Name: Reconstitutie van myosin-I-gemedieerde vertakte actine-assemblage in een bead-gebaseerde actine-komeetstaart-motiliteitsassay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-09-03T13:05:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Verken een in vitro actine-komeetstaart-assay om myosin-I-gemedieerde vertakte actine-assemblage te bestuderen. Deze methode maakt kwantitatieve analyse van netwerkvorming en krachtgeneratie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken dr. Daniel Safer en Rick Wike voor de uitstekende technische ondersteuning bij de eiwitzuivering. Wij danken dr. Roberto Dominguez, in het bijzonder dr. Malgorzata Boczkowska en dr. Grzegorz Rebowski, voor het genereus verstrekken van het Arp2/3-complex en de CapZ-eiwitten. Wij danken tevens dr. Luther Pollard, dr. Faviolla A. Báez-Cruz en alle leden van de laboratoria van Ostap en Dominguez voor hun waardevolle bijdragen gedurende het project. Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health-beurs R37 GM057247 (aan E.M.O.). E.M.O. en M.X. werden gedeeltelijk ondersteund door de National Science Foundation (CMMI-1548571). ChatGPT is gebruikt ter ondersteuning bij de taalredactie tijdens de revisie van het manuscript. De auteurs hebben alle door AI ondersteunde inhoud beoordeeld en bewerkt en dragen de volledige verantwoordelijkheid voor het uiteindelijke manuscript.

<ol>
	<li>Blanchoin L, Boujemaa-Paterski R, Sykes C, Plastino J. Actin dynamics, architecture, and mechanics in cell motility. Physiol Rev. 2014;94(1):235-63.</li>
	<li>Svitkina T. The actin cytoskeleton and actin-based motility. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2018;10(1).</li>
	<li>Papalazarou V, Machesky LM. The cell pushes back: The Arp2/3 complex is a key orchestrator of cellular responses to environmental forces. Curr Opin Cell Biol. 2021;68:37-44.</li>
	<li>Krendel M, Gauthier NC. Building the phagocytic cup on an actin scaffold. Curr Opin Cell Biol. 2022;77:102112.</li>
	<li>Yang C, et al. Actin polymerization promotes invagination of flat clathrin-coated lattices in mammalian cells by pushing at lattice edges. Nat Commun. 2022;13(1):6127.</li>
	<li>Clarke DN, Martin AC. Actin-based force generation and cell adhesion in tissue morphogenesis. Curr Biol. 2021;31(10):R667-R80.</li>
	<li>McConnell RE, Tyska MJ. Leveraging the membrane-cytoskeleton interface with myosin-1. Trends Cell Biol. 2010;20(7):418-26.</li>
	<li>Almeida CG, et al. Myosin 1b promotes the formation of post-Golgi carriers by regulating actin assembly and membrane remodelling at the trans-Golgi network. Nat Cell Biol. 2011;13(7):779-89.</li>
	<li>McIntosh BB, Ostap EM. Myosin-I molecular motors at a glance. J Cell Sci. 2016;129(14):2689-95.</li>
	<li>Pedersen RTA, Drubin DG. Type I myosins anchor actin assembly to the plasma membrane during clathrin-mediated endocytosis. J Cell Biol. 2019;218(4):1138-47.</li>
	<li>Barger SR, et al. Membrane-cytoskeletal crosstalk mediated by myosin-I regulates adhesion turnover during phagocytosis. Nat Commun. 2019;10(1):1249.</li>
	<li>Manenschijn HE, et al. Type-I myosins promote actin polymerization to drive membrane bending in endocytosis. eLife. 2019;8.</li>
	<li>Smith SL, et al. Class-I myosin responds to changes in membrane tension during clathrin-mediated endocytosis in human induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2026;123(9):e2532817123.</li>
	<li>Loisel TP, Boujemaa R, Pantaloni D, Carlier MF. Reconstitution of actin-based motility of Listeria and Shigella using pure proteins. Nature. 1999;401(6753):613-6.</li>
	<li>Akin O, Mullins RD. Capping protein increases the rate of actin-based motility by promoting filament nucleation by the Arp2/3 complex. Cell. 2008;133(5):841-51.</li>
	<li>Boujemaa-Paterski R, et al. Directed actin assembly and motility. Methods Enzymol. 2014;540:283-300.</li>
	<li>Sykes C, Plastino J. Reconstitution of actin-based motility with commercially available proteins. J Vis Exp. 2022;(188).</li>
	<li>Xu M, et al. Myosin-I synergizes with Arp2/3 complex to enhance the pushing forces of branched actin networks. Sci Adv. 2024;10(37):eado5788.</li>
	<li>Kawska A, et al. How actin network dynamics control the onset of actin-based motility. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012;109(36):14440-5.</li>
	<li>Cameron LA, Footer MJ, van Oudenaarden A, Theriot JA. Motility of ActA protein-coated microspheres driven by actin polymerization. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999;96(9):4908-13.</li>
	<li>Bernheim-Groswasser A, et al. The dynamics of actin-based motility depend on surface parameters. Nature. 2002;417(6886):308-11.</li>
	<li>van der Gucht J, Paluch E, Plastino J, Sykes C. Stress release drives symmetry breaking for actin-based movement. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(22):7847-52.</li>
	<li>Achard V, et al. A &#34;primer&#34;-based mechanism underlies branched actin filament network formation and motility. Curr Biol. 2010;20(5):423-8.</li>
	<li>Noireaux V, et al. Growing an actin gel on spherical surfaces. Biophys J. 2000;78(3):1643-54.</li>
	<li>Theriot JA, Mitchison TJ, Tilney LG, Portnoy DA. The rate of actin-based motility of intracellular Listeria monocytogenes equals the rate of actin polymerization. Nature. 1992;357(6375):257-60.</li>
	<li>Bieling P, et al. WH2 and proline-rich domains of WASP-family proteins collaborate to accelerate actin filament elongation. EMBO J. 2018;37(1):102-21.</li>
	<li>Funk J, et al. A barbed end interference mechanism reveals how capping protein promotes nucleation in branched actin networks. Nat Commun. 2021;12(1):5329.</li>
	<li>Gautreau AM, Fregoso FE, Simanov G, Dominguez R. Nucleation, stabilization, and disassembly of branched actin networks. Trends Cell Biol. 2022;32(5):421-32.</li>
	<li>Nakamura F, Osborn E, Janmey PA, Stossel TP. Comparison of filamin A-induced cross-linking and Arp2/3 complex-mediated branching on the mechanics of actin filaments. J Biol Chem. 2002;277(11):9148-54.</li>
	<li>Colin A, et al. Friction patterns guide actin network contraction. Proc Natl Acad Sci U S A. 2023;120(39):e2300416120.</li>
	<li>Colin A, et al. Recycling of the actin monomer pool limits the lifetime of network turnover. EMBO J. 2023;42(9):e112717.</li>
	<li>Suarez C, et al. Reconstitution of the transition from a lamellipodia- to filopodia-like actin network with purified proteins. Eur J Cell Biol. 2023;102(4):151367.</li>
	<li>Pollard LW, Boczkowska M, Dominguez R, Ostap EM. Myosin-1C differentially displaces tropomyosin isoforms altering their inhibition of motility. J Biol Chem. 2024;300(8):107539.</li>
	<li>Thompson CP, et al. Non-muscle tropomyosins inhibit myosin-19 and dynamically localize to mitochondrially associated actin filaments. J Biol Chem. 2026;302(5):111377.</li>
	<li>Bussonnier M, et al. Mechanical detection of a long-range actin network emanating from a biomimetic cortex. Biophys J. 2014;107(4):854-62.</li>
	<li>Paluch E, van der Gucht J, Joanny JF, Sykes C. Deformations in actin comets from rocketing beads. Biophys J. 2006;91(8):3113-22.</li>
	<li>Lewis JH, Lin T, Hokanson DE, Ostap EM. Temperature dependence of nucleotide association and kinetic characterization of Myo1b. Biochemistry. 2006;45(38):11589-97.</li>
	<li>Baez-Cruz FA, Ostap EM. Drosophila class-I myosins that can impact left-right asymmetry have distinct ATPase kinetics. J Biol Chem. 2023;299(8):104961.</li>
	<li>Lin T, Tang N, Ostap EM. Biochemical and motile properties of Myo1b splice isoforms. J Biol Chem. 2005;280(50):41562-7.</li>
	<li>Lebreton G, et al. Molecular to organismal chirality is induced by the conserved myosin 1D. Science. 2018;362(6417):949-52.</li>
	<li>Spudich JA, Watt S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. J Biol Chem. 1971;246(15):4866-71.</li>
	<li>Boczkowska M, et al. X-ray scattering study of activated Arp2/3 complex with bound actin-WCA. Structure. 2008;16(5):695-704.</li>
	<li>Rao JN, Madasu Y, Dominguez R. Mechanism of actin filament pointed-end capping by tropomodulin. Science. 2014;345(6195):463-7.</li>
	<li>Putkey JA, Slaughter GR, Means AR. Bacterial expression and characterization of proteins derived from the chicken calmodulin cDNA and a calmodulin processed gene. J Biol Chem. 1985;260(8):4704-12.</li>
	<li>Schindelin J, et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 2012;9(7):676-82.</li>
	<li>Greenberg MJ, Ostap EM. Regulation and control of myosin-I by the motor and light chain-binding domains. Trends Cell Biol. 2013;23(2):81-9.</li>
	<li>Lewis JH, et al. Calcium regulation of myosin-I tension sensing. Biophys J. 2012;102(12):2799-807.</li>
	<li>Manceva S, et al. Calcium regulation of calmodulin binding to and dissociation from the Myo1c regulatory domain. Biochemistry. 2007;46(42):11718-26.</li>
	<li>Mullins RD, Bieling P, Fletcher DA. From solution to surface to filament: actin flux into branched networks. Biophys Rev. 2018;10(6):1537-51.</li>
	<li>Mooren OL, et al. Reconstitution of Arp2/3-nucleated actin assembly with proteins CP, V-1, and CARMIL. Curr Biol. 2024;34(22):5173-86.e4.</li>
	<li>Pollard LW, et al. Genetically inspired in vitro reconstitution of Saccharomyces cerevisiae actin cables from seven purified proteins. Mol Biol Cell. 2020;31(5):335-47.</li>
	<li>Marcy Y, Prost J, Carlier MF, Sykes C. Forces generated during actin-based propulsion: a direct measurement by micromanipulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101(16):5992-7.</li>
	<li>Dayel MJ, et al. In silico reconstitution of actin-based symmetry breaking and motility. PLoS Biol. 2009;7(9):e1000201.</li>
	<li>Hammer JA 3rd, Sellers JR. Walking to work: roles for class V myosins as cargo transporters. Nat Rev Mol Cell Biol. 2011;13(1):13-26.</li>
	<li>Buss F, Kendrick-Jones J. How are the cellular functions of myosin VI regulated within the cell. Biochem Biophys Res Commun. 2008;369(1):165-75.</li>
	<li>Spudich JA, Sivaramakrishnan S. Myosin VI: an innovative motor that challenged the swinging lever arm hypothesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 2010;11(2):128-37.</li>
	<li>Self T, et al. Shaker-1 mutations reveal roles for myosin VIIA in both development and function of cochlear hair cells. Development. 1998;125(4):557-66.</li>
	<li>Crawley SW, et al. Intestinal brush border assembly driven by protocadherin-based intermicrovillar adhesion. Cell. 2014;157(2):433-46.</li>
	<li>Houdusse A, Titus MA. The many roles of myosins in filopodia, microvilli and stereocilia. Curr Biol. 2021;31(10):R586-R602.</li>
	<li>Bohil AB, Robertson BW, Cheney RE. Myosin-X is a molecular motor that functions in filopodia formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006;103(33):12411-6.</li>
	<li>Fitz GN, et al. Protrusion growth driven by myosin-generated force. Dev Cell. 2023;58(1):18-33.</li>
	<li>Quintero OA, et al. Human Myo19 is a novel myosin that associates with mitochondria. Curr Biol. 2009;19(23):2008-13.</li>
	<li>Zimmet A, et al. Cryo-EM structure of NPF-bound human Arp2/3 complex and activation mechanism. Sci Adv. 2020;6(23):eaaz7651.</li>
	<li>Giardini PA, Fletcher DA, Theriot JA. Compression forces generated by actin comet tails on lipid vesicles. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003;100(11):6493-8.</li>
	<li>Upadhyaya A, Chabot JR, Andreeva A, Samadani A, van Oudenaarden A. Probing polymerization forces by using actin-propelled lipid vesicles. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003;100(8):4521-6.</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen of belangenverstrengelingen hebben.

De actin-komeetstaart-bead-motiliteitsassay is een gevestigd in vitro reconstitutiesysteem voor het onderzoeken van de door het Arp2/3-complex gemedieerde vertakte actin-assemblage en de rol hiervan bij het genereren van protrusieve krachten14,15,16,17. Dit systeem is breed toegepast om de biochemische regulatie van vertakte actin-assemblage14,15,26,27,31,49,50,51 en krachtgeneratie20,21,22,23,52 te ontleden, terwijl het ook een kader biedt voor kwantitatieve studies naar de opkomende actieve-materie-eigenschappen van actin-netwerken19,35,36,53. Door myosin, in het bijzonder myosin-I18, in dit gereconstitueerde systeem te integreren, maakt de aangepaste assay het mogelijk om te onderzoeken hoe myosin-actin-koppeling de actin-assemblage en krachtproductie bij de membraaninterface moduleert, een gebied dat relatief onderbelicht blijft. Opmerkelijk is dat myosin-I in dit systeem gemakkelijk kan worden vervangen door andere myosin-motoren om hun respectievelijke rollen in de remodellering van actin-netwerken en krachtgeneratie te onderzoeken. Zo kunnen myosin V (vrachttransport)54, myosin VI (endocytische trafficking en membraandynamiek)55,56, myosin VII en XV (stereocilia- en microvillaire organisatie)57,58,59, myosin X (filopodia-vorming)60,61, en myosin XIX (mitochondriële dynamiek)62 worden ingezet om te onderzoeken hoe verschillende klassen myosin bijdragen aan de actin-organisatie en hun bijbehorende fysiologische processen.
De assay is zeer reproduceerbaar, mits enkele kritische parameters zorgvuldig worden gecontroleerd. Ten eerste is hoogwaardig monomeer G-actine essentieel voor een robuuste vorming van de comet-tail. Wij raden aan G-actine te zuiveren uit acetonpoeder van skeletspier van konijnen met behulp van gevestigde protocollen41. Na 2–3 dagen dialyse moet monomeer actine verder worden gezuiverd via gelfiltratie op Sephacryl S-300 in G-buffer (2 mM Tris-HCl, pH 8.0; 0.2 mM ATP; 0.1 mM CaCl2; 1 mM NaN3; en 0.5 mM DTT). Fracties die direct na de elutiepiek worden verzameld, moeten worden gebruikt. Gezuiverd G-actine behoudt doorgaans een sterke polymerisatieactiviteit gedurende 2–3 weken wanneer het op ijs bij 4°C wordt bewaard en kan tot in de vierde week bruikbaar blijven, hoewel de prestaties daarna over het algemeen afnemen. Een verminderde robuustheid van de comet-tail, gekenmerkt door schaarse, brosse actinenetwerken en inconsistente tail-groei, duidt vaak op een gecompromitteerde actinekwaliteit. Ten tweede bepaalt de NPF-activiteit kritisch de vorming van de comet-tail. Commercieel GST-getagd WCA-domein van het menselijke neuronale Wiskott–Aldrich syndrome protein (N-WASP) (GST-VCA) biedt een robuuste en aanhoudende nucleatieactiviteit, en GST-dimerisatie versterkt deze activiteit verder63. Wij raden aan om elk NPF-construct te valideren met een pyreen-actine polymerisatie-assay vóór het coaten van de beads. De activiteit van het commerciële GST-VCA kan dienen als referentiestandaard. Opmerkelijk is dat het hier gebruikte commerciële GST-VCA geen polyproline-regio bevat en daarom niet interageert met profiline-actine complexen26. Ten derde vereist betrouwbare visualisatie van de comet-tail groei een zorgvuldige voorbereiding van de objectglazen en dekglasjes. Wij raden aan objectglazen en dekglasjes grondig te reinigen met water en ethanol, gevolgd door plasmareiniging vlak voor gebruik. Indien beschikbaar hebben de voorkeur polyethyleenglycol-gesilaniseerde dekglasjes26, omdat ze aspecifieke eiwitadsorptie minimaliseren en de reproduceerbaarheid verbeteren. Het toevoegen van een adequate concentratie BSA aan het mobiliteitsmengsel kan aspecifieke oppervlakte-interacties verder verminderen en een consistente assay-prestatie bevorderen. Ten vierde is het volume van het monster dat in de kamer wordt aangebracht kritisch voor betrouwbare metingen15,16,17. Een te groot monstervolume resulteert in driftende beads, waardoor nauwkeurige tracking van de comet-tail elongatie wordt belemmerd. Omgekeerd drukt een onvoldoende monstervolume de beads samen tussen het objectglas en het dekglas, wat de wrijving verhoogt en de beads immobiliseert. Deze mechanische beperking kan de morfologie van de comet-tail vervormen en de gemeten groeikinetiek veranderen. Daarom is het optimaliseren van zowel de kamerhoogte als het monstervolume essentieel voor reproduceerbare resultaten. Wij raden aan om het monstervolume empirisch te optimaliseren voor elke experimentele opstelling. Bij gebruik van een dekglasje van 22 mm × 22 mm, zoals hier beschreven, produceert het aanbrengen van 2.1–2.3 µL van het mobiliteitsmengsel een kamerhoogte van ongeveer 4.3 µm, wat resulteert in een stabiele positionering van beads met een diameter van 2.0 µm zonder overmatige drift of compressie.&#160;Wanneer een dekglasje van een andere afmeting wordt gebruikt, moet het monstervolume dienovereenkomstig worden aangepast om een gelijkmatige kamerfilling, stabiele bead-positionering en minimale monsterdrift te bereiken.
Indien er geen cometstaarten worden gevormd, dient de capaciteit voor actinpolymerisatie en de NPF-activiteit te worden geverifieerd. Indien er geen symmetriebreking optreedt, moet de CP-concentratie worden aangepast om de netwerkdichtheid te moduleren. Overmatig dichte netwerken zijn resistent tegen fractuur, terwijl te ijle netwerken aan structurele integriteit ontbreken. Indien myosin-gecoate kraaltjes geen verschil vertonen ten opzichte van controlekraaltjes, dient de myosin-oppervlaktedichtheid en de motoractiviteit te worden bevestigd. Voor de kwaliteitscontrole is het acceptatiecriterium functioneel en niet gebaseerd op een absolute numerieke grenswaarde. Een nieuwe preparatie wordt als acceptabel beschouwd indien,&#160;het reproduceert de vorming en groei van de komeetstaart die zijn waargenomen met een eerder gevalideerde preparatie (zoals getoond in&#160;Figuur 3). Daarnaast moet elke nieuwe preparatie van myosine, Arp2/3-complex, NPF, CapZ of actine vóór gebruik worden geëvalueerd met de juiste kwaliteitscontrole-assays en vergeleken worden met een eerder gevalideerde preparatie om consistentie tussen kwantitatieve experimenten te waarborgen (zie Protocol sectie 3.1).
Bij het interpreteren van de resultaten moeten verschillende beperkingen van deze assay in overweging worden genomen. Ten eerste wordt fluorescentie-intensiteit gebruikt als een relatieve, ongekalibreerde proxy voor de dichtheid van het actinenetwerk; vergelijkingen mogen daarom alleen worden gemaakt tussen monsters die onder identieke acquisitie-instellingen zijn afgebeeld en zijn geanalyseerd met dezelfde thresholding-workflow. Ten tweede bieden kraalmotiliteit, de groei van de komeetstaart en de groeffeticiëntie indirecte read-outs van het krachtgenererende gedrag van het netwerk, maar vormen zij geen directe metingen van kracht. Directe mechanische metingen, zoals optical trapping of kracht-gekalibreerde assays voor membraandeformatie64,65, zijn vereist om de door het netwerk geproduceerde krachten te kwantificeren. Ten derde resolveert deze assay de ultrastructuur van het actinenetwerk niet direct, zoals filamentoriëntatie, vertakkingsdichtheid of lokale myosineorganisatie.&#160;Complementaire benaderingen, zoals elektronenmicroscopie of super-resolutie beeldvorming, kunnen vereist zijn voor karakterisering van de structuur op nanometerschaal&#160;. Ten slotte biedt het gebruik van rigide kraaltjes op micrometerschaal een vereenvoudigde en experimenteel hanteerbare interface, maar dit weerspiegelt niet de vervormbaarheid, krommingheterogeniteit, lipidmobiliteit of moleculaire complexiteit van cellulaire membranen. Toekomstige ontwikkeling van fysiologisch relevantere interfaces zal daarom belangrijk zijn om te onderzoeken hoe cytoskeletcomponenten coördineren aan de voorrand van de cel.
Over het algemeen biedt deze reconstitutiebenadering een precieze controle over de eiwitsamenstelling en -concentratie, waardoor individuele componenten mechanistisch kunnen worden geanalyseerd op manieren die in cellulaire systemen moeilijk te bereiken zijn. Het biedt een veelzijdig platform om te bestuderen hoe moleculaire motoren vertakte actinenetwerken remodelleren en de krachtgeneratie bij membraanachtige interfaces vormgeven. Met passende validatie kan de assay worden uitgebreid om te onderzoeken hoe verschillende myosineklassen, gemuteerde of ziekte-geassocieerde motorvarianten en krachtgevoelige actinebindende eiwitten de mechanische feedback binnen dynamische actinenetwerken reguleren. In bredere zin helpt dit systeem om motoractiviteit op moleculaire schaal te verbinden met cytoskeletale organisatie en mechanische functie op mesoschaal, met implicaties voor celmotiliteit, endocytose en membraanremodellering.

Vertakte actinepolymerisatie, gemedieerd door het actine-gerelateerd eiwit 2/3 (Arp2/3) complex, genereert de primaire protrusiekrachten die diverse cellulaire processen aandrijven, waaronder celmotiliteit, endocytose, fagocytose en de vorming van celadhesiecomplexen1,2,3,4,5,6. Aan de voorzijde van migrerende cellen activeren nucleatie-bevorderende factoren (NPFs) het Arp2/3 complex bij het plasmamembraan, wat de assemblage van een dendritisch actinenetwerk initieert dat het membraan naar voren duwt. Myosine-I motoren colokaliseren vaak met deze vertakte actinenetwerken bij membraaninterfaces en zijn betrokken bij het reguleren van&#160;de actineorganisatie&#160;en het moduleren van krachtgeneratie7,8,9,10,11,12,13. Ondanks toenemend bewijs dat myosine-I bijdraagt aan actine-afhankelijke mechanische processen, blijven de moleculaire mechanismen waarmee myosine-I interageert met Arp2/3-gemedieerde vertakte actine-assemblage om de netwerkarchitectuur en mechanische output te moduleren, onvoldoende begrepen.
Om dit gat te vullen, hebben we myosin-I geïntegreerd in het goed beschreven actin-comet-tail bead motility-systeem14,15,16,17 om de wisselwerking tussen myosin-I, actine en het Arp2/3-complex op het oppervlak van micron-grote beads te reconstitueren. Het hoofddoel van deze methode is om kwantitatief te onderzoeken hoe myosin-actine-koppeling de assemblage van vertakt actine, de netwerkarchitectuur, symmetriebreking en de bead motility bij een membraanachtige interface beïnvloedt. In deze assay worden myosin-I en NPF's samen gecoat op micro-beads om hun colocalisatie bij het plasmamembraan na te bootsen18. Bij de start van de polymerisatie stimuleren oppervlaktegebonden NPF's de Arp2/3-afhankelijke assemblage van vertakt actine, wat leidt tot de vorming van een actine-schil, symmetriebreking en de ontwikkeling van een gepolariseerde comet tail&#160;die de voortstuwing van de bead aandrijft14,19,20,21,22,23. Door de oppervlaktedichtheid van myosin systematisch te variëren18 en de dichtheid van het actinenetwerk te moduleren via de concentratie van capping protein (CP)15,19,24, maakt deze methode een kwantitatieve analyse mogelijk van de assemblagekinetiek van actine, de groeffeticiëntie, de netwerkarchitectuur en de bead motility, wat indirecte read-outs verschaft met betrekking tot myosin-I-afhankelijke veranderingen in de mechanische output.
De assay biedt ook duidelijke voordelen ten opzichte van complementaire benaderingen. In vergelijking met bulk-polymerisatieassays, zoals pyreen-actine-assays, maakt dit bead-motiliteitssysteem directe visualisatie mogelijk van de assemblage van vertakt actine en de door actine-polymerisatie gedreven beweging van de beads. In tegenstelling tot cellulaire studies, waarbij overlappende eiwitfuncties en complexe cellulaire omgevingen individuele bijdragen kunnen maskeren en de interpretatie kunnen bemoeilijken, biedt deze assay een precieze controle over de eiwitsamenstelling, concentratie en oppervlakteorganisatie, waardoor een systematisch onderzoek mogelijk is naar hoe myosine-I interacteert met Arp2/3-gemedieerde actine-assemblage onder gedefinieerde biochemische condities.
Deze methode is het meest geschikt voor het bestuderen van hoe cytoskeletcomponenten coördineren op een membraanachtige&#160;interface om de architectuur van het actinenetwerk en de mechanische output te reguleren. Hoewel het huidige protocol is geoptimaliseerd voor myosin-I-gemedieerde vertakte actine-assemblage, kan het modulaire ontwerp in de toekomst worden aangepast om andere membraangeassocieerde myosinestructuren (bijv. myosin VI, VII, X, XV en XIX) en/of actinebindende eiwitten (bijv. forminen, vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP), cortactine, coronine of tropomyosine) te onderzoeken. Dergelijke aanpassingen vereisen validatie van de eiwitimmobilisatie, activiteit en oppervlaktedichtheid. Daarnaast is de assay geschikt voor pulse-chase labelingsstrategieën. De integratie van fotoconverteerbaar of fotoactiveerbaar actine, of gelabelde Arp2/3-subunits, zou de meting van filament-omzetting en dissociatiesnelheden van vertakkingen binnen het groeiende netwerk mogelijk maken25. In het algemeen biedt deze assay een veelzijdig platform voor het onderzoeken van de moleculaire interactie tussen membraangeassocieerde motoren, actinefilamenten en actinebindende eiwitten, alsmede voor het sonderen van hoe motoren en actinebindende eiwitten netwerkremodellering en krachtopwekking bij membraanachtige interfaces reguleren14,15,26,27,28,29,30,31,32,33,34. In bredere zin dient het ook als een minimaal, instelbaar actieve-materie-platform voor het onderzoeken van de fysische principes die ten grondslag liggen aan motorgedreven nonequilibrumdynamica, zoals symmetriedoorbreking, zelforganisatie, mechanochemische feedback en andere emergente gedragingen in actieve actomyosinenetwerken18,19,20,21,22,23,35,36, met potentiële relevantie voor de fysica van actieve materie en materiaalkunde.

<table><tbody><tr><td>Adenosine 5'&amp;prime;-trifosfaat dinatriumzout hydraat</td><td>Sigma</td><td>A26209</td><td>Wordt gebruikt voor het bereiden van ATP-bevattende buffers; verdeel in aliquots en bewaar bij &amp;minus;20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Arp2/3-complex</td><td>In-house geprepareerd</td><td>Omdat er geen brontekst is verstrekt, kan ik geen vertaling genereren. Voer aub de tekst in die u vertaald wilt hebben.</td><td>Wordt gebruikt voor de nucleatie van vertakte actinenetwerken; gezuiverd volgens Ref. 42.</td></tr><tr><td>Biotine-CF640 fluorescerende kleurstof</td><td>Biotium</td><td>80032</td><td>Wordt gebruikt voor het fluorescent labelen van controle-beads; lichtbestemd bewaren bij &amp;minus;80&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Biotinylering van Myo1d</td><td>In-house bereid</td><td>Omdat er geen brontekst is verstrekt, kan ik geen vertaling maken. Voeg aub de Engelse tekst toe die u vertaald wilt hebben naar het Nederlands.</td><td>Motorproteïne gebruikt voor het decoreren van met myosine gecoate kraaltjes; bereid zoals beschreven in ref. 18 en 38&amp;ndash;40.</td></tr><tr><td>Runder serumalbumine</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>Gebruikt voor bead-blokkerings- en bead-opslagbuffers; bereid een gefilterde voorraadoplossing.</td></tr><tr><td>Calciumchloride</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>Buffercomponent gebruikt in X-buffer en experimenten tot verstoring van calcium.</td></tr><tr><td>Calmoduline</td><td>In-house bereid</td><td>Omdat er geen brontekst is verstrekt, kan ik geen vertaling genereren. Voer aub de tekst in die u vertaald wilt hebben.</td><td>Toegevoegd aan reacties met myosine en de bewaarbuffer voor beads; gezuiverd volgens ref. 44.</td></tr><tr><td>Carboxyleer polystyreenbolletjes (2.0 &amp;micro;m diameter)</td><td>Polysciences</td><td>18327-10</td><td>Gebruikt als vaste drager voor de coating met NPF, NeutrAvidin, fluorescerende kleurstof en myosine; bewaren bij 4&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>CCD-camera</td><td>Teledyne</td><td>01-RET-R6-R-M-14-C-OC</td><td>Wordt gebruikt voor fluorescentiebeeldacquisitie tijdens time-lapse microscopie.</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue-kleuring</td><td>Sigma</td><td>B7920</td><td>Wordt gebruikt voor het kleuren van SDS-PAGE-gels voorafgaand aan densitometrische analyse.</td></tr><tr><td>Dekglasjes, 22 mm &amp;times; 22 mm, #1,5</td><td>Wereldbol</td><td>1404-15</td><td>Wordt gebruikt samen met microscoopglaasjes voor het assembleren van compressiekamers.</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>GoldBio</td><td>DTT10</td><td>Reducer gebruikt in buffers en mobiliteitsmengsels; bewaren bij &amp;minus;20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Droge scrollvacuümpomp</td><td>Agilent Technologies</td><td>IDP3B01</td><td>Wordt gebruikt om het plasma-reinigingssysteem te bedienen.</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>GoldBio</td><td>E-217-100</td><td>Calciumchelaatvormer gebruikt in M-buffer, motiliteitsbuffer en actinestvoorbehandeling.</td></tr><tr><td>Externe lichtbron</td><td>Leica</td><td>EL6000</td><td>Metaalhalogenidelichtbron voor fluorescentiemicroscopie.</td></tr><tr><td>Fiji (ImageJ)</td><td>Open source</td><td>Omdat u geen brontekst heeft verstrekt, is er geen inhoud om te vertalen. Voer aub de Engelse tekst in die u naar het Nederlands vertaald wilt hebben.</td><td>Gebruikt voor analyse van de cometstaartlengte, fluorescentie-intensiteit en netwerkdichtheid (versie 2.16.0/1.54p).</td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscoop</td><td>Leica</td><td>DMIRB</td><td>Inverted epifluoresciemicroscoop gebruikt voor beeldvorming van actine-cometstaarten.</td></tr><tr><td>Glaciaal azijnzuur</td><td>Fisher Chemical</td><td>BP2401-212</td><td>Component van de ontkleuringsoplossing voor de SDS-PAGE-gel; corrosief, hanteer met de nodige voorzorgsmaatregelen.</td></tr><tr><td>GST-VCA</td><td>Cytoskelet</td><td>VCG03-A</td><td>Nucleatiebevorderende factor gebruikt voor Arp2/3-gemedieerde actineassemblage; in aliquoten verdelen en bewaren bij &amp;minus;80&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>GoldBio</td><td>H-400-1</td><td>Bufferreagens gebruikt in X-buffer, M-buffer en motiliteitsbuffer.</td></tr><tr><td>Menselijk CapZ</td><td>In-house bereid</td><td>Omdat u geen brontekst heeft verstrekt, is er geen inhoud om te vertalen. Voer aub de Engelse tekst in die u naar het Nederlands vertaald wilt hebben.</td><td>Capping-eiwit gebruikt voor de regulatie van de dichtheid van het actinenetwerk; gezuiverd volgens Ref. 43.</td></tr><tr><td>Magnesiumchloride</td><td>Spectrum Chemical</td><td>M1035</td><td>Buffercomponent gebruikt in reactiebuffers en actin-voorbehandeling.</td></tr><tr><td>MetaMorph-beeldverwerkingssoftware</td><td>Molecular Devices</td><td>Omdat er geen brontekst is verstrekt, kan ik geen vertaling produceren. Voer aub de tekst in die u vertaald wilt hebben.</td><td>Gebruikt voor microscoopbesturing en beeldacquisitie (versie 7.10.4.459).</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>MX0485-3</td><td>Component van de SDS-PAGE-gel-ontkleuringsoplossing; brandbaar, hanteer volgens de veiligheidsprocedures van de instelling.</td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td>Toegevoegd aan de motiliteitsbuffer om de viscositeit van de oplossing te verhogen (1500 cP).</td></tr><tr><td>Microscoopstuurplaatjes</td><td>Corning</td><td>2947-75X25</td><td>Wordt gebruikt voor het assembleren van squeeze-kamers voor microscopie.</td></tr><tr><td>NeutrAvidin-proteïne</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td>Wordt gebruikt voor immobilisatie van gebiotinyleerde eiwitten op kraaloppervlakken; verdeel in aliquoten en bewaar bij &amp;minus;80&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>PageRuler Plus voorgekleurde eiwitladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>26619</td><td>Molecuulgewichtmarker gebruikt voor SDS-PAGE-analyse; bewaren bij &amp;minus;20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Plasmareiniger</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td>Wordt gebruikt om microscoopglazen en dekglasjes plasma-te reinigen voorafgaand aan de assemblage van de kamer.</td></tr><tr><td>polyethersulfon spuitfilter, 0.22 &amp;micro;m</td><td>Sigma</td><td>SLGPR33RS</td><td>Gebruikt om de voorraadoplossing van runderserealbumine te filteren vóór het verdelen in aliquoten.</td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP366-1</td><td>Zout dat wordt gebruikt om de ionsterkte in assay-buffers te handhaven.</td></tr><tr><td>Skeletspieractine van konijn</td><td>In-house geprepareerd</td><td>Omdat er geen brontekst is verstrekt, kan er geen vertaling worden gegenereerd. Vul a.u.b. de Engelse tekst in die u wilt laten vertalen.</td><td>Gezuiverd volgens Ref. 41 en gebruikt als G-actine voor assays voor de assemblage van actine-komeetstaarten.</td></tr><tr><td>Gekoelde microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>EP-5415R</td><td>Wordt gebruikt voor het pelleten van beads tijdens de stappen voor bead-preparatie en -wassen.</td></tr><tr><td>Roterende buizenmenger (laboratoriumrotator)</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-04397-40</td><td>Wordt gebruikt tijdens incubaties voor het coaten van beads om de beadsuspensie in stand te houden.</td></tr><tr><td>Tris/Glycine/SDS-runbuffer (10&amp;times;)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td>Verdunnen tot 1&amp;times; vóór SDS-PAGE-elektroforese.</td></tr><tr><td>Vacuümvet</td><td>Hoogvacuümdepot</td><td>408524</td><td>Wordt gebruikt om squeeze-kamers af te sluiten vóór fluorescentie-imaging.</td></tr><tr><td>4%&amp;ndash;20% gradiënt SDS-polyacrylamidegel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>XP04205BOX</td><td>Gebruikt voor SDS-PAGE-analyse van kraal-geassocieerde eiwitten; bewaren bij 4&amp;deg;C.</td></tr></tbody></table>

reconstitutie van myosin-i-gemedieerde vertakte actine-assemblage in een bead-gebaseerde actine-komeetstaart-motiliteitsassay

Reconstituting Myosin-I-Mediated Branched Actin Assembly in a Bead-Based Actin Comet-Tail Motility Assay

Vertakte actinepolymerisatie, gemedieerd door het actine-gerelateerde eiwit 2/3 (Arp2/3) complex, levert de primaire drijfkrachten voor diverse cellulaire processen, waaronder celmigratie, endocytose en fagocytose. Myosine-I-motoren, die vaak colokaliseren met vertakte actinenetwerken aan de voorzijde van de cel, blijken eveneens deel te nemen aan deze processen en worden geacht de organisatie van het actinenetwerk en de mechanische output te reguleren. De moleculaire mechanismen waarmee myosine-I interageert met het Arp2/3-complex om de assemblage van vertakt actine en de krachtgeneratie te moduleren, zijn echter grotendeels onbekend. Hier beschrijven we een zeer instelbare in vitro actine-komeetstaart bead-motility assay die de interactie tussen myosine-I, actine en het Arp2/3-complex aan de celvoorzijde reconstitueert op het oppervlak van micron-grote beads. Deze methode is aangepast van gevestigde actine-komeetstaart assays door myosine-I samen met nucleatie-bevorderende factoren (NPFs) co-immobiliseren op bead-oppervlakken, waardoor een membraanachtige interface voor actine-assemblage ontstaat. De assay maakt visualisatie en kwantitatieve analyse mogelijk van de assemblage van het actinenetwerk, de netwerkdichtheid, de mobiliteit van de beads en de groeffeticiëntie. Het biedt daarnaast indirecte, kwalitatieve read-outs van myosine-I-gemedieerde krachtversterking in vertakte actinenetwerken. Dit protocol omvat bead-functionalisatie, reactie-assemblage, fluorescentie-imaging, kwantitatieve beeldanalyse en troubleshooting-strategieën, waardoor een reproduceerbaar platform wordt geboden voor het bestuderen van myosine-I-gereguleerde actine-assemblage bij membraanachtige interfaces.

De actin-komeetstaart-kraalmotiliteitsassay werd gebruikt om het effect van myosin-I-activiteit op de Arp2/3-complex-gemedieerde vertakte actin-assemblage aan de voorkant van de cel te onderzoeken, waarbij scenario's werden gereproduceerd waarin membraangebonden myosin-I coördineert met actin-polymerisatie om membraanuitstulping aan te sturen7,8,9,10,11,12,13. Om de colocalisatie van myosin-I en NPF's aan de membraan-actin-interface na te bootsen, werden beide eiwitten samen gecoat op het oppervlak van microschaal-kralen, waardoor hun ruimtelijke nabijheid in een gecontroleerd in vitro systeem werd gereconstitueerd (Figuur 1A,B).
<img alt="Figuur 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71259/71259fig1.jpg" /> 
Figuur 1. Reconstitutie van myosin-I-gemedieerde vertakte actine-assemblage op microschaalbeads. (A) Schema dat de interacties toont tussen myosin-I, nucleatie-bevorderende factoren (NPFs), het actin-related protein 2/3 (Arp2/3) complex, capping protein (CP) en globulair actine (G-actine) aan de voorzijde van de cel. (B) Schema van de functionalisering van de beads. Controlebeads en myosin-gecoate beads werden gecoat met NPF en neutravidine. Neutravidine werd geconjugeerd aan ofwel een gebiotinylerde far-red fluorescerende kleurstof voor de controlebeads, ofwel gebiotinylere Drosophila Myo1d voor de myosin-gecoate beads. (C) Representatieve tijdserie die de groei van actine-staartjes (comet-tails) toont, van symmetriebreking tot gepolariseerde staartvorming, voor een controlebead en een myosin-gecoate bead. Het laatste paneel toont beide beads in hetzelfde gezichtsveld. Schaalbalk, 5 µm. Panelen B en C zijn gereproduceerd/gewijzigd uit Xu et al., Science Advances, DOI: 10.1126/sciadv.ado5788 (2024), AAAS, met toestemming. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71259/71259fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Om de specifieke bijdrage van myosine-I aan de actin-assemblage beter te kunnen beoordelen, is er ook een overeenkomstige controlekraal geconstrueerd. De controlekralen waren identiek aan de met myosine gecoate kralen, behalve dat myosine-I werd vervangen door een gebiotineerde ver-rode fluorescente kleurstof geconjugeerd aan neutravidine (Figuur 1B). Door beide kraaltypen in dezelfde reactiekamer te mengen en in hetzelfde gezichtsveld te beelden, kon een directe vergelijking worden gemaakt van de vertakte actin-assemblage in aanwezigheid en afwezigheid van myosine-I onder identieke experimentele condities (Figuur 1C). Bovendien kon door het variëren van de myosine-naar-NPF-verhouding op het kraaloppervlak het effect van myosine-I bij verschillende oppervlaktedensiteiten systematisch worden onderzocht (Figuur 2A,B). Daarnaast kon de dichtheid van het actin-netwerk worden afgestemd door de concentratie van CP aan te passen, waarbij netwerken werden gegenereerd variërend van dichtgepakte, resistente structuren tegen symmetriebreking tot los georganiseerde, breukgevoelige architecturen15,19,24. Deze aanpak maakte het mogelijk om te onderzoeken hoe myosine-I de vertakte actin-assemblage beïnvloedt in netwerken met variërende dichtheid en structurele integriteit (Figuur 2A,B).
<img alt="Figuur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71259/71259fig2.jpg" /> 
Figuur 2. Actin-komeetstaartmorfologie&#160;bij verschillende myosine-oppervlaktedichtheden en capping-proteïneconcentraties. (A) Representatieve fluorescentiebeelden van kralen met een diameter van 2 µm, gecoat met verschillende myosine-oppervlaktedichtheden en geassembleerd in reacties met 30–200 nM capping-proteïne (CP), 4 µM actine met 5% rhodamine-gelabeld actine, en 200 nM Arp2/3&#160;complex. Voor elke conditie werden controlekralen en myosine-gecoate kralen in hetzelfde gezichtsveld afgebeeld. De oppervlaktedichtheden van myosine en nucleatie-bevorderende factoren (NPF) werden bepaald via natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese, zoals beschreven in stap 2.3. Beelden werden vastgelegd 20–35 min na start van de reactie. Helderheid en contrast werden lineair en identiek aangepast binnen elk controle-myosinekralenpaar, maar onafhankelijk geschaald tussen condities voor een betere visualisatie. Schaalbalk, 5 µm. (B) Kwalitatieve assay-kaart die de resultaten van komeetstaarten samenvat over de CP-concentraties en myosine-oppervlaktedichtheden. Elk datapunt vertegenwoordigt een passend controle-myosinekralenpaar onder de aangegeven conditie. Symbolen geven de waargenomen resultaten aan, waaronder myosine-gecoate kralen die symmetriebreking bevorderen, langere staarten, vergelijkbare staarten, kortere staarten, geen vorming van komeetstaarten, of aster-achtige structuren. Gegevens zijn verzameld uit meer dan 20 onafhankelijke experimenten, waarbij meer dan 10 kralenparen per conditie zijn geanalyseerd. Deze figuur is gereproduceerd/gewijzigd uit Xu et al., Science Advances, DOI: 10.1126/sciadv.ado5788 (2024), AAAS, met toestemming. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71259/71259fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Na het mengen van de assay-componenten stimuleerden oppervlaktegebonden NPF's de door het Arp2/3-complex gemedieerde vertakte actine-assemblage rond het oppervlak van de kraal. Bij een typische succesvolle reactie verscheen actine eerst als een schaarse schil rond de kraal. Naarmate de polymerisatie vorderde, breidde de schil zich uit en raakte het netwerk dichterly verstrengeld. Voortdurende actine-assemblage aan het kraaloppervlak dreef de uitwaartse netwerkgroei aan, wat kon leiden tot symmetriebreking en de vorming van een gepolariseerde kometenstaart. Zodra een kometenstaart was gevormd, ondersteunden voortdurende actine-nucleatie en polymerisatie aan het kraaloppervlak een aanhoudende beweging van de kraal (Figuur 1C). Deze opeenvolgende kenmerken van actineschilvorming, symmetriebreking, verlenging van de kometenstaart en kraalvoortstuwing dienden als visuele indicatoren dat de assay correct functioneerde.
Zoals gerapporteerd in onze oorspronkelijke studie18 en geïllustreerd in Figuur 2A,B, was de morfologie van de komeetstaart gevoelig voor zowel de CP-concentratie als de oppervlaktedichtheid van myosine. Onder standaard assaycondities (200 nM Arp2/3-complex, 50 nM CP, myosine:NPF-ratio = 0,43:1) produceerden met myosine gecoate beads doorgaans minder dichte of meer diffuse actine-komeetstaarten dan controlebeads (Figuur 2A). Bij lage CP-concentraties (&lt;30 nM) assembleerde actine tot dichte, breukbestendige schalen. Onder deze condities bleven controlebeads vaak ingekapseld en slaagden ze er niet in om symmetriebreking te ondergaan, terwijl met myosine gecoate beads waarschijnlijker waren om de symmetrie te breken en uit de omringende actineschaal te ontsnappen (Figuur 2A,B). Bij hoge CP-concentraties (&gt;200 nM) was de cohesie van het netwerk verminderd, en de aanwezigheid van myosine destabiliseerde het actinenetwerk verder, bevorderde het afwerpen van actine en voorkwam de vorming van stabiele komeetstaarten (Figuur 2A,B). Deze conditieafhankelijke resultaten bieden nuttige referentiepunten die onderzoekers kunnen gebruiken om geschikte assayregimes te identificeren en de prestaties van de assay te optimaliseren.
Het effect van myosine-I op de morfologie van de actinestuurtstaart kan worden beoordeeld door de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de staart te meten. De regio van de staart werd gedefinieerd met behulp van een intensiteitsdrempel, zoals beschreven in stap 4.2, waarna de gemiddelde fluorescentie-intensiteit binnen deze regio werd gemeten (Figuur 3A). Onder overeenkomstige beeldvormingscondities, waarbij controlekralen en met myosine gecoate kralen in hetzelfde gezichtsveld werden afgebeeld, diende deze waarde als een relatieve, niet-gekalibreerde proxy voor de dichtheid van het actinenetwerk, waarbij een lagere gemiddelde intensiteit duidt op een minder dicht netwerk. Onder standaard assaycondities genereerden met myosine gecoate kralen doorgaans staarten met een lagere gemiddelde fluorescentie-intensiteit dan controlekralen, wat consistent is met een verminderde schijnbare netwerkdichtheid (Figuur 3C).
<img alt="Figuur 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71259/71259fig3.jpg" /> 
Figuur 3Kwantificeringsworkflow voor de groeikinetiek en assemblage-efficiëntie van actine-komeetstaarten. (A) Representatieve tijdreeksen van de groei van de komeetstaart van een controlekraal en een met myosin gecoate kraal (verhouding 0,43:1) in aanwezigheid van 50 nM capping-eiwit (CP). Zwarte contouren geven de regio's van belang (ROI's) van de komeetstaart aan die met Fiji zijn geïdentificeerd voor fluorescentie-intensiteitsmetingen. Reactiecondities: 4 &#181;M actine met 5% rhodamine-gelabelde actine, 200 nM actine-gerelateerd proteïne 2/3 (Arp2/3)-complex en 50 nM CP. Schaalbalk, 5 &#181;m. (B) Komeetstaartlengte uitgezet als functie van de tijd voor het representatieve controle-myosinekraalpaar getoond in paneel (A). De inzettoont het tijdsinterval dat is gebruikt voor de lineaire fit; de groeisnelheden van de staart zijn bepaald op basis van de hellingen van de gefitte lijnen. (CGenormaliseerde totale fluorescentie-intensiteit van de komeetstaart, uitgezet als functie van de tijd voor het representatieve controle-myosine-kraalpaar dat in paneel (A) wordt getoond. Controlekralen en myosinekralen werden genormaliseerd naar de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de controlekralen tussen 1100 en 1300 s. De inzet toont het tijdsvenster dat is gebruikt voor de lineaire fit, en de fluorescentie-assemblagesnelheden werden berekend uit de hellingen van de gefitte lijnen.D) Samenvattende tabel met de staartgroeisnelheid, de assemblagesnelheid van fluorescentie en de groefficiëntie voor het representatieve controle–myosine-kraalpaar dat in paneel (A) wordt getoond. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71259/71259fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Het effect van myosine-I op de groeikinetiek van de komeetstaart kan worden gekwantificeerd door zowel de verlenging van de komeetstaart als de accumulatie van actinefluorescentie in de tijd te meten. In de meeste experimenten groeiden de komeetstaarten met een ongeveer constante snelheid gedurende de eerste ~10 min na het doorbreken van de symmetrie. Naarmate de polymerisatiecomponenten uitgeput raakten, vertraagde de verlenging geleidelijk en stopte deze doorgaans ongeveer 30 min na het begin van de reactie. Om de groeikinetiek te kwantificeren, werden de lengte van de komeetstaart en de totale fluorescentie-intensiteit uitgezet als functies van de tijd (Figuur 3B,C). De eerste 7–10 datapunten, die overeenkomen met de initiële lineaire fase, werden gefit met behulp van lineaire regressie (Figuur 3B,C, insets). De hellingen van deze fits vertegenwoordigden respectievelijk de initiële groeisnelheid van de staart en de assemblagesnelheid van de actinefluorescentie. De groefficiëntie werd gedefinieerd als de groeisnelheid van de komeetstaart gedeeld door de assemblagesnelheid van de actinefluorescentie, waarmee werd gekwantificeerd hoe effectief actinepolymerisatie werd omgezet in een productieve verplaatsing van de kraal (Figuur 3D). In het representatieve voorbeeld getoond in Figuur 3A–D, vertoonde de met myosine gecoate kraal een staartgroeisnelheid van 0,60 µm/min (0,010 µm/s), vergeleken met 0,57 µm/min (0,0095 µm/s) voor de controlekraal (Figuur 3B,D). De overeenkomstige groefficiënties waren respectievelijk 5,6 en 4,5 µm/intensiteitseenheid, wat een ongeveer 1,2-maal hogere waarde vertegenwoordigt voor de met myosine gecoate kraal (Figuur 3D). Onder standaardcondities vertoonden met myosine gecoate kralen doorgaans groeisnelheden die vergelijkbaar waren met die van controlekralen (myosine: 0,69 ± 0,10 µm/min; controle: 0,66 ± 0,20 µm/min), samen met een lagere assemblagesnelheid van actinefluorescentie (ongeveer 0,76-maal die van de controle) en een ongeveer 1,4-maal hogere groefficiëntie, zoals eerder gerapporteerd in onze oorspronkelijke studie18. Deze waarden worden gerapporteerd als gemiddelde ± SD van 11 kraalparen per conditie, verkregen over vijf onafhankelijke experimenten. Statistische analyse werd uitgevoerd met een tweezijdige gepaarde t-toets, zoals beschreven in de oorspronkelijke studie18.
Om de bijdrage van de myosin power stroke te beoordelen en de mogelijkheid uit te sluiten dat de waargenomen effecten ontstonden door sterische hindering als gevolg van de bezetting van het myosin-oppervlak, kan de bead motility assay worden uitgevoerd onder omstandigheden die de power-stroke activiteit van myosin-I verstoren. In dit protocol werd de motoractiviteit van myosin-I geremd door 1,1 mM Ca2+ aan het reactiemengsel toe te voegen. Verhoogde Ca2+ bevorderde de dissociatie van calmodulin van de myosin-I hefboomarm, waardoor de stijfheid van de hefboomarm afnam en het vermogen om kracht te genereren werd belemmerd46,47,48. Onder deze omstandigheden bleef myosin-I dynamisch geassocieerd met actine, maar ondersteunde het geen actine-gliding (Figuur 4A,B), wat een nuttige controle vormt voor het evalueren van effecten die afhankelijk zijn van de motoractiviteit18.
<img alt="Figuur 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71259/71259fig4.jpg" /> 
Figuur 4. Calcium-gebaseerde controle voor het beoordelen van de Myo1d-motoractiviteit in de bead-motiliteitsassay. (A) Tijd-gecomprimeerde beelden van actinefilamenten die bewegen op een Myo1d-gecoat oppervlak in afwezigheid van verhoogd calcium, of die niet-productieve wervelpatronen vormen in aanwezigheid van 100 µM vrij calcium. De regenboogkleurige balk geeft de tijdsprogressie weer over 61 frames, vastgelegd met intervallen van 5 s. Schaalbalk, 5 µm. (B) Kwantificering van de glijsnelheid van actine in afwezigheid en aanwezigheid van 100 µM vrij calcium (N = 2 onafhankelijke experimenten; n = 25 filamenten). Onder deze omstandigheden werd geen productief glijden van actine waargenomen in aanwezigheid van 100 µM vrij calcium. Foutenbalken representeren SD. (C) Representatieve controle- en myosin-gecoate bead-paren, geassembleerd in afwezigheid of aanwezigheid van 100 µM vrij calcium. Vijf representatieve bead-paren worden voor elke conditie getoond. Binnen elk paar werden de controle-bead en de myosin-gecoate bead in hetzelfde gezichtsveld afgebeeld. Beelden werden vastgelegd ongeveer 15–20 min na start van de reactie. Helderheid en contrast werden lineair en identiek aangepast binnen elk controle-myosin bead-paar, maar werden onafhankelijk geschaald tussen de condities. Reactieomstandigheden: 4 µM actine met 5% rhodamine-gelabeld actine, 200 nM actine-gerelateerd eiwit 2/3 (Arp2/3) complex, en 50 nM capping protein (CP). Schaalbalken, 5 µm. Panelen A en B zijn gereproduceerd/gemodificeerd uit Xu et al., Science Advances, DOI: 10.1126/sciadv.ado5788 (2024), AAAS, met toestemming. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71259/71259fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Wanneer de assay correct werd uitgevoerd, produceerden met myosine gecoate beads die onder verhoogde Ca2+-condities werden getest kortere actine-cometstaarten met netwerkdichtheden die vergelijkbaar waren met die van de controlebeads (Figuur 4C). Vijf representatieve paren van controle- en met myosine gecoate beads uit twee onafhankelijke experimenten worden getoond. Deze kwalitatieve uitkomst werd consistent waargenomen over herhaalde assay-preparaties en wordt ondersteund door de kwantitatieve analyse die in de oorspronkelijke studie is gerapporteerd18. Deze verwachte uitkomst geeft aan dat de netwerkverschillen die onder standaardcondities werden waargenomen, afhankelijk zijn van een actieve myosine-powerstroke en niet enkel van de bezetting van het myosine-oppervlak. Bijgevolg dient de verhoogde Ca2+-conditie als een cruciale controle om vast te stellen of veranderingen in de organisatie van het vertakte actinenetwerk voortvloeien uit de motoractiviteit van myosine.

Dit protocol beschrijft een instelbare motiliteitsassay met actiniekometstaart-kralen om kwantitatief te onderzoeken hoe myosinemotoractiviteit de assemblage van vertakte actine en de netwerkarchitectuur bij een membraanachtige interface beïnvloedt.

Reconstitutie van myosin-I-gemedieerde vertakte actine-assemblage in een bead-gebaseerde actine-komeetstaart-motiliteitsassay

Vertakte actinepolymerisatie, gemedieerd door het actine-gerelateerde proteïne 2/3 (Arp2/3)-complex, levert de primaire stuwkrachten voor een verscheidenheid aan cellulaire...

Our research focuses on studying how myosin-I shapes branched actin networks and drives force generation at membrane interfaces. Previous cellular studies make it hard to isolate myosin-I effects. This protocol reconstitutes everything in vitro under well-controlled conditions.To begin, gather the required reagents. After preparing the nucleation-promoting factor, or NPF, and neutravidin coating mixture, gently mix the coating mixture by pipetting up and down 5 to 10 times, avoiding bubble formation. Transfer 5 microliters of bead slurry to a microcentrifuge tube. Add 10 microliters of X buffer to the beads and pipette at least five times. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Carefully remove the supernatant by tilting the tube and aspirating from the side opposite the bead pellet. Resuspend the washed beads in 50 microliters of the previously prepared coating mixture. Mix the suspension by gentle pipetting and leave a small air bubble to facilitate mixing during incubation. Incubate the beads on a benchtop rotator at 20 revolutions per minute for two hours at 4 degrees Celsius. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius, and carefully remove the supernatant containing excess neutravidin and GST-VCA. Resuspend the coated beads in 200 to 400 microliters of 10 milligrams per milliliter BSA. Incubate the suspension on ice for 30 minutes to block unoccupied binding sites on the bead surface. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius, and carefully remove the supernatant. Resuspend the beads in 50 microliters of 1 milligram per milliliter BSA prepared in X buffer. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Remove the supernatant and repeat the wash twice. Store the coated beads in 1 milligram per milliliter BSA prepared in X buffer on ice and use them within one week.To exchange the storage X buffer with the M buffer before myosin coating, divide 50 microliters of neutravidin-NPF-coated beads equally into two microcentrifuge tubes. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius and carefully remove the supernatant. Wash the beads with 25 microliters of 1 milligram per milliliter BSA prepared in M buffer. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Carefully remove the supernatant and repeat the wash twice. Resuspend the control beads in 25 microliters of 1 micromolar Biotin-CF640 fluorescent dye diluted from the stock solution in M buffer. Resuspend the myosin beads in 25 microliters of 500 nanomolar to 1 micromolar biotinylated myosin supplemented with 1 to 5 micromolar calmodulin. After covering the tubes with aluminum foil, incubate the bead suspensions on ice for at least 30 minutes. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius, and carefully remove the supernatant containing excess biotinylated myosin or fluorescent dye. Wash the decorated beads with 25 microliters of 1 milligram per milliliter BSA prepared in M buffer. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Carefully remove the supernatant and repeat the wash twice. Supplement the myosin-decorated beads with 1 to 5 micromolar calmodulin. Protect all decorated beads from light by covering the tubes with aluminum foil, then store the far-red fluorescent dye-decorated beads or myosin-decorated beads on ice.After bead preparation and decoration, prepare a 50-microliter motility mixture. Initiate the reaction by adding 4 microliters of 50 micromolar G-actin with 5% to 10% of the actin fluorescently labeled. Mix the reaction immediately and designate this time point as time equals 0. Clean the glass slide and coverslip with 70% ethanol, followed by deionized water. Plasma-clean the glass surfaces using ambient air plasma for 10 minutes. Apply 2.3 microliters of the reaction mixture to the glass slide. Place a 22-millimeter by 22-millimeter coverslip over the sample to form a squeeze chamber, with an approximate chamber height of 4.3 micrometers. Seal the chamber with vacuum grease. Using an epifluorescence microscope, acquire fluorescence images.Surface-bound NPFs stimulated branched actin assembly around the bead surface and actin first appeared as a sparse shell surrounding the bead. Continued actin assembly at the bead surface drove outward network growth, which led to symmetry breaking and the formation of a polarized comet tail. Once a comet tail was established, ongoing actin nucleation at the bead surface supported sustained bead movement. Under standard assay conditions, myosin-coated beads typically produce dimmer, sparser, or more diffuse actin comet tails than control beads.This protocol allows researchers to study how membrane-bound myosin motors regulate actin network density, growth kinetics, and polymerization-driven bead movement. The most important consideration is protein quality. Always validate new preparations against a previously validated batch before quantitative experiments. Future studies building on this work can test other membrane-associated myosins, disease-associated motor variants, or actin regulators at the membrane-like interface.

reconstituting-myosin-i-mediated-branched-actin-assembly-bead-based

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

In this video, we perform an in vitro motility assay to analyze the actin-myosin interactions. The gliding movement of actin filaments on immobilized myosin molecules is visualized using fluorescence microscopy.

Inverted Motility Assay: An In Vitro Technique to Visualize Myosin Movement on Immobilized Actin Filaments

Hier wordt een procedure gepresenteerd om myosine 5a uit te drukken en te zuiveren, gevolgd door een bespreking van de karakterisering ervan, met behulp van zowel ensemble- als single molecule in vitro fluorescentiemicroscopie-gebaseerde assays, en hoe deze methoden kunnen worden aangepast voor de karakterisering van niet-amuskel myosine 2b.

Myosine-specifieke aanpassingen van in vitro fluorescentiemicroscopie-gebaseerde motiliteitstesten

Hier wordt een uitgebreid protocol gepresenteerd om ultrasnelle krachtklemexperimenten uit te voeren op processieve myosine-5-motoren, die gemakkelijk kunnen worden uitgebreid naar de studie van andere klassen processieve motoren. Het protocol beschrijft alle noodzakelijke stappen, van de opstelling van het experimentele apparaat tot monstervoorbereiding, gegevensverzameling en analyse.

Het ontleden van mechano-enzymatische eigenschappen van processieve myosinen met ultrasnelle krachtklemspectroscopie

Vorming van actomyosinebundels in vitro en het meten van myosine ensemblekrachtgeneratie met behulp van een optisch pincet wordt gepresenteerd en besproken.

Myosine Ensemble Mechanics onderzoeken in Actin Filament Bundles met behulp van optische pincetten

Dit protocol beschrijft de vorming van ondersteunde lipide bilayers en de toevoeging van cytoskeletale filamenten en motoreiwitten om de dynamiek van gereconstitueerde, membraangebonden cytoskeletale netwerken te bestuderen met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Reconstitutie van membraangebonden minimale actinecorticosterces op ondersteunde lipidebilagen

Dit artikel presenteert protocollen voor het engineeren en karakteriseren van afstembare driedimensionale composietnetwerken van co-verstrengelde actinefilamenten en microtubuli. Composieten ondergaan actieve herstructurering en ballistische beweging, aangedreven door myosine II- en kinesinemotoren, en worden afgestemd op de relatieve concentraties actine, microtubuli, motoreiwitten en passieve crosslinkers.

Reconstitueren en karakteriseren van Actin-Microtubule Composieten met instelbare motoraangedreven dynamica en mechanica

Dit protocol beschrijft hoe actinekometen op de oppervlakken van kralen kunnen worden geproduceerd met behulp van in de handel verkrijgbare eiwitingrediënten. Dergelijke systemen bootsen de uitstekende structuren in cellen na en kunnen worden gebruikt om fysiologische mechanismen van krachtproductie op een vereenvoudigde manier te onderzoeken.

Reconstitutie van op actine gebaseerde motiliteit met commercieel verkrijgbare eiwitten

In dit werk wordt een in vitro reconstitutiebenadering gebruikt om de poro-elasticiteit van actomyosinegels onder gecontroleerde omstandigheden te bestuderen. De dynamiek van de actomyosinegel en het ingebedde oplosmiddel worden gekwantificeerd, waardoor de netwerkporo-elasticiteit wordt aangetoond. We bespreken ook de experimentele uitdagingen, veelvoorkomende valkuilen en relevantie voor celcytoskeletmechanica.

De mechanica van (poro-)elastische contractiele actomyosinenetwerken als modelsysteem van het celcytoskelet

Hier presenteren we methoden voor het bereiden van quasi-tweedimensionale (2D) verstrengelde, verknoopte en vloeibare kristalactine-assemblages van gezuiverde eiwitten.

Het afstemmen van de contractiliteit en vervormingsmodi van actieve op actine gebaseerde assemblages in vitro: van tweedimensionale actieve netwerken tot druppels van vloeibare kristallen

Zelf-geassembleerde monolagen (SAM) gevormd uit lange keten alkaan thiolen op goud bieden goed gedefinieerde substraten voor de vorming van eiwit patronen en cel opsluiting. Microcontact printen van hexadecanethiol met behulp van een polydimethylsiloxaan (PDMS), stempel, gevolgd door opvulling met een glycol-beëindigde alkaan thiol monomeer produceert een patroon waarbij eiwitten en cellen adsorberen alleen aan de gestempelde hexadecanethiol regio.

Het creëren van twee-dimensionale Patterned Substraten voor eiwit en Cell opsluiting

Verken een in vitro actine-komeetstaart-assay om myosin-I-gemedieerde vertakte actine-assemblage te bestuderen. Deze methode maakt kwantitatieve analyse van netwerkvorming en krachtgeneratie mogelijk.

Reconstitutie van myosin-I-gemedieerde vertakte actine-assemblage in een bead-gebaseerde actine-komeetstaart-motiliteitsassay

Meer video's verkennen