Een gestroomlijnd protocol voor single-molecule localisatiemicroscopie in Arabidopsis-kernen

Mijn onderzoek richt zich op epigenoombewerking en de visualisatie van chromatineorganisatie in Arabidopsis-kernen met behulp van superresolutiemicroscopie. Bestaande methoden zijn niet aangepast aan STORM-beeldvorming. Dit protocol verbetert de zuiverheid van kernen, labelconsistentie, monstermontage en beeldvormingsstabiliteit.

Het is van toepassing op Arabidopsis thaliana en andere plantsystemen voor het bestuderen van nucleaire organisatie, chromatinestructuur en epigenetica in hoge resolutie. Begin met een zes-put kweekplaat op ijs onder de dampkap. Meng de fixatieoplossing die 4% volume per volume bevat, methanolgestabiliseerde formaldehyde 0,1%, Triton X100 en PBS.

Voeg ongeveer vier milliliter ijskoude fixatieoplossing toe aan elke put onder de afzuigkap. Verwijder met schone pincetten de zaailingen Arabidopsis die tussen de acht en vijftien dagen na kieming zijn uit solide halfsterke Murashige en Skoog, of MS medium. Dompel de zaailingen onmiddellijk onder in de fixatieoplossing en plaats ongeveer 20 zaailingen per put.

Gebruik drie putten om voldoende materiaal per monster te verkrijgen. Plaats de plaat in de vacuümkamer gevuld met ijs en sluit die. Breng een vacuüm aan waarbij je wisselt tussen min 0,6 bar en min 0,8 bar gedurende 15 minuten om de opgesloten lucht te verwijderen en diep door te dringen van het fixatiemiddel in het plantenweefsel.

Laat dan langzaam de stofzuiger los. Meng het monster en breng het vacuüm nog eens 15 minuten aan. Verwijder onder de afzuigkap de fixatieoplossing met een pipet.

Was elke keer drie keer gedurende 10 minuten onder zacht bewegen met vijf milliliter ijskoude PBS. Na de wasbeurten verwijder je de PBS. Met pincetten wordt het gefixeerde weefsel overgebracht naar een petrischaal van 120 bij 120 millimeter en 50 microliter kernisolatiebuffer aan de gefixeerde zaailingen toegevoegd.

Hak met een mes het vaste weefsel door. Schraap met hetzelfde mes het gehakte tissue aan één rand van de petrischaal. Voeg 600 microliter nuclei isolatiebuffer toe en was eventueel weefsel dat aan het blad vastzit af.

Breng de weefselslurry over in een twee milliliter Dounce-homogenisatorbuis en strijk vijf tot tien keer met de kleinere stamper. Vervolgens strijk je met de grotere stamper totdat deze soepel in de buis beweegt, wat meestal vijf tot tien slagen vereist. Filter het gehomogeniseerde monster door een 30 micrometer meshfilter in een buis van 50 milliliter.

Breng het filtraat over in een verse buis van 1,5 milliliter. Centrifugeer de ophanging gedurende 10 minuten op 800G met de laagste helling voor zowel acceleratie als vertraging. Na centrifugatie is er een klein wit pelletje zichtbaar tussen het groene weefselafval.

Gooi het supernatant weg en suspendeer de pellet opnieuw in 600 microliter nuclei-isolatiebuffer. Centrifugeer opnieuw 10 minuten op 800G en verwijder het supernatant. Na het volledig afwassen van het groene afval, bewaar de geïsoleerde kernsuspensie maximaal een week bij vier graden Celsius en immunokleurt u de kernen met de gewenste antilichamen.

Verhit de 1,5% gewichts per volume laagsmeltende agaroseoplossing op 90 graden Celsius gedurende één minuut om het poeder op te lossen en een heldere oplossing te verkrijgen. Vortex kort om volledige mix te garanderen. Koel de oplossing af en houd deze op 37 graden Celsius voordat je doorgaat om hittedenaturatie van de glucoseoxidasebuffer te voorkomen.

Nadat de laagsmeltende agarose-oplossing 37 graden Celsius heeft bereikt, bereid je de STORM-buffer voor door 100 millimolaire mercaptoethylamine en glucose-oxidasebuffer toe te voegen aan de laagsmeltende agarose om een eindconcentratie van 1x te bereiken en de oplossing voorzichtig te mengen. Deponeer 10 microliter van het kernmengsel op een met ozon behandelde 1,5H deklaag die 20 minuten is behandeld in een ultraviolet ozonreinigingssysteem. Wacht drie minuten om de kernen op de deksel te laten liggen.

Verwijder daarna het overtollige vocht en wacht twee minuten. Voeg 10 microliter van de bereide laagsmeltende agarose toe aan de deksel en bedek direct met een microscoopglaasje. Dicht de deksel af met siliconenkitten.

Meng gelijke hoeveelheden oplossing A en oplossing B in een kleine petrischaal met behulp van een micropipettip. Breng het mengsel aan over de randen van de deksel om het monster te verzegelen. Laat de siliconenkit vijf minuten uitharden.

Bevestig de monsterglaas op de microscoop en zoek scherpstelling. Lokaliseer en focus op een kern. Activeer een focus-onderhoudende module indien beschikbaar om stabiliteit te waarborgen tijdens langdurige acquisitie.

Kies een gebied waar één of enkele nanodiamanten nabij de kern zijn gepositioneerd om de driftcorrectie tijdens de reconstructie te verbeteren. Voor tweekleurige beeldvorming begin je met het kanaal met een langere golflengte en schakel je daarna over op het kanaal met een kortere golflengte om de beeldvorming af te ronden. Verwerk de ruwe beeldstacks in ThunderSTORM met Gaussian fitting en gewogen kleinste-kwadraten-schatting en genereer gereconstrueerde beelden.

Pas filtering toe op basis van sigma en onzekerheid onder 30 nanometer om nauwkeurige lokalisaties te behouden en ruis te verwijderen. Voer tenslotte sample-driftcorrectie uit met behulp van ThunderSTORM kruiscorrelatie of het COMET-algoritme en bevestig minimale drift in de gereconstrueerde beelden. Kernen werden geïsoleerd uit 15 dagen oude wildtypezaailingen die immuno-gelabeld waren met AF647 geconjugeerde secundaire antilichamen en tegengekleurd met Hoechst H33258.

Confocale beeldvorming toonde meerdere geïsoleerde en goed bewaarde kernen met minimale resten, met chromocentra en de nucleolus duidelijk te onderscheiden. Het RNA-polymerase II-signaal ontbrak bij chromocentra en de nucleolus. Diffractiebeperkte maximale intensiteitsprojecties en bijbehorende SMLM-reconstructies onthulden structurele details van RNA-polymerase II en DNA-labeling, inclusief vergrote interessegebieden met fijnere structuren.

Lokalisatiefiltering op basis van sigma en onzekerheid verbeterde de definitie van zowel RNA-polymerase II- als DNA-signalen in vergelijking met gedetecteerde lokalisaties. En verdere verfijning na driftcorrectie hield deze verbeterde structuur in stand. Filteren op basis van sigma-waarden verwijderde lokalisaties met te kleine of te grote passende breedtes.

Fourier-ringcorrelatieanalyse toonde aan dat de resolutie in het AF647-kanaal verbeterde van 90,1 naar 47,7 nanometer na filtering, terwijl het JF549-kanaal verbeterde van 56,6 naar 27,9 nanometer. Het behouden van de nucleaire integriteit terwijl puin en achtergrondfluorescentie worden geminimaliseerd, is cruciaal voor het bereiken van hoogwaardige beeldvorming van één molecuul. Toekomstige studies kunnen nucleaire architectuur koppelen aan genregulatie onder omgevings- of ontwikkelingsomstandigheden.