Een geoptimaliseerde methode om vrouwelijke muizenurethrale epitheel te isoleren voor eencellige en immunofluorescentieanalyse

Onze groep is geïnteresseerd in het bestuderen van epitheelpatroonvorming in het genitourinaire kanaal. Dit protocol vertegenwoordigt een geoptimaliseerde methode om de epitheelbekleding van de vrouwelijke muizenurethra te isoleren voor downstream moleculaire en cellulaire analyse. De in dit artikel beschreven methoden zullen bijdragen aan onderzoek naar het vrouwelijke urethrale slijmvlies en de rol ervan in immuunafweer.

Begin met het plaatsen van de geëuthanaseerde vrouwelijke CD1-muis van 6 tot 12 weken in rugligging op de dissectietafel. Spray 70% ethanol op de buik om het haar nat te maken. Met een tang til je de huid op de buik op.

Maak vervolgens met een kleine schaar een verticale incisie richting het onderlichaam, eindigend bij de externe urethrale opening. Identificeer de blaas en til deze voorzichtig op met een tang, zodat deze leeg en urinevrij is. Knip met een schaar het vet en bindweefsel rond de blaas af om de vlindervormige structuur bloot te leggen waar de twee schaambeenderen samenkomen bij de schaamsymfyse.

Let op de plasbuis die onder de symfyse pubis loopt. Til vervolgens de schaamsymfyse op met een tang en knip deze open met een schaar. Verwijder de schaambeen fragmenten om de dunne urethra bloot te leggen die op het ventrale oppervlak van de vaginale wand ligt.

Met fijne pincet trek je de blaas voorzichtig omhoog vanuit de lichaamsholte. Haal een schaar tussen de plasbuis en de vaginale wand om de urine- en voortplantingswegen te scheiden. Houd lichte spanning op de blaas terwijl je langs de achterkant van de plasbuis snijdt om deze van de vaginale wand te scheiden.

Blijf snijden tot de opening van de distale urethrale om de volledige lengte muizenplasbuis te verkrijgen, die 1,2 tot 1,5 centimeter lang is. Vervolgens scheid je de plasbuis van de blaas door een enkele snee te maken in de hals van de blaas. Verzamel vier tot vijf urethra in een steriele petrischaal met verse HBSS zonder calcium en magnesium.

Knip onder een dissectiemicroscoop het vet en bindweefsel rond de plasbuis af met fijnpuntige pincetten en schaar. Knip vervolgens met een schaar elke plasbuis dwars in twee even grote stukken. Plaats de weefselstukken bovenop een 100 micron nylon gaaszeef.

Was de weefselstukken met één milliliter HBSS en doe ze vervolgens over in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter met één milliliter 1%-trypsine bereid in HBSS, aangevuld met antibiotica en antimicotica. Vervolgens incubeer je het monster op een rotator met 30 omwentelingen per minuut en vier graden Celsius gedurende 15 tot 30 minuten. Na de spijsvertering voeg je 10 millimolair magnesiumchloride dat in HBSS is bereid toe aan de buis, gevolgd door 10 microgram per milliliter DNAse die ik in PBS heb bereid.

Incubeer de buis 15 tot 30 minuten op een rotator die in een hybridisatieoven bij 37 graden Celsius wordt geplaatst. Om de trypsine te blussen, breng je het urethrale weefsel over in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter met 10% schapenserum in HBSS bij kamertemperatuur. Na vijf minuten plaats je het urethrale weefsel in een nieuw buisje met ijskoude HBSS, en vervolgens in een steriele Petrischaal met ijskoude HBSS.

Terwijl je het monster onder een microscoop bekijkt, houd je één uiteinde van het plasbuisstuk vast met een paar pincetten. Met een ander paar pincetten laat je het hele stuk van de urethrale laag over de hele lengte lopen om het transparante epitheelblad te extruderen. Verwerk enkele van de geïsoleerde urethrale epitheelplaten direct voor een hele mount immunokleuring om epitheelcellen en epitheliale macrofagen ter plaatse te visualiseren.

Gebruik een kleine plastic pipet om de epitheelstukken in een druppel HBSS geïsoleerd uit vier tot vijf verzamelde muizenurethren over te brengen in een steriele petrischaal. Gebruik een schaar om het epitheel in kleine fragmenten te hakken. Breng de gemalen epitheelfragmenten over in een microcentrifugebuis van twee milliliter met 1,5 milliliter voorverwarmde Accutase-verteringsoplossing bij 37 graden Celsius.

Incubeer het monster op een rotator op 37 graden Celsius gedurende een uur. Na incubatie wordt de volledige inhoud overgebracht in een centrifugebuis van vijf milliliter met twee milliliter wash buffer, bestaande uit calcium- en magnesiumvrije 1X PBS en 1% BSA. Centrifugeer de suspensie op 600 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius met behulp van een schwenkbare emmerrotor.

Vervolgens aspireer je het supernatant met een zachte vacuüm. Gebruik vervolgens een pipet met filtertip van één milliliter om de pellet opnieuw te laten ophangen in één milliliter wasbuffer. Breek de pellet door op en neer te pipetteren totdat de klonten kleiner worden.

Steek de ophanging door naalden van 23,5 gauge en 26,5 gauge, elk bevestigd aan een spuit van één milliliter met vier slagen per naald. Voeg vervolgens één milliliter wasbuffer toe om het oppervlak van een 30 micron pre-scheidingsfilter te bevochtigen dat over een buisje van vijf milliliter is geplaatst. Met de spuit die is aangesloten op de 26,5 gauge naald, breng je één milliliter van de celsuspensie door het filter.

Was daarna de tube met één milliliter wash buffer en haal deze door het filter. Pellet de cellen door centrifugatie op 600 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius met een zwaaiende emmerrotor. Aspireer het supernatant.

Susser de pellet opnieuw in 100 microliter wasbuffer en voeg 100 microliter rode bloedcel lysebuffer toe. Na precies drie minuten voeg je vier milliliter waspoeder toe en meng je. Oogst de cellen door centrifugatie op 600 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius met een schwenkende emmerrotor.

Verwijder het supernatant voordat je de pellet opnieuw suspendeert in 50 tot 200 microliter wash buffer, afhankelijk van de pelletgrootte. Meng een aliquot van vijf microliter cellen met vijf microliter trypanblauw en laad het mengsel op een hemocytometer om de celopbrengst en levensvatbaarheid te beoordelen. Beoordeel de levensvatbaarheid van de cel en kwantificeer verschillende celpopulaties met behulp van flowcytometrie.

Kweek urethrale epitheliale enkelcellen in een basale membraanmatrix en organoïde expansiemedium om driedimensionale urethrale epitheelorganoïden te genereren. Voer hematoxyline-eosinekleuring en fluorescerende immunokleuring uit op ingebedde organoïde secties om de organoïdestructuur en cellulaire samenstelling te visualiseren. De geïsoleerde urethrale epitheelomhulsels hadden een hogere transparantie dan het stromale weefsel na de scheiding.

Volledige immunokleuring van de epitheelmantels liet sterke labeling zien met het E-cadherine CDH1-antilichaam. Het labelen van de bladen met het antilichaam tegen F480 toonde aan dat de macrofagen vertakkende dendritische structuren vormden tussen de epitheelcellen van de plasbuis. Individuele cellen geïsoleerd uit het urethrale epitrieel toonden consequent een hoge levensvatbaarheid door trypan blue exclusion op een hemocytometer en flowcytometrie met de amine-reactieve Ghost Dye V 450.

De geïsoleerde cellen bevatten een verrijkte epitheelcelpopulatie na het gaten op de levende cellen. Ongeveer 1,3% van de CD45-positieve immuuncellen en 1,18% macrofagen werden waargenomen in de singlecel-suspensies. Enkele epitheelcellen die uit de urethra werden geïsoleerd, bleven levensvatbaar en vormden organoïden in een driedimensionale matrix, waarbij organoïde groei tot dag zes in cultuur werd waargenomen.

Hematoxyline-eosinekleuring toonde twee verschillende morfologieën van de urethrale epitheelorganoïden, waaronder grote holle organoïden en kleinere vaste organoïden. Zowel de holle als de vaste urethrale epitheelorganoïden waren gestratificeerd en exprimeerden KRT5 en P63 in de basale laag. Ze drukten KRT-13 tot expressie in de suprabasale en intermediaire cellagen.

De organoïden die uit de proximale urethra worden gegenereerd, vertoonden een hoger aandeel holle organoïden, terwijl de organoïden uit de distale urethra meer vaste bollen vormden. Dit protocol stelt onderzoekers in staat om urethrale celtypen en de zelfverlengbare capaciteit van epitheelcellen uit de proximale en distale urethra te bestuderen. Een van de belangrijkste overwegingen van dit protocol is de zorgvuldige dissectie van de volledige urethra en optimale enzymatische vertering om levensvatbare urethrale epitheelcellen te verkrijgen voor downstream analyse.

De epitheelcellen die door dit protocol worden geproduceerd, kunnen voor meerdere toepassingen worden gebruikt, waaronder single-cell RNA-sequencing, bulk RNA-sequencing, flowcytometrie, immunokleuring en organoïde kweek.