Kwantitatieve levende celbeeldvorming van kernvorm en chromatinedynamiek tijdens ontwikkeling en omgevingsstress bij Arabidopsis thaliana-wortel
5 juni 2026
Dit proces maakt gebruik van confocale microscopie in combinatie met een fluorescerend gelabelde kern- en chromatinemarkerlijn in Arabidopsis thaliana om gelijktijdig de kern- en chromatinedynamiek in Arabidopsis-wortels vast te leggen en veranderingen in deze dynamiek te onderzoeken als reactie op ontwikkelings- en omgevingssignalen.
Ons onderzoek onderzoekt genen en mechanismen die langdurige wortelherstel van osmotische stress mogelijk maken om gewassen te versterken tegen droogte. Hoewel ontwikkeld voor arabidopsiswortels, kan dit protocol worden aangepast aan systemen met fluorescerende eiwitmarkerlijnen. Verkrijg de groeiplaten met Arabidopsis thaliana-zaailingen die worden voorbereid voor beeldvorming.
Pipetteer 60 microliter puur water op een glazen glaasje. Leg drie zes dagen oude A. thaliana zaailingwortels in het water. Plaats een afdekplaat van 22x22 millimeter met nummer 1,5 over de wortels zonder de bladeren te bedekken.
In confocale microscoopinstellingen stel je de laserbelichtingstijd in op 1.000 milliseconden. Stel in de lasercombiner-instellingen de 488 nanometer laser in op 50% voor groene fluorescerende eiwit- of GFP-beeldvorming. Stel de 561 nanometer laser in op 50% voor roodfluorescerende eiwit- of RFP-beeldvorming.
Maak beeld van het monster met een 20X objectief zonder optische zoom. Stel de Z-slice stapgrootte in op 0,3 micrometer. Stel het beeldinterval in op één minuut en de totale opnameduur op 10 minuten.
Zoek de wortels en selecteer tot 20 Z-sneden. Maak 16-bits beelden. Begin met het verkrijgen van timelapse en sla de timelapse op als een TIFF-bestand met lossless compressie.
Verplaats de verzamelde gegevens naar een computer voor analyse. Open de ImageJ- of Fiji-software. Klik en sleep het VSI-bestand naar het hoofdvenster van ImageJ of Fiji.
Klik in de prompt Bio Formats Import Options op OK rechtsonder. Controleer vervolgens in de prompt Bio Format Series Options of Series 1 is geselecteerd. Klik op OK linksonder.
Zodra de afbeelding geladen is, splits je de signalen door Afbeelding te selecteren. Selecteer kleur en kies Split Channels. Bekijk de afzonderlijke vensters die zijn gegenereerd voor GFP-gelabelde kernen en RFP-gelabelde chromatine.
Bepaal welk van de twee beeldvensters overeenkomt met chromatine. Na het klikken op het chromatine-afbeeldingsvenster pas je de Z-projectbewerking toe door Afbeelding te selecteren, Stacks te kiezen en vervolgens vanuit het hoofdvenster ImageJ op Z Project te klikken. Verander het projectietype naar maximale intensiteit.
Zorg ervoor dat Alle tijdsframes actief is en klik op OK om de projectie te genereren. Open het contrastmenu door op Control Shift C te drukken, of door Afbeelding te selecteren en Aanpassen te kiezen, en vervolgens op Helderheid of Contrast te klikken vanuit het hoofdvenster ImageJ. Schuif de minimale balk naar links totdat de chromatine duidelijk zichtbaar is.
Navigeer naar de plugins. Klik op de pijltje naar beneden in het Plugins-menu om naar de optie Tracking te scrollen. Selecteer Tracking en klik op TrackMate.
Controleer of de kalibratie-instellingen kloppen en klik op Volgende. Selecteer Drempeldetector en klik op Volgende. Ga naar het laatste frame van de timelapse in het afbeeldingsvenster.
Klik op Auto naast de Intensiteitsdrempel en klik op Voorbeeld. Pas de Intensiteitsdrempel aan en klik op Voorbeeldweergave. Herhaal het aanpassings- en previewproces totdat alle chromatine met minimale ruis is toegevoegd, en klik op Volgende.
Laat de initiële drempeldetectie voltooien en klik op Volgende. Stel de drempel handmatig aan totdat alleen chromatine zichtbaar is, en klik op Volgende. Pas het fluorescentiebeelddisplay aan en klik op Volgende.
Selecteer Simple LAP Tracker en klik op Volgende. Stel de linking max distance in op 5 micron, Gap Closing Max Distance op 15 micron, Gap Closing Maximum Frame Gap op 1, en klik op volgende. Laat tracking voltooid worden.
Bekijk de sporen die in het originele afbeeldingsvenster worden weergegeven en klik op Volgende. Druk op de groene plusknop linksonder om een filter te maken. Selecteer het aantal plekken in trackmodus.
Stel de drempelschuif bij. Zorg ervoor dat de filtermodus op Boven staat en klik vervolgens op Volgende. Klik op de knop Tracks onderaan de pagina Weergaveopties.
Selecteer Exporteren naar CSV. Negeer de ingebouwde plotpagina en klik op Volgende. Bekijk de resultaten van de TrackMate-analyse.
Klik op Capture Overlay en kies vervolgens Uitvoeren. Sla de video op door Bestand te selecteren en op Opgeslagen te klikken, en vervolgens GIF te kiezen. Zoutbehandelde wortelcellen leken gestrest te zijn, en centromere foci leken groter dan in controleomstandigheden.
De chromatinesnelheid was significant hoger onder controleomstandigheden dan bij 100-millimolair natriumchloride-behandelde omstandigheden. Dit protocol maakt het mogelijk om fluorescentief-gelabelde eiwitbewegingen in arabidopsiswortels te volgen en te kwantificeren. De belangrijkste uitdaging bij dit protocol is het verkrijgen van beelden van hoge kwaliteit, omdat fotobleeken en monsterdrift tracking bemoeilijken.
Toekomstige studies moeten de mechanismen onderzoeken die ten grondslag liggen aan de verminderde chromatinebeweging die in ons onderzoek is waargenomen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overview
The nucleus in eukaryotic cells exhibits dynamic shape changes, which are altered under stress conditions such as cancer in animals or abiotic stress in plants. This study developed a live-cell imaging pipeline in Arabidopsis thaliana roots using dual fluorescent markers for the nuclear envelope and chromatin to quantify nuclear and chromatin dynamics under control and salt-stressed conditions. Confocal microscopy combined with Fiji/ImageJ and TrackMate enabled quantitative analysis, revealing reduced chromatin movement under salt stress. The method provides a robust approach to study how abiotic stressors affect nuclear architecture and chromatin dynamics in plant cells.
Key Study Components
Area of Science
- Plant cell biology
- Nuclear dynamics
- Chromatin mobility
- Abiotic stress response
Background
- Nuclear shape is dynamic in live cells, not static as traditionally depicted.
- Altered nuclear morphology is associated with cancer in animal cells and environmental stress in plants.
- The nuclear envelope interacts with chromatin to influence gene expression.
- Limited knowledge exists on how abiotic stress affects nuclear shape, movement, and chromatin dynamics in plants.
Purpose of Study
- To develop a pipeline for quantifying nuclear and chromatin dynamics in live plant cells.
- To apply this method to assess changes under abiotic stress, specifically salt stress.
- To validate the approach by measuring chromatin movement in control and stressed conditions.
- To enable future analysis of nuclear and chromatin responses to environmental stressors in Arabidopsis roots.
Methods Used
- Live-cell imaging of Arabidopsis thaliana roots using confocal microscopy.
- Use of a dual fluorescently tagged marker line (nuclear envelope protein and chromatin).
- Image acquisition under control and salt-stressed conditions.
- Analysis of nuclear and chromatin dynamics using Fiji/ImageJ with the TrackMate plugin.
- Particle tracking to quantify chromatin speed and movement.
Main Results
- Chromatin movement was significantly reduced in salt-stressed roots compared to control.
- The dual-tagging system allowed simultaneous visualization of nuclear envelope and chromatin.
- TrackMate enabled accurate particle tracking and quantification of dynamics.
- The method successfully captured live, quantitative changes in nuclear and chromatin behavior.
Conclusions
- The developed pipeline allows for quantitative live-cell imaging of nuclear shape and chromatin dynamics in plant roots.
- Salt stress leads to decreased chromatin mobility, indicating altered nuclear dynamics under abiotic stress.
- This approach can be applied to study nuclear responses to various environmental stressors.
- The method provides a foundation for linking nuclear architecture to gene regulation and stress adaptation in plants.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Quantitative live-cell imaging of nuclear shape and chromatin dynamics in Arabidopsis roots provides a robust platform for dissecting cellular responses to environmental stress at high resolution. This approach enables predictive confidence in linking nuclear architecture changes to gene regulation, supporting early discovery and mechanistic de-risking in plant biotechnology pipelines. The method's quantitative outputs facilitate risk-adjusted decisions for trait development and stress adaptation research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of nuclear and chromatin behavior under defined stress conditions.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying dynamic nuclear responses to abiotic stimuli.
- Facilitates functional validation of nuclear envelope and chromatin-associated targets.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, quantitative imaging assays for nuclear and chromatin dynamics.
- Enables reproducible measurement of stress-induced changes in live plant cells.
- Supports scalable screening of genetic or chemical modulators affecting nuclear architecture.
Translational & Preclinical Research
- Aligns nuclear and chromatin dynamics with stress adaptation phenotypes in model systems.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation of stress resilience traits.
- Supports predictive de-risking for translational research in crop improvement.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging and analysis pipeline integrates from early discovery through screening and translational research in plant biotechnology.
- Discovery Biology: Quantifies nuclear and chromatin dynamics to clarify stress response pathways.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides particle tracking and statistical outputs for robust condition comparison.
- Translational Research: Links nuclear architecture changes to stress adaptation, supporting trait validation.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging and analysis workflow adaptable to diverse plant models and stressors.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in nuclear and chromatin target validation.
- Operational Value: Standardizes live-cell imaging and quantitative analysis for reproducibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for stress adaptation trait development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genetic or chemical interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and live-cell imaging.
- Needs access to dual fluorescent marker lines and image analysis software (Fiji/ImageJ, TrackMate).
- Demands cross-team standardization for imaging protocols and data analysis.
- Adaptable to other plant species with suitable marker development.
- Limited by availability of compatible fluorescent markers for target systems.
