Een microfluïdisch systeem voor het modelleren van endotheeldisfunctie onder gecombineerde fysiologische pulserende schuifspanning en oscillerende hyperglykemie

Deze studie onderzoekt hoe gesynchroniseerde oscillerende hyperglykemie en pulsatile schuifspanning samen endotheeldisfunctie bij diabetische vasculaire ziekten aansturen. Bestaande modellen gebruiken een beginnend hoge glucose- of een stabiele laminaire stroming. We onderzoeken hoe pulsatiele schuifspanning oscillerende glucoseschade tegenwerkt.

Om te beginnen gebruik je computerondersteunde ontwerpsoftware om de structuur van de microfluïdische chip te ontwerpen. Maak de SU-8 mastermal via een commercieel bedrijf. In een schone mengbeker meng je het polydimethylsiloxaan-uithardingsmiddel en de pre-polymeer in een verhouding van 10:1 naar gewicht en roer je het mengsel krachtig met de hand gedurende vijf minuten.

Plaats vervolgens de container in een vacuümkamer bij een druk van 0,08 megapascal gedurende minstens 15 minuten om luchtbellen te verwijderen die tijdens het mengen zijn vastgehouden. Giet de polydimethylsiloxaan op de wafer die in een glazen petrischaal is geplaatst. Degas de polydimethylsiloxaan die nog eens 15 minuten op de wafer in een desiccator wordt gegoten om eventuele bubbels die tijdens het gieten zijn gevormd te verwijderen.

Plaats de petrischaal met de vorm en het polymeer twee uur in een hete oven op 80 graden Celsius. Met een scalpel pelt u voorzichtig de gestolde polymeerplaat van de mastermal. Met een kernponsgereedschap maak je inlaat- en uitlaatpoorten aan de aangewezen kanaaluiteinden op de polymeerplaat.

Maak de glazen afdekplaat en het patroonoppervlak van de polymeerplaat schoon met lijmtape. Behandel vervolgens zowel de polymeerplaat als de slip van de glazen afdekking met een plasmareiniger van 65 watt onder kamerlucht gedurende 60 seconden. Lijn het polymeerkanaalvlak onmiddellijk uit met de behandelde zijde van de glazen afdekking.

Druk dan voorzichtig om een permanent gesloten microfluïdisch kanaal te creëren. Plaats de gebonden microfluïdische chip in een geboroniseerde glazen fles gevuld met gedeïoniseerd water. Steriliseer door autoclaven bij 121 graden Celsius en 15 pond per vierkante inch gedurende 20 minuten.

Plaats de gesteriliseerde chip in een kweekschaal van 60 millimeter gevuld met een equimolair mengsel van PBS en DMEM met een laag glucoseniveau. Vervolgens breng je met een spuit van één milliliter 100 microgram per milliliter fibronectine in het kanaal en breng je vier uur bij 37 graden Celsius uit. Voeg vervolgens 24,5 millimolair demanitol toe aan DMEM met een laag glucosegehalte om de osmotische druk te verhogen.

Voeg vijf millimolaire D-glucose toe aan een DMEM met een hoge glucose om een uiteindelijke concentratie van 30 millimolaire glucose te verkrijgen. Bereid een normaal glucosekweekmedium en een hoog glucosekweekmedium voor, aangevuld met 20% FBS en 1% penicillinestreptomycine. Daarna warm PBS, trypsine met een normaal glucosekweekmedium en een hoog glucosekweekmedium in een waterbad bij 37 graden Celsius.

Oogst de menselijke navelader endotheelcellen uit de kweekschotel bij 90% confluentie. Verwijder de cellen met 0,25% trypsine-EDTA-oplossing. Na het incuberen van de cellen bij 37 graden Celsius gedurende 30 seconden, tel je de geoogste cellen en suspendeer je ze afzonderlijk opnieuw in normale glucose- en high glucose-media in een concentratie van 1 keer 10 tot de kracht van 6 cellen per milliliter.

Met een injectie van één milliliter injecteer je 100 microliter celsuspensie in de inlaatpoort van de microfluidische chip met normaal glucosemedium voor de controlegroep en een hoog glucosemedium voor de experimentele groep. Plaats de microfluidische chips in een bevochtigde broedmachine bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide gedurende 48 uur. Bereken de benodigde debiet om de beoogde pulsatiele schuifspanning te bereiken met behulp van de gepresenteerde vergelijking.

Verbind de drukbron met de drukregelaar. Koppel vervolgens de drukregelaar aan de klepregelaar die aan de computer is gekoppeld voor geautomatiseerde controle van drukgolfvormen. Vul twee reservoirs van 100 milliliter, één met een normaal glucosekweekmedium en de andere met een medium met een hoog glucosekweekmedium.

Verbind de reservoirs met de overeenkomstige kanalen van de drukregelaar. Verbind vervolgens de reservoirs en de twee-standen drieweg-magnetische klep met siliconenleiding. Stel de fysiologische pulsatieve schuifspanning in die overeenkomt met een debiet van ongeveer 200 microliter per minuut.

Programmeer de programmeerbare luchtpomp om een sinusgolffunctie te genereren om de pulsatieve schuifspanning te behouden. Programmeer vervolgens de klepcontroller om elke vijf minuten van kanaal te wisselen om een vierkante golf glucose-oscillatie te genereren tijdens dynamische stimulatie. Verbind het drieweg-magnetische ventiel met twee standen en de microfluidische chip met siliconen slangen.

Vervolgens start je het programmeerbare pompsysteem om de slangen te primen. Vervolgens bevestig je met de 1,3 millimeter diameter 90 graden schuine roestvrijstalen connectoren de inlaat- en uitlaatpoorten van de microfluidische chip aan de buis. Verbind de microfluidische chip-uitlaat met het afvalreservoir en start de pomp opnieuw om een gecombineerde oscillerende glucose- en pulsatieve schuifspanning gedurende in totaal 30 minuten te leveren.

Na het uitvoeren van de verificatie van het flowveld bereidt u de calceïne AM en propidiumjodide werkoplossing voor volgens de instructies van de fabrikant op het experimentele eindpunt. Zodra het kanaal één keer is gespoeld met PBS, breng je de calceïne AM en propidiumjodide werkoplossing in het kanaal en breng je het in het donker 30 minuten uit bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide. Maak onmiddellijk fluorescerende beelden van de gekleurde cellen met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop uitgerust met een 10-voudig objectieflens.

Maak onmiddellijk fluorescentiebeelden van de gekleurde cellen met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop uitgerust met een 10x objectieflens. Gebruik het fluoresceïne isothiocyanaat groene filter voor calceïne AM en het tetramethylrhodamine- of rhodamine rode filter voor propidiumjodide. Na het kanaal drie keer met PBS te hebben doorspoeld, breng je de levende cel oxidatieve stressfluorescerende probe-oplossing in het kanaal en incubeer je zoals eerder gedemonstreerd.

Spoel het kanaal drie keer door met PBS om de ongebonden probe te verwijderen. Maak onmiddellijk fluorescerende beelden met het verre rode filter dat wordt geplaatst via een 20x objectieflens, terwijl je identieke belichtingsparameters behoudt in alle groepen. Open de verworven calceïne AM groene en propidiumjodide rode beelden in ImageJ.

Stel handmatig de drempel voor elk kanaal aan om fluorescerende signalen van de achtergrond te onderscheiden. Gebruik de celteller om fluorescerende cellen te kwantificeren, waarbij de minimale celgrootte wordt aangepast op basis van observaties om het aantal levende en dode cellen over meerdere gezichtsvelden te bepalen. Bereken het percentage levende cellen met spreadsheetsoftware voor elke experimentele conditie.

Bereken vervolgens het gemiddelde en de standaardafwijking over meerdere gezichtsvelden met behulp van statistische analysesoftware om groepen te vergelijken. Sleep de afbeelding van keuze naar ImageJ. Selecteer Analyseren en kies Set Scale om de pixelgrootte te kalibreren met behulp van de microscoopmetadata.

Verwijder vervolgens het niet-specifieke uniforme achtergrondsignaal uit het hele beeld met de achtergrondaftrekfunctie door Proces te selecteren en Achtergrond aftrekken te selecteren. Selecteer vervolgens Afbeelding en selecteer Aanpassen gevolgd door Drempel om handmatig de drempelschuif aan te passen en het intracellulaire reactieve zuurstofsignaal te definiëren. Stel de metingen in door Analyseren te selecteren en Kies Metingen instellen om Oppervlakte- en Gemiddelde grijswaarde op te nemen.

Selecteer Analyseren en Analyseren Deeltjes om de minimale celgrootte te bepalen op basis van waargenomen celafmetingen en de gemiddelde intensiteit van het gesegmenteerde signaal binnen de ROI van de celmonolaag te meten. Rapporteer het reactieve zuurstofniveau voor elke experimentele conditie als het gemiddelde van gemeten waarden afkomstig van ten minste drie willekeurig geselecteerde gezichtsvelden per chip. Voer de kwantitatieve resultaten in data-analyse- en grafieksoftware.

Bepaal de statistische significantie door experimentele groepen te vergelijken met de controlegroep via een tweerichtingsanalyse van de variantie, gevolgd door een Tukey post-hoc test met een significantieniveau van 0,05. Gebruik de software om de analyse uit te voeren en genereer grafieken met foutbalken die standaardafwijking weergeven. Representatieve fluorescentiebeelden toonden een hoog aandeel levensvatbare cellen in alle groepen met verwaarloosbare celdood waargenomen in de normale glucose en normale glucose met pulsatieve schuifstressgroepen, terwijl de oscillerende glucose- en oscillerende glucosegroepen met pulsatiele schuifstressgroepen een zichtbare toename van dode cellen vertoonden.

Kwantitatieve analyse toonde aan dat oscillerende glucose-blootstelling resulteerde in een significante vermindering van de cellevensvatbaarheid vergeleken met de controlegroep, en dat de toepassing van pulserende schuifstress onder oscillerende glucosecondities de levensvatbaarheid significant verhoogde vergeleken met oscillerende glucose alleen. Onder normale glucosecondities waren de intracellulaire reactieve zuurstofniveaus laag en werden verder verlaagd na het toepassen van schuifspanning. Terwijl oscillerende glucosecondities een duidelijke toename van de intensiteit van rode fluorescentie veroorzaakten, wat wijst op verhoogde reactieve zuurstofverbindingen.

De oscillerende glucose-geïnduceerde toename van intracellulaire reactieve zuurstofsoorten werd verminderd na de toepassing van schuifspanning. Kwantitatieve analyse toonde aan dat schuifspanning het niveau van reactieve zuurstofstoffen onder normale glucoseomstandigheden aanzienlijk verminderde. Daarentegen leidden oscillerende glucosecondities tot een significante toename van het niveau van reactieve zuurstofsoorten ten opzichte van normale glucose.

Bovendien verlaagde schuifspanning het niveau van reactieve zuurstofsoorten significant, zelfs onder oscillerende glucoseomstandigheden. Dit protocol maakt het mogelijk ROS-niveaus en de beschikbaarheid van cellen te kwantificeren om endotheeldisfunctie te bestuderen onder oscillerende hyperglykemie en de pulserende schuifspanning. Na deze procedure kan moleculaire analyse, zoals de NRF2-route of iNOS-signalering, worden uitgevoerd om endotheelbeschermingsmechanismen te enucleeren.

Toekomstig onderzoek zou dit systeem kunnen gebruiken om mechanobiologische routes te onderzoeken, de stroomgeometrieën te verstoren of co-cultuur van gladde spiercellen te co-culturen.