Amikacine Beschermingsassay voor Kwantificering en Visualisatie van Escherichia coli-celinvasie

We richten ons op het karakteriseren van hoe adherente invasieve E. coli intestinale epitheelcellen binnendringen en het identificeren van bacteriële factoren die bijdragen aan dit proces. Gentamycineresistente isolaten beperken traditionele invasie-assays. Dit op amikacine gebaseerde protocol maakt nauwkeurige kwantificering van intracellulaire bacteriën mogelijk.

Om te beginnen verzamel je alle reagentia en media die nodig zijn voor de invasietest. Haal vervolgens de bevroren glycerolvoorraad van adherent-invasive Escharicia colli, of AIEC, stam uit de 80 graden Celsius vriezer. Met een steriele houten stok of pipettip schraapt je voorzichtig bacteriën van de steel en streep je deze over een Luria-Bertani, of LB, boorplaat om enkele kolonies te verkrijgen.

Breng de plaat 's nachts uit bij 37 graden Celsius. De volgende dag plukt je met een steriele houten stok of pipettip een enkele kolonie van de schrootplaat. Inoculeer de kolonie in 3 milliliter LB-bouillon en broed de cultuur uit bij 37 graden Celsius bij 200 omwentelingen per minuut gedurende de nacht.

Daarna voer je een verdunning van 1 tot 10 keer uit van de nachtkweek in 1 milliliter LB-bouillon. Meet de optische dichtheid op 600 nanometer van de verdunde cultuur met behulp van een spectrofotometer. Breng 100 microliter van de nachtkweek over in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en centrifugeer op 6.000 G gedurende 10 minuten bij 4 graden Celsius.

Aspireer het supernatant voorzichtig zonder de celpellet te verstoren en suspendeer de pellet opnieuw in 1 milliliter serum en antibiotica-antimycoticavrij medium. Bereken het benodigde volume bacteriële suspensie om een multipliciteit van infectie of MOI van 10 te bereiken met behulp van de verstrekte formule. Om het infectiemedium voor te bereiden, breng je het berekende volume bacteriële suspensie over in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en breid je het volume tot 1 milliliter met serum en antibiotica-antimycotica-vrije media.

Meng voorzichtig door meerdere keren op en neer te pipetteren. Bereid een 96-well-plaat voor om de kolonievormende eenheden per milliliter van de verdunde nachtelijke bacteriële cultuur te bepalen door tienvoudige seriële verdunningen uit te voeren in steriele 1X PBS. Breng 200 microliter van de verdunde nachtkweek over in de eerste put van de plaat.

Pipetteer 20 microliter van de cultuur in de volgende rij met 180 microliter 1x PBS. Meng door 10 keer op en neer te pipetteren en herhaal het verdunningsproces tot je 10 uitmaakt in de kracht van 6, waarbij je telkens een nieuwe pipettip gebruikt. Plaats nu 10 microliter spotverdunning in drievoud van de 10 tot de macht van 2 tot 10 tot de kracht van 6 verdunningen op LB boorplaten.

Laat de plekken bij een vlam in de boor worden opgenomen. Breng de platen een nacht uit bij 27 tot 30 graden Celsius om overgroei van kolonies te voorkomen en om duidelijke individuele kolonies te verkrijgen. Verwijder de gezonde confluente Caco-2 epitheelcelmonolagen, gekweekt in een collageenbedekte 24-put kweekplaat uit de broedmachine en aspiratief het volledige medium uit elke put.

Pipette één milliliter serum en antibiotica-antimycoticumvrij medium in elke put. Aspireer het medium om sporen van het medium te verwijderen en herhaal de wash nog één keer voor in totaal twee wasbeurten. Voeg nu 1 milliliter van het eerder voorbereide infectiemedium met AIEC toe aan elke put van de 24-put plaat met de Caco-2 cellen.

Centrifugeer de 24-wellplaat op 500G gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur om bacteriecontact te synchroniseren met de epitheelmonolaag en incubeer de plaat bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide gedurende drie uur, zodat een bacteriële invasie mogelijk kan worden. Bereid antibiotica-bevattende media voor door 240 microgram per milliliter amicacine toe te voegen aan voorverwarmd serum en antibiotica-antimycoticavrij medium. Na de infectieperiode aspireer je het medium uit de Caco-2 celmonolagen en was je elke put met 1 milliliter serum en antibiotica-antimycoticumvrij medium.

Aspireer het medium en herhaal de wash nogmaals voor in totaal twee wasbeurten. Pipetteer vervolgens één milliliter van 240 microgram per milliliter amicacine-bevattende media in elke put. Tegelijkertijd behandel je een andere groep cellen met 100 microgram gentamicine per milliliter ter vergelijking en incubeer je de cellen bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide gedurende 1 uur om extracellulaire bacteriën te elimineren.

Na de incubatie aspireer je het medium uit elke put. Voeg 1 milliliter PBS toe om hechtende bacteriën weg te spoelen. Aspiraat de PBS en herhaal de wasbeurt nog één keer voor in totaal twee wasbeurten.

Voeg nu 200 microliter van 1% Triton X100, verdund in PBS, toe aan elke put en incubeer op een orbitale shaker met 90 omwentelen per minuut gedurende 10 minuten om epitheelcellen te lyseren. Pipetteer ongeveer 30 keer per put om de cellen van de plaat los te maken. Vervolgens voer je tienvoudige seriële verdunning uit van de cellysaten in een 96-wellplaat met PBS.

Plaat 10 microliter spotverdunning in drievoudig formaat van de onverdunde naar 10 verdunde verdunningen op de kracht van 3 verdunningen op LB-boorplaten. Nadat de vlekken droog zijn, broeden de platen een nacht uit bij 27 tot 30 graden Celsius om duidelijke individuele kolonies te verkrijgen. Na het broeden worden de platen verwijderd en goed geïsoleerde kolonies geteld uit de juiste vlekkenverdunningen met meer dan zeven kolonies per vlek over de drievoudige verdunningen.

Tot slot bereken je het inoculum en de teruggewonnen kolonievormende eenheden per milliliter en procentuele invasie met behulp van de vergelijkingen. Behandeling met gentamicine of amikacine na infectie van Caco-2 celmonolagen met de invasieve AIEC-stam NRG857c, of de niet-invasieve Escherichia coli DH5 alfa-controlestam resulteerde in vergelijkbare invasieprofielen. Deze bevindingen gaven aan dat amicacine even effectief was als gentamicine in het elimineren van extracellulaire bacteriën en een nauwkeurige weerspiegeling van de intracellulaire bacteriële belasting.

De behandeling van gentamicineresistente klinische Escherichia coli-isolaten verkregen van patiënten met inflammatoire darmziekte met gentamicine resulteerde in zeer variabele bacteriële herstelwaarden variërend van ongeveer 21 tot 2.788%. Daarentegen verminderde de behandeling met amicacine het herstel van de bacterie in alle isolaten aanzienlijk, wat de effectiviteit aantoont en betrouwbaardere invasiemetingen mogelijk maakt. Dit protocol maakt nauwkeurige kwantificering van intracellulaire bacteriën mogelijk en de beoordeling van bacteriële invasie in epitheelcellen. Aanvullende methoden zoals immunofluorescentiemicroscopie kunnen worden gebruikt om bacteriële invasie verder te valideren en intracellulaire lokalisatie te valideren.

Toekomstige studies kunnen nieuwe virulentiefactoren identificeren en gastheerpaden onderzoeken die worden aangevallen tijdens een adherente invasieve E.coli-infectie.