Een uitgebreid rattenmodel voor het beoordelen van levertransportroutes door gelijktijdige lymfatische en bloedvaatbemonstering

Ons laboratorium bestudeert de rol van het lymfestelsel bij ontstekings- en cardiometabole ziekten en ontwikkelt strategieën voor medicijnafgifte om de lymfekaten te richten op de behandeling van deze ziekten. Dit protocol maakt evaluatie mogelijk van leverprocessen, waaronder medicijnmetabolisme, nutriëntenstroom, immuunsignalering en leverrespons onder diverse omstandigheden. Om te beginnen plaats je een verdoofde mannelijke Sprague-Dawley-rat van ongeveer 250-300 gram die succesvol is gecannuleerd via de halsslagader en de halsader in dorsale liggeving onder een chirurgische microscoop.

Maak een horizontale huidincisie van 4-5 centimeter van de middenlijn tot de rechterflank, ongeveer 1,5-2 centimeter onder de ribbenkast. Trek de huid terug en maak bijpassende incisies in de externe en interne schuine buikspieren. Kauteriseer of ligaer alle grote bloedvaten die tijdens de procedure worden aangetroffen.

Gebruik zoutwaterbevochtigde wattenstaafjes om de lever naar het middenrif te bewegen, de maag naar links en de dunne darm naar beneden. Houd de organen ingetrokken met zoutwaterdoordrenkt gaas. Identificeer de leverlymfebuis die parallel loopt aan en iets caudaal van de leverslagader, mediaal van de rechternier en grenzend aan de inferieure vena cava.

Gebruik de grotere ondoorzichtige of witte mesenterische lymfebuis als anatomisch herkenningspunt om de doorschijnende en smalle hepatische lymfebuis caudaal te identificeren. Gebruik een rechte Graefe-tang om het bindweefsel boven de lymfebuis en de vena cava te verwijderen. Breng de pincet door het vetbed onder de rechternier om een tunnel onder de vena cava te creëren.

Schuif de pincet naar voren totdat de punten parallel aan de leverlymfebuis aan de tegenovergestelde kant van de vena cava uitkomen. Gebruik de tang om het buitenste uiteinde van de vooraf voorbereide canule vast te pakken en trek de canule door de tunnel totdat de punt aan de tegenovergestelde kant tevoorschijn komt. Gebruik de Halsted Mosquito Hemostat-tang om de punt van een 25-gauge naald ongeveer 90 graden te buigen.

Met de gebogen naald prikt je voorzichtig het leverlymfekanaal aan de rechterkant, het dichtst bij de operator. Controleer de canule vooraf gevuld met een antistollingsoplossing en verwijder luchtbellen, als die er zijn. Steek het afgeschuinde uiteinde ongeveer 2 millimeter in het kanaal.

Controleer de lymfestroom aan het buitenste uiteinde van de canule op ongeveer 100 microliter per uur. Pas de canule aan of plaats deze opnieuw als er geen doorstroming wordt waargenomen. Stop de canule aan het verzameluiteinde en breng vervolgens een klein druppeltje veterinaire lijm aan om de inzetplaats te bevestigen.

Zodra de lijm droog is, controleer dan de lymfestroom door de slang. Verwijder daarna het gaas en zet de organen terug op hun oorspronkelijke positie. Plaats de afzuigbuis met de antistollingsoplossing onder de canule-uitlaat en controleer dat lymfe druppelgewijs de buis binnenstroomt.

Sluit vervolgens de buikwand door de interne schuine huidlagen, de externe schuine buik en huidlagen achter elkaar te hechten. Direct na de leverlymfecannulatie start u de rehydratatie door steriele zoutoplossing van 1,5-3,0 milliliter per uur via de jugularadercanule toe te voegen. Monitor ademhaling en reflexen terwijl je de narcose behoudt via een neuskegel.

Na therapeutische dosering via de jugularadercanule, wordt de leverlymfe continu verzameld in buisjes met een antistollingsoplossing. Vervang de verzamelbuizen elk uur of indien nodig. Verzamel bloedmonsters van de halsslagader op aangewezen tijdstippen, waarbij het totale volume onder 10% van het geschatte circulerende bloedvolume blijft vóór de terminale bemonstering.

Open de buikincisie opnieuw om de bovenbuikholte bloot te leggen, terwijl diepe verdoving en stabiele ademhaling behouden blijven. Gebruik met zoutoplossing bevochtigd gaas om de lever voorzichtig terug te trekken richting het middenrif, de maag naar links en de dunne darm naar beneden. Identificeer de leverarterie die parallel loopt aan de leverlymfebuis naast de mesenterische lymfebuis.

Verkrijg een polyvinylcanule met een buitendiameter van 0,61 millimeter en een binnendiameter van 0,28 millimeter, vooraf gevuld met een antistollingsoplossing, en verwijder eventuele luchtbellen. Isoleer met gebogen irispincet een kort segment van de leverslagader. Plaats een 4-0 zijden hechting onder de slagader.

Til voorzichtig de slagader op en plaats een tweede hechting distaal van de eerste. Bind de distale hechting om de terugstroom te beheersen terwijl de proximale hechting niet wordt vastgebonden voor latere sluiting. Maak met behulp van een fijnpunt-microschaar een kleine dwarsdoorsnijding van ongeveer 0,5 millimeter in de slagaderwand tussen de hechtingen.

Gebruik de punt van de Dumont-tang om de vaatflap op te tillen en zo het vatlumen te stabiliseren voor het inbrengen van de canule. Steek het afgeschuinde uiteinde van de polyvinylcanule in de opening en schuif de canule ongeveer 2-3 millimeter naar voren. Bevestig de canule door de proximale hechting rond zowel het vat als de canule vast te binden.

Controleer de juiste plaatsing door voorzichtig een kleine hoeveelheid felrood arterieel bloed te aspireren. Verzamel 0,5-1 milliliter bloed in een vooraf gelabelde buis met antistollingsmiddel. Lymfatische herstel van intraveneus toegediende macromoleculaire therapieën over thoracale, hepatische en mesenteriale lymfe toont het nut van het model voor het evalueren van lymfatisch transport.

Hepatische lymfe heeft een aanzienlijk lager totaal lipidengehalte dan thoracale en mesenterische lymfe, terwijl de eiwitconcentratie vergelijkbaar is met die van andere lymfebronnen. Dit protocol maakt gelijktijdige metingen van leverlymfe en bloed mogelijk om transport, metabolisme en clearance van moleculen, waaronder medicijnen, voedingsstoffen en signalen, te evalueren. Nauwkeurige canulatie van het leverlymfekanaal is technisch uitdagend en vereist zorgvuldige anatomische identificatie en chirurgische techniek.

Toekomstige studies kunnen deze techniek gebruiken om levertransport, clearance en metabolisme in kaart te brengen, waardoor het begrip van leverziekten en gerichte therapieën wordt vergroot.