Een geïntegreerde methode voor fototrombotische beroertemodellering en in vivo optroderegistratie van neuronale en astrocytische activiteit bij zich gedragende muizen

Ons onderzoek ontwikkelt een geïntegreerde methode om gelijktijdig de activiteit van astrocyten en neuronen te registreren tijdens een ischemisch infarct bij bewegende muizen. Vorige methoden registreerden neuronen of astrocyten afzonderlijk. Ons protocol legt astrocyten- en neuronensignalen gelijktijdig vast vanaf het exacte moment van het begin van het infarct.

Begin met het overbrengen van een diep geanestheseerde C57BL/6J-muis naar het stereotaxische frame dat is uitgerust met een anesthesiemasker. Controleer elke 10 minuten de diepte van de anesthesie, terwijl de lichaamstemperatuur van de muis tussen 36 en 37,5 °C wordt gehouden met een feedback-gestuurde warmtemat. Zet de muis vast in het stereotaxische frame met oorstaven en een mondstaf, nadat er oogzalf in de ogen is aangebracht.

Bevestig de fixatie van de kop door voorzichtig te sonderen zodra de kop symmetrisch is vastgezet. Na ontharing en een antiseptische huidpreparatie wordt met een chirurgische schaar een incisie in de middellijn gemaakt. Reinig het periosteum met zoutoplossing en wattenstaafjes om het bregma en lambda bloot te leggen.

Laat de glazen micropipet zakken om achtereenvolgens bregma en lambda aan te raken. Noteer de Z-coördinaat op de digitale schuifmaat en stel de mondstang bij totdat het verschil minder dan 0,04 millimeter is. Laat de glazen micropipet zakken om bregma aan te raken en zet de digitale schuifmaat terug naar nul.

Verplaats de micropipet opeenvolgend 2,3 millimeter naar links en rechts van bregma. Noteer de Z-coördinaat en stel de oorstaven bij totdat de bilaterale verschillen kleiner zijn dan 0,04 millimeter. Nadat de digitale schuifmaat bij bregma op nul is gezet, markeert u het gebied van de motorische cortex voor de voorpoten op anterior-posterior plus 1,5 millimeter en mediaal-lateraal plus 0,74 millimeter.

Gebruik een microboor en ronde boortjes van 0,5 millimeter om een klein gaatje te boren, met een diameter van ongeveer 0,5 millimeter op de gemarkeerde locatie. Meng vóór het laden de twee adeno-geassocieerde virale vectoren in gelijke volumes en centrifugeer het monster kort. Laat de glazen micropipet die is verbonden met de micro-infusiepomper naar de doellocatie zakken op een dorso-ventrale diepte van minus 0,94 millimeter vanaf het breinoppervlak.

Infuseer 400 nanoliters van het virale mengsel, bestaande uit 200 nanoliters van elke vector, met een snelheid van 50 nanoliters per minuut. Trek de pipet langzaam terug 10 minuten nadat de infusie is voltooid. Hecht de hoofdhuid met 4-0 20 millimeter, 3/8 cirkel hechtdraad en plaats de muis op een warmtemat tot het volledige herstel is bereikt.

Drie tot vier weken na de virale injectie volgt men de eerder gedemonstreerde procedure tot aan de incisie van de hoofdhuid. Verwijder tijdens de incisie van de hoofdhuid een stuk hoofdhuid van 1,5 centimeter bij 1,5 centimeter, terwijl er voldoende huid rond de ogen behouden blijft. Reinig de schedel met waterstofperoxide en 0,9% zoutoplossing.

Nadat bregma is geïdentificeerd, stelt u de digitale schuifmaat opnieuw in op nul. Gebruik een ronde boorpunt van 0,8 millimeter om het schedeloppervlak licht op te ruwen. Markeer het gebied van de motorische cortex voor de voorpoten.

Op anterieur-posterieur 1,5 millimeter en mediaal-lateraal 0,74 millimeter. Gebruik de markering als middelpunt om een vierkant van vijf millimeter bij vijf millimeter te tekenen. Gebruik een microboor bij ongeveer 10.000 omwentelingen per minuut om het vierkant uit te slijpen.

Breng continu ijskoude zoutoplossing aan op het boorpad en stop onmiddellijk als de botlap losraakt. Boor drie kleine gaatjes met een diameter van 0,5 millimeter in de contralaterale hemisfeer en het cerebellum. Implanteer cranioplastie-schroeven in de gaatjes.

Zorg ervoor dat elke schroef de dura mater bereikt, maar niet verder penetreert om beschadiging van het hersenweefsel te voorkomen. Gebruik een pincet om de losgemaakte botlap te verwijderen. Gebruik ultrafijne pincetten met een ultrafijne tip kleiner dan 0,03 millimeter bij 0,01 millimeter om de dura bij het craniële venster te verwijderen, terwijl direct contact met het hersenweefsel wordt vermeden.

Bevestig de optrode aan de arm van de micromanipulator van het stereotaxische frame en beweeg deze boven het schedervenster. Verstrengel de zilveren aardings- en referentiedraden van de optrode stevig met de drie cranioplastie-schroeven. Maak het oppervlak van het schedervenster schoon met steriele zoutoplossing.

Laat de optrode langzaam zakken tot de gewenste dorso-ventrale diepte van minus 0,94 millimeter met een snelheid van één millimeter per 10 seconden. Breng na implantatie een laag agarose aan over het craniale venster. Breng drie tot vier lagen tandheelkundig cement aan.

Zodra het tandcement is uitgehard, dient er gedurende drie tot vijf dagen analgesie te worden toegediend en moet de muis één tot twee weken herstellen. Gebruik een fiberfotometrie-systeem met een dubbele of drievoudige golflengte om GCaMP6s te exciteren. Stel het signaalkanaal in op 470 nanometers en het controlekanaal op 410 nanometers.

Stel de beeldsnelheid in op 60 frames per seconde. Aard nu alle componenten van het opnamesysteem correct. Gebruik tijdens de opname een gemeenschappelijke mediane referentie.

Verifieer in de opnamesoftware of de breedbandsignalen en lokale veldpotentiaalsignalen zijn geselecteerd, terwijl gedurende de gehele opnamesessie wordt gecontroleerd op ruis. Nadat de muis kortstondig is geanestheseerd, wordt de optrode via een adapter op de opnamelijn aangesloten. Plaats de muis voor de opname in een omgeving die lijkt op een thuiskooi.

Sta 10 minuten acclimatisatie toe na het ontwaken. Neem de muis op tijdens het uitvoeren van de gripkrachttest, waarbij gedurende vijf minuten één trekpoging per minuut is vereist. Geef de gedragstesten nauwkeurig een tijdstempel in zowel de multichannel- als de fiber-photometriesystemen.

Dien een 1,5% Rose Bengal-kleurstofoplossing intraperitoneaal toe in een dosis van 10 tot 20 milligram per kilogram en wacht vijf minuten. Sluit de optrode-sonde aan op de laserbron zodra een diepe anesthesie is bereikt en in stand wordt gehouden. Straal een laserbundel van 530 nanometer bij 15 milliwatt gedurende vijf tot acht minuten via de geïmplanteerde optrode uit om focale ischemie op te wekken.

Om optogenetische stimulatie uit te voeren, sluit u de laserstimulator aan op de optrode. Schakel de 488 nanometer optogenetische laserstimulator in en stel deze voor Opto-vTrap in op 10 milliwatt gedurende vijf minuten. Plaats de muis tot slot op een warmteplateau voor het herstel.

Vergeleken met de nulmeting nam de cerebrale bloedstroom af na fototrombose en bleef deze onderdrukt op één dag en zeven dagen na de beroerte. De grijpkracht van de voorpoot vertoonde een zeer significante afname na één dag en bleef onderdrukt na zeven dagen na de beroerte. De astrocytaire calciumtransiënten geregistreerd via fiberfotometrie en neuronale spikes uit elektrofysiologie werden uitgelijnd op basis van tijdstempels.

Na een fototrombotische beroerte waren de vuurfrequenties in zowel piramidale neuronen als interneuronen significant onderdrukt in vergelijking met de baseline-vuuractiviteit tijdens de grijptest met de voorpoot. Bij de baseline bereikten de astrocytaire calciumtransiënten hun piek binnen vier tot zes seconden na het begin van de taak. De amplitude was echter significant verlaagd na de fototrombotische beroerte, wat wees op een verzwakte calciumactiviteit.

Rasterplots en peri-stimulus tijdhistogrammen toonden veranderingen in de neuronale activiteit tijdens optische stimulatie. Zowel de vuursnelheden van de piramidale neuronen als die van de interneuronen vertoonden een significante afname na optische stimulatie vergeleken met de baseline vóór de stimulatie, wat bevestigt dat astrocytmodulatie een meetbaar downstream-effect heeft op de exciteerbaarheid van het lokale circuit. Dit protocol maakt een ononderbroken registratie van beweging en neuroactiviteit mogelijk over de gehele tijdlijn na een beroerte, van de acute fase bij aanvang tot de chronische fase.

Het succes van dit protocol is afhankelijk van een nauwkeurige of gecoördineerde uitlijning. Monoculaire optrode-implantatie en voldoende virusexpressie over de verschillende operaties heen zijn essentieel. Toekomstig onderzoek zou meerdere implantaten kunnen gebruiken om bredere hersengebieden te monitoren of verschillende celtypen te targeten met diverse gedragsassays.