open de AlphaFold DB-vermelding om de betrouwbaarheidswaarden van het model te verifiëren. Klik op Domeinen voor specifieke structurele classificaties.
Open vervolgens de doelgenpagina in WormBase. Scroll naar beneden en klik op de Sequences-widget en de primaire transcriptielink om de transcriptpagina te openen. Scroll naar beneden naar het gedeelte Sequenties en klik op de specifieke optie om de gesplitste sequentie van het geselecteerde transcript te onthullen.
Kopieer en plak op de IDT CRISPA-Cas9 Guide RNA Design Tool-webpagina de eerste exonsequentie van het doelgen van de WormBase-pagina en selecteer C, elegans in het Species-dropdownmenu voor gids-RNA of gRNA-ontwerp. Klik op de DESIGN-knop om de hoogst aanbevolen gRNA-sequentie en de bijbehorende PAM-sequentie te verkrijgen en te bekijken. Selecteer op SnapGene Sequence om het kloonpunt tussen de CeU6-promotor en de gRNA-scaffoldgebieden te identificeren.
Kopieer de gRNA-sequentie van de IDT-toolpagina, plak deze in het invoegvenster en klik op Invoegen om de spacer te integreren in het CRISPR-expressieplasmide. Om de nauwkeurigheid van gRNA-insertie te bevestigen, selecteer je de sequentie en klik je op Toon uitlijningen om het Sanger-sequencingresultaat basis voor base te vergelijken met de verwachte sequentie. Om het donorplasmide te construeren, kopieer je de genomische sequenties van de homologiearm van WormBase.
In SnapGene plak je de sequentie en klik je op Invoegen. Klik vervolgens met de rechtermuisknop op de insertieplaats om het Set DNA Color-venster te openen en verander het naar Oranje om de verbinding te markeren. Kopieer de groene fluorescerende eiwit- of GFP-insertsequentie en plak deze direct op de gemarkeerde positie.
Klik dan op Functie toevoegen. Noem de functie GFP. Verander de displaykleur naar groen en klik op OK om de in silico donorplasmide-assemblage te voltooien.
Om een stille substitutie in het donorplasmidesjabloon te introduceren om Cas9-hersnijding na integratie te voorkomen, kopieer je de 19-nucleotide gRNA-spacer van de expressievector. In het tabblad donorplasmide plakt u de sequentie in de zoekbalk 'Find DNA'-sequentie om de doellocatie te vinden en selecteert u de specifieke nucleotidepositie die muteert te worden. In Vervang basis voer je nieuwe nucleotide in en klik je op Invoegen.
Klik met de rechtermuisknop op de aangepaste basis en gebruik Set DNA Color om de kleur naar rood te veranderen. Lijn de Sanger-sequencingresultaten van het donorplasmide af met de verwachte sequentie om de integriteit te bevestigen. Bereid het injectiemengsel voor door het CRISPR-expressieplasmide, het donorplasmide en co-injectiemarkers te combineren in steriel dubbel gedestilleerd water tot een eindvolume van 10 microliter bij de getoonde concentratie.
Centrifugeer vervolgens het mengsel op 10.000 g gedurende 10 tot 20 minuten om het deeltjesmateriaal eruit te pelleten en verstopping van de microinjectiecapillaire te voorkomen. Gebruik een naaldtrekker om microinjectienaalden te maken van glazen haarvaten met een lange taps toelopende en scherpe punt, geschikt voor gonadale injectie, terwijl je de polaire instellingen empirisch optimaliseert. Verhit een microcapillaire pipet en klik deze in twee stukken om een laadinstrument te maken.
Bevestig een rubberen aspiratorbol aan het brede uiteinde van de verkorte microcapillaire pipet. Aspireer ongeveer één microliter injectiemengsel in de lader. Steek de loader in de achterkant van de injectienaald en doseer voorzichtig het injectiemengsel.
Plaats de geladen naald horizontaal gedurende 10 minuten om een doorlopende kolom te vormen en laat de oplossing naar de punt zakken. Bevestig de naald op de injectiemicroscoop en breng de punt scherp in beeld met bright-field optics. Open de naaldtip door voorzichtig contact te maken met de rand van een deksel in halocarbonolie en controleer de stroming.
Om de wormen te kweken voor injectie, houd je de N2 wildtype-wormen op OP50 bacteriezaad-mediaplaten. Selecteer hermafrodieten in het L4-stadium van een gezonde plaat en broei 10 uur bij 20 graden Celsius om jonge volwassenen met goed ontwikkelde kiemlijnen te verkrijgen. Breng wormen over naar een niet-ingezaaide plaat om bacteriële overdracht te verminderen.
Bereid een droog 2%agarose-kussen voor op een glazen glaasje. En breng een druppel halocarbonolie aan. Gebruik een wimperplukker om een worm op het agarosekussen te plaatsen en hem te immobiliseren.
Gebruik een objectief met lage vergroting om de gonade voor injectie te oriënteren. Gebruik micromanipulatorbediening om de naald onder een hoek van 20 tot 40 graden ten opzichte van de worm te positioneren. Gebruik een hoge vergroting om te focussen op de distale kiemlijn.
Breng de worm naar de naald en plaats de tip binnen het gonadale syncytium. Injecteer de oplossing totdat de gonade opzwelt. Trek de naald terug en herplaats hem voor de volgende injecties.
Voeg M9-buffer toe om het agarosekussen zachter te maken en gedeeltelijk te breken om wormen vrij te laten. Plaats elke worm op een individuele herstelplaat. Herhaal dan injecties voor 20 tot 25 wormen.
Screen F1-nakomelingen op co-injectiemarkers en selecteer marker-positieve dieren. Breng elke F1-worm over op een apart bord en laat één tot twee dagen de eieren leggen. Lys elke F1-worm in een proteïnase K-buffer om PCR-templates voor te bereiden.
Voer junction PCR uit met één genomische primer buiten de homologiearm en één interne tagprimer. En behoud overeenkomstige platen van PCR-positieve F1-dieren. Isoleer F2-nakomelingen van PCR-positieve F1-lijnen op individuele platen om nakomelingen te produceren.
Lyse volwassen mensen voor genotypering. Voer PCR uit met primers die de homologiearmen flankeren om wildtype- en knock-in allelen te onderscheiden op productgrootte. Gebruik het SnapGene-instrument om correcte integratie te verifiëren en te valideren bij zowel de linker- als rechterinsertiejunctions door de Sanger-sequencingresultaten af te stemmen op de verwachte bewerkte genomische sequentie.
Gebruik fluorescentiemicroscopie om kiemlijnexpressie en lokalisatie te verifiëren. Breid bevestigde homozygote lijnen uit. Voorraad onderhouden en cryopreserve-gevalideerde lijnen voor langdurige opslag.
PCR-gebaseerde screening van F1-nakomelingen toonde succesvolle knock-ins aan die werden geïdentificeerd door 1.550-basenparen junction PCR-amplicon met één flankerende genomische en één interne GFP-primer. Het ontbreken van de band van 1.550 basenparen bij de meeste F1-dieren wees op geen detecteerbare doelintegratie, wat consistent is met niet-integratieve DNA-overdracht in plaats van homologiegerichte reparatie. Zygositeitsbepaling bij F2-nakomelingen afkomstig van junction PCR-positieve lijnen onderscheidt allelen op bandgrootte bij 1.345 basenparen als wildtype-allel en 2.344 basenparen als knock-in allel.
Heterozygoten tonen beide banden. Homozygote knock-in samples missen de wildtype-grootte band, en de samples met mislukte integratie tonen alleen het wildtype-formaat product. Aanvullende validatie van de homozygote GFP knock-in lijn werd uitgevoerd met behulp van confocale microscopische beeldvorming, waarbij GFP-fluorescentie in de kiemlijncellen met signaalverrijkt in het spermatogene gebied werd waargenomen.
Dit protocol maakt in vivo analyse van eiwitlokalisatie en -dynamiek in de C.elegans-kiemlijn mogelijk. Zorgvuldig tagontwerp en grondige validatie zijn essentieel om de eiwitfunctie te behouden en vals-positieve kandidaten te minimaliseren. Toekomstige studies kunnen deze workflow gebruiken om eiwitlokalisatie te volgen en potentiële interacties tijdens de ontwikkeling van de kiemlijn te onderzoeken.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een praktische, op CRISPR/Cas9 gebaseerde workflow voor het fluorescent labelen van endogene eiwitten in de kiemlijn van Caenorhabditis elegans. Het protocol maakt stabiele knock-in allelen mogelijk die nauwkeurig de eiwitlokalisatie rapporteren onder natuurlijke regulatoire controle, waarmee de beperkingen van traditionele transgene benaderingen worden overwonnen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Genetica
- Ontwikkelingsbiologie
- Moleculaire biologie
Achtergrond
- Eiwitlokalisatie is cruciaal voor het begrijpen van genfuncties tijdens de gametogenese in C. elegans.
- Conventionele transgeenmethoden leiden vaak tot variabele expressie en kiemlijnsilencing.
- Endogene tagging zorgt voor betrouwbaardere en fysiologisch relevantere expressiepatronen.
- CRISPR/Cas9-genoomredactie maakt nauwkeurige insertie van fluorescente tags op native loci mogelijk.
Doel van de studie
- Het beschrijven van een reproduceerbare workflow voor het genereren van fluorescent gelabelde endogene eiwitten in de kiembaan van C. elegans.
- Het mogelijk maken van stabiele, homozygote knock-in-stammen voor ontwikkelingsbiologische en celbiologische analyses.
- Het bieden van een breed toepasbaar protocol voor genen die verrijkt zijn in de kiembaan.
Gebruikte methoden
- Selectie van een geschikte tagging-strategie voor het doeleiwit.
- Aflevering van CRISPR/Cas9-reagentia via gonadale microinjectie in jonge volwassen hermafrodieten.
- PCR-gebaseerde genotypering over twee generaties om homozygote knock-in wormen te identificeren en te isoleren.
- Confocale microscopie om kiemlijnfluorescentie te verifiëren en de subcellulaire eiwitlokalisatie in vivo te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Opzet van een workflow voor de efficiënte generatie van fluorescent gelabelde endogene eiwitten in C. elegans.
- Stabiele knock-in allelen worden geproduceerd, die de eiwitdistributie rapporteren onder natuurlijke regulatie.
- Homozygote gelabelde stammen kunnen betrouwbaar worden geïsoleerd en geverifieerd.
- Confocale beeldvorming bevestigt de nauwkeurige subcellulaire lokalisatie van gelabelde eiwitten in de kiemlijn.
Conclusies
- Het beschreven CRISPR/Cas9-protocol is robuust en breed toepasbaar voor kiemlijn-proteinetagging in C. elegans.
- Het overwint de beperkingen van traditionele transgene benaderingen en biedt een stabiele en fysiologisch relevante expressie.
- Deze workflow faciliteert ontwikkelingsbiologische en celbiologische studies door nauwkeurige in vivo eiwitlokalisatie-analyse mogelijk te maken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Endogene fluorescente labeling met behulp van CRISPR/Cas9 in kiemlijngenen van Caenorhabditis elegans lost het probleem van variabele of onderdrukte transgene expressie op, waardoor nauwkeurige studies naar eiwitlokalisatie onder natuurlijke regulatoire controle mogelijk worden. Deze workflow vergroot het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie en ondersteunt robuuste beslissingen in de vroege ontdekkingsfase. De aanpak is breed toepasbaar voor het vaststellen van fysiologisch relevante modellen die cruciaal zijn voor translationeel onderzoek en portfolioontwikkeling.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt directe visualisatie van eiwitlokalisatie mogelijk voor functionele doelwitvalidatie.
- Ondersteunt mechanistische risicoreductie door endogene expressiepatronen te bevestigen.
- Faciliteert hypothese-gestuurd onderzoek naar genfuncties tijdens de gametogenese.
- Verbetert de voorspellende betrouwbaarheid voor daaropvolgende biologische studies.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt stabiele, reproduceerbare gelabelde stammen voor kwantitatieve imaging-assays.
- Standaardiseert biologische systemen voor consistente screening-outputs.
- Maakt een betrouwbare beoordeling van de subcellulaire eiwitdistributie in vivo mogelijk.
- Ondersteunt schaalbare workflows voor de evaluatie van verbindingen in kiemlijncontexten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijgt proteïnelokalisatiegegevens uit met ziekterelateerde ontwikkelingsprocessen.
- Waarborgt continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door gebruik van natuurlijke genregulatie.
- Vermindert het risico op artefacten die translationele biomarkerstudies kunnen beïnvloeden.
- Versterkt de basis voor risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze CRISPR/Cas9-gemedieerde taggingsmethode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie tot preklinisch onderzoek, en ondersteunt zowel mechanistische studies als translationele continuïteit.
- Ontdekkingsbiologie: Maakt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking mogelijk door de visualisatie van endogene proteïnedynamiek.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve imaging-outputs voor assay-ontwikkeling.
- Analytica: Biedt PCR-gebaseerde genotypering en confocale microscopieresultaten voor een robuuste gegevensvergelijking.
- Translationeel onderzoek: Behoudt de fysiologische relevantie voor biomarker-afstemming en preklinische modellering.
- Bedrijfsbrede herbruikbaarheid: Vestigt herbruikbare getagde stammen voor lopende en toekomstige R&D-initiatieven.
Operationele en zakelijke impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie.
- Operationele waarde: Standardiseert workflows en verbetert de reproduceerbaarheid tussen onderzoeksteams.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go-beslissingen en de kapitaalefficiëntie door biologische risico's te minimaliseren.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en de verdere ontwikkeling van gevalideerde targets.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in CRISPR/Cas9 genoomredigering en microinjectietechnieken.
- Toegang tot confocale microscopie en PCR-gebaseerde genotyperingsinfrastructuur is noodzakelijk.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor de taggingstrategie en screeningprotocollen.
- Aanpasbaar aan diverse kiemlijn-verrijkte en andere endogene genen in C. elegans.
- Afhankelijk van robuuste herwinning en screening van geredigeerde allelen over meerdere generaties.
Veelgestelde vragen over Biofarmacie
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:24
Germline Target Gene Selection and CRISPR Component Design in Caenorhabditis elegans
3:53
Preparing the Needle for the Gonadal Microinjection
5:30
Preparing the Worms for Injection
6:01
Performing the Gonadal Microinjection
7:07
Screening F1 and F2 Progeny
8:34
Results
10:04
Conclusion
