Driedimensionale immunolokalisatie in maïsmeiocyten

Ons onderzoek richt zich op de ontwikkeling van een 3D-benadering om mannelijke meiocyten van maïs te bestuderen en meiotische eiwitten in individuele cellen te visualiseren. Naast maïs kan dit protocol worden toegepast om meiocyten in rijst, rogge, gerst en tarwe te bestuderen. Begin met het verkrijgen van maïsplanten in het V13-stadium, waarbij de bloeiwijzen nog in de stengel groeien.

Druk tijdens de week van de mitotische fixatie van de helmknoppen met handschoenen aan zachtjes op de verdikte stengel bij de zwelling om te controleren of deze zacht genoeg is om open te snijden. Bereid na het maken van de benodigde buffers een bevochtigingskamer voor door vijf tot 10 vochtige papieren handdoeken in een plastic doos te plaatsen. Verwijder overtollig water uit de kamer.

Snijd met een scheermes de stengel open ter hoogte van de bloeiwijze om de pluimtakken en zijtakken bloot te leggen. Nadat de zijtakken zijn gedisseceerd en verzameld, worden deze in de handdoeken van de bevochtigingskamer gewikkeld, terwijl de kamer op kamertemperatuur wordt gehouden. Verzamel met een stereomicroscoop verse helmknoppen uit de bloempjes in een Petri-schaal van 35 millimeter met twee milliliters van één X buffer A of BA. Identificeer de mitotische stadia op basis van grootte en kleur.

Nadat de helmknoppen naar een nieuwe Petri-schaal van 35 millimeter zijn overgebracht, voegt u drie milliliter fixeeroplossing toe aan de helmknoppen. Sluit de Petri-schaal af met parafilm om verdamping van formaldehyde te voorkomen. Plaats de Petri-schaal van 35 millimeter op de grotere Petri-schaal die op een rotatieve schudmachine is geplaatst, ingesteld op 40 tot 60 RPM bij kamertemperatuur gedurende 45 minuten.

Spoel de helften van de meeldraden met drie milliliters 1X BA. Nadat de meeldraden zijn overgebracht naar een kleine Petrischaal, wordt de schaal afgesloten en 45 minuten op een rotatieschudder bij kamertemperatuur geplaatst met een snelheid van 40 tot 60 RPM. Verplaats de meeldraden met schone pincetten naar een kleine Petrischaal van 35 millimeter die drie milliliters 1X BA bevat.

Zodra de Petrischaal stevig is afgesloten met parafilm, plaatst u de kleine Petrischaal in een grotere Petrischaal. Nadat u deze heeft afgedekt met aluminiumfolie, bewaart u het monster bij vier graden Celsius tot gebruik. Bereid op dag één twee milliliter acrylamide-oplossing door gelijke volumes acrylamide en twee XBA te mengen.

Ontgas de acrylamide-oplossing onder vacuüm gedurende vijf tot 10 minuten voordat natriumsulfiet en ammoniumpersulfaat worden toegevoegd. Aliquoteer 100 µL van een één-op-één mengsel van acrylamide en 2X BA in 1,5 ml buisjes, afhankelijk van het aantal voorbereide slides. Plaats stukken parafilm van twee centimeter bij twee centimeter over een petrischaal en positioneer deze onder een dissectiestereoscoop.

Nadat de pipetpunt met een schaar is afgeknipt, pipetteert u 50 µL BA-oplossing met antheren op de parafilm. Pipetteer 25 µL BA-oplossing op een ander gebied van de parafilm. Snijd vervolgens, terwijl u de antheren met een pincet vasthoudt, de uiteinden ervan af met een scalpel.

Zodra de meiocyten zijn uitgeperst, gebruikt u een pipet om ze over te brengen naar de 25 µL BA-druppel en mengt u deze voorzichtig. Pipetteer 10 µL van het meiocytenmengsel op een apart dekglas. Voeg snel vijf µL natriumsulfiet en vijf µL ammoniumpersulfaat toe aan een 1,5 mL buisje met acrylamide en twee XBA.

Pipetteer vijf microliters van dit mengsel op het dekglas en meng het met de meiocyten. Plaats een met polylysine gecoat dekglas er bovenop onder een hoek van 45 graden. Laat het mengsel 30 tot 50 minuten polymeriseren bij kamertemperatuur en scheid vervolgens voorzichtig de dekglazen met een scheermesje.

Plaats ze vervolgens met de zijde van het kussentje naar boven in een Petrischaal. Spoel het dekglas gedurende twee uur bij kamertemperatuur met één milliliter 1XPBS aangevuld met één millimolair ethylenediaminetetra-azijnzuur, of EDTA, en 1% Triton. Bereid primaire antilichamen van verschillende gastsoorten voor en combineer deze om onderscheidende signalen tijdens de detectie te garanderen.

Voeg 50 µL van het verdunde primaire antilichaam toe aan het midden van het dekglas met het kussentje. Plaats de Petrischaal vervolgens gedurende de nacht in een bevochtigingskamer. Bereid op dag twee 500 mL wasbuffer voor bestaande uit 1x PBS, 0,1% Tween 20 en 1 mM EDTA.

Verwijder de overnight-oplossing met een pipet. Was het dekglas twee keer met één milliliter wasbuffer. Na het verwijderen van de buffer wordt opnieuw één milliliter wasbuffer toegevoegd en volgt een incubatie van één uur bij kamertemperatuur.

Herhaal deze wasstap nog zeven keer. Dek na de laatste wasbeurt de schaal af en laat deze een nacht in een bevochtigingskamer staan. Bereid de secundaire antilichamen voor door ze te verdunnen in een verhouding van 1:50 in blokkeringsbuffer.

Voeg na het verwijderen van de wasoplossing 50 µL van het verdunde secundaire antilichaam toe aan het centrum van elk kussen. Plaats de Petri-schaal vervolgens gedurende twee uur bij kamertemperatuur in een bevochtigingskamer. Verwijder na afloop de oplossing uit de putjes en was vier keer met 1 mL wasbuffer, telkens gedurende één uur bij kamertemperatuur.

Was de put met één milliliter PBS gedurende 10 minuten en herhaal dit proces nog twee keer. Voeg 500 microliter DAPI, bereid in een eindconcentratie van één microgram per milliliter, toe aan de put en incubeer dit gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Haal het verlengde goud uit de vriezer bij vier graden Celsius en laat het ontdooien tot kamertemperatuur.

Was de objectglazen gedurende 30 minuten met één milliliter PBS en herhaal dit twee keer. Nadat de laatste wassolution is verwijderd, worden twee druppels prolonged antifade in het midden van het kussentje aangebracht. Zodra het dekglas uit de put is getild, wordt het op de gelabelde objectglazen gemonteerd.

Verwijder met een vacuümpomp overtollig glycerol van de randen van het dekglas en verzegel dit met twee lagen nagellak. Observeer de preparaten onder een microscoop met gebruik van geschikte excitatiegolflengten en filters om beelden vast te leggen. DAPI-kleuring toonde een duidelijke kern en chromatinekleuring, samen met zwakkere natuurlijke cytoplasmatische kleuring van plastiden- en mitochondriaal DNA.

Afwezigheid van first division one of AFD1, asynaptic one of ASY1 en Zipper1 of ZYP1 gelokaliseerd op chromosomen en in het cytoplasma tijdens het preleptineem. In latere stadia concentreerde het signaal zich op het chromosoom, terwijl aanzienlijke hoeveelheden ZYP1 in het cytoplasma bleven vóór volledige synapsis. De meiotische cohesine AFD1 vormde pas na het zygonema een lineaire structuur.

Tegelijkertijd met de vorming van lineaire filamenten van het synaptonemaal complex werd het ASY1-signaal relatief zwak nadat ZYP1 en AFD1 in lineaire structuren waren geladen. Dit protocol stelt onderzoekers in staat om eiwitco-lokalisatie en dynamiek, natuurlijke subcellulaire lokalisatie, 3D-chromosomale architectuur, meiotische progressie en fasering te bestuderen.

De belangrijkste uitdaging in dit protocol is het zorgvuldig selecteren van compatibele combinaties van primaire en secundaire antilichamen. Studies kunnen voortbouwen op dit werk door mannelijke en vrouwelijke meiose te vergelijken om het moleculaire mechanisme ten grondslag aan athelchasmi te onderzoeken.