ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Chen, S., Zhu, H., Jounaidi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+snapshots+of+natural+killer+cells+functions%2C+signaling%2C+molecular+mechanisms+and+clinical+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Comprehensive snapshots of natural killer cells functions, signaling, molecular mechanisms and clinical utilization.</a> Signal Transduct Target Ther. , (2024).</li>
<li>Liesche, C., Sauer, P., Prager, I., Urlaub, D., Claus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-fluorescent+protein+reporters+allow+parallel+quantification+of+natural+killer+cell-mediated+granzyme+and+caspase+activities+in+single+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-fluorescent protein reporters allow parallel quantification of natural killer cell-mediated granzyme and caspase activities in single target cells.</a> Front Immunol. , (2018).</li>
<li>Hartmann, J. A., Cardoso, M. R., Talarico, M. C. R., Kenney, D. J., Leone, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evasion+of+NKG2D-mediated+cytotoxic+immunity+by+sarbecoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Evasion of NKG2D-mediated cytotoxic immunity by sarbecoviruses.</a> Cell. , (2024).</li>
<li>Garcia-Beltran, W. F., Hölzemer, A., Martrus, G., Chung, A. W., Pacheco, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+conformers+of+HLA-F+are+high-affinity+ligands+of+the+activating+NK-cell+receptor+KIR3DS1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Open conformers of HLA-F are high-affinity ligands of the activating NK-cell receptor KIR3DS1.</a> Nat Immunol. , (2016).</li>
<li>Rezvani, K., Rouce, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+natural+killer+cell+immunotherapy+for+the+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The application of natural killer cell immunotherapy for the treatment of cancer.</a> Front Immunol. , (2015).</li>
<li>Coënon, L., Villalba, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+CD16a+biology+to+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">From CD16a biology to antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity improvement.</a> Front Immunol. , (2022).</li>
<li>Ruggeri, L., Mancusi, A., Capanni, M., Martelli, M. F., Velardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploitation+of+alloreactive+NK+cells+in+adoptive+immunotherapy+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exploitation of alloreactive NK cells in adoptive immunotherapy of cancer.</a> Curr Opin Immunol. , (2005).</li>
<li>Liu, E., Marin, D., Banerjee, P., Macapinlac, H. A., Thompson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+CAR-transduced+natural+killer+cells+in+CD19-positive+lymphoid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Use of CAR-transduced natural killer cells in CD19-positive lymphoid tumors.</a> N Engl J Med. , (2020).</li>
<li>Li, Y., Hermanson, D. L., Moriarity, B. S., Kaufman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPSC-derived+natural+killer+cells+engineered+with+chimeric+antigen+receptors+enhance+anti-tumor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human iPSC-derived natural killer cells engineered with chimeric antigen receptors enhance anti-tumor activity.</a> Cell Stem Cell. , (2018).</li>
<li>Marin, D., Li, Y., Basar, R., Rafei, H., Daher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety%2C+efficacy+and+determinants+of+response+of+allogeneic+CD19-specific+CAR-NK+cells+in+CD19%2B+B+cell+tumors%3A+a+phase+1%2F2+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Safety, efficacy and determinants of response of allogeneic CD19-specific CAR-NK cells in CD19+ B cell tumors: a phase 1/2 trial.</a> Nat Med. , (2024).</li>
<li>Chava, S., Bugide, S., Gupta, R., Wajapeyee, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+natural+killer+cell-mediated+cytotoxicity+and+migration+in+the+context+of+hepatic+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Measurement of natural killer cell-mediated cytotoxicity and migration in the context of hepatic tumor cells.</a> J Vis Exp. (156), e60714(2020).</li>
<li>Liu, E., Tong, Y., Dotti, G., Shaim, H., Savoldo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cord+blood+NK+cells+engineered+to+express+IL-15+and+a+CD19-targeted+CAR+show+long-term+persistence+and+potent+antitumor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Cord blood NK cells engineered to express IL-15 and a CD19-targeted CAR show long-term persistence and potent antitumor activity.</a> Leukemia. , (2018).</li>
<li>Mensali, N., Dillard, P., Hebeisen, M., Lorenz, S., Theodossiou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cells+specifically+TCR-dressed+to+kill+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">NK cells specifically TCR-dressed to kill cancer cells.</a> EBioMedicine. , (2019).</li>
<li>Nowak, J., Bentele, M., Kutle, I., Zimmermann, K., Lühmann, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-NK+cells+targeting+HER1+%28EGFR%29+show+efficient+anti-tumor+activity+against+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+%28HNSCC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">CAR-NK cells targeting HER1 (EGFR) show efficient anti-tumor activity against head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC).</a> Cancers (Basel). , (2023).</li>
<li>Granger, J. E., Appledorn, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+measurement+of+apoptosis+and+immune+cell+killing+using+live-cell+imaging+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetic measurement of apoptosis and immune cell killing using live-cell imaging and analysis.</a> Methods Mol Biol. , (2021).</li>
<li>Duffy, J., Rider, A., Loneman, D., Thakkar, D., Mullen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALK%2B+LBCL+and+PBL+share+a+similar+plasmablastic+transcriptional+identity+but+show+divergent+signaling+dependencies+and+therapeutic+vulnerabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">ALK+ LBCL and PBL share a similar plasmablastic transcriptional identity but show divergent signaling dependencies and therapeutic vulnerabilities.</a> Blood. , (2025).</li>
<li>Kandarian, F., Sunga, G. M., Arango-Saenz, D., Rossetti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow+cytometry-based+cytotoxicity+assay+for+the+assessment+of+human+NK+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A flow cytometry-based cytotoxicity assay for the assessment of human NK cell activity.</a> J Vis Exp. (126), e56191(2017).</li>
<li>Klingemann, H., Boissel, L., Toneguzzo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cells+for+immunotherapy+-+advantages+of+the+NK-92+cell+line+over+blood+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Natural killer cells for immunotherapy - advantages of the NK-92 cell line over blood NK cells.</a> Front Immunol. , (2016).</li>
<li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> J Immunol Methods. , (2004).</li>
<li>Valiante, N. M., Uhrberg, M., Shilling, H. G., Lienert-Weidenbach, K., Arnett, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+and+structurally+distinct+NK+cell+receptor+repertoires+in+the+peripheral+blood+of+two+human+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Functionally and structurally distinct NK cell receptor repertoires in the peripheral blood of two human donors.</a> Immunity. , (1997).</li>
<li>Wang, Y., Zhang, Y., Hughes, T., Zhang, J., Caligiuri, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fratricide+of+NK+cells+in+daratumumab+therapy+for+multiple+myeloma+overcome+by+ex+vivo-expanded+autologous+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Fratricide of NK cells in daratumumab therapy for multiple myeloma overcome by ex vivo-expanded autologous NK cells.</a> Clin Cancer Res. , (2018).</li>
<li>Cichocki, F., Bjordahl, R., Gaidarova, S., Mahmood, S., Abujarour, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPSC-derived+NK+cells+maintain+high+cytotoxicity+and+enhance+in+vivo+tumor+control+in+concert+with+T+cells+and+anti-PD-1+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">iPSC-derived NK cells maintain high cytotoxicity and enhance in vivo tumor control in concert with T cells and anti-PD-1 therapy.</a> Sci Transl Med. , (2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Advanced RPMI-1640 medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12633020</td><td>Basal medium voor NK-92 en primaire humane NK-celcultuurmedia (zie protocol voor volledige formulering)</td></tr><tr><td>Anti-human CD107a-antilichaam, PE-Cy7-geconjugeerd (clone H4A3)</td><td>BioLegend</td><td>328618</td><td>Degranulatiemarker voor flowcytometrie</td></tr><tr><td>Anti-human CD16-antilichaam, BV785-geconjugeerd (clone 3G8)</td><td>BioLegend</td><td>302046</td><td>Flowcytometrie</td></tr><tr><td>Anti-human CD56-antilichaam, BV421-geconjugeerd (clone HCD56)</td><td>BioLegend</td><td>318328</td><td>Flowcytometrie</td></tr><tr><td>Benchtop centrifuge met slingerbekerrotor compatibel met 15-mL buizen en 96-well platen (Eppendorf Centrifuge 5810R)</td><td>Eppendorf</td><td>5811000015</td><td>Gebruikt voor celpelleting en platencentrifugatie (100&ndash;300 &times; g)</td></tr><tr><td>Carboxyfluoresceine succinimidyl ester (CFSE)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34554</td><td>Celproliferatiekleurstof voor doelcellabeling</td></tr><tr><td>Cytek Aurora spectral flow cytometer (of equivalent)</td><td>Cytek Biosciences</td><td>N7-00003</td><td>Gebruikt voor flowcytometrieacquisitie en -analyse</td></tr><tr><td>DAPI (4&prime;,6-diamidino-2-fenylindole)</td><td>BioLegend</td><td>422801</td><td>Kernkleuring voor live/dead discriminatie</td></tr><tr><td>Diep-well 96-well plaat</td><td>USA Scientific</td><td>1896-2110</td><td>Gebruikt voor antilichaamvoorbereiding</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfaat (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td>Cryopreserveringsreagens</td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum (FBS)</td><td>Avantor</td><td>76419-584</td><td>Supplementatie van basaal medium; gebruikt in FACS-buffer (2% FBS)</td></tr><tr><td>Algemeen doelwaterbad, 10 L (37 &deg;C)</td><td>PolyScience</td><td>WBE10</td><td>Voor celontdooien</td></tr><tr><td>GlutaMAX (L-alanyl-L-glutamine supplement)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Stabile glutaminebron</td></tr><tr><td>Humain AB serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4522-100ML</td><td>Supplement voor primaire humane NK-celcultuurmedia</td></tr><tr><td>IncuCyte SX5 live-cell beeldvormingssysteem</td><td>Sartorius</td><td>4816</td><td>Real-time live-cell beeldvorming en Cel-per-Cel analyse</td></tr><tr><td>LUNA-FL dual fluoresceine celteller (of equivalent)</td><td>Logos Biosystems</td><td>L20001</td><td>Geautomatiseerd celtelling</td></tr><tr><td>Parafilm M (4 in &times; 250 ft rol)</td><td>Genesee</td><td>16-101</td><td>Plaatsealing en opslag</td></tr><tr><td>Fosfaat-gebufferde saline (PBS), steriele (pH 7,2&ndash;7,4)</td><td>Corning</td><td>21-020-CV</td><td>Gebruikt voor wassen en FACS-bufferbereiding</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine (0,1 mg/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A3890401</td><td>Plaatcoatingsreagens</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-2</td><td>Antibioticum</td></tr><tr><td>Recombinant humaan interleukine-2 (IL-2)</td><td>R&amp;D Systems</td><td>202-IL-500</td><td>Cytokine</td></tr><tr><td>RosetteSep Human NK-celverrijkingskit</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>15065</td><td>Humaan NK-celverrijkingscocktail</td></tr><tr><td>SYTOX Orange dode celkleuring</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S34861</td><td>Viabiliteitskleuring voor live-cell beeldvorming</td></tr><tr><td>Trypan Blauw 0,4%</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td>Viabiliteitskleuring voor celtelling</td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzym (1X), geen fenolrood</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12604039</td><td>Voor hechtingsceldetachment</td></tr><tr><td>UltraPure EDTA (0,5 M, pH 8,0)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td>Gebruikt voor FACS-bufferbereiding</td></tr><tr><td>15-mL conische bodem centrifugeerbuizen</td><td>Corning</td><td>352097</td><td>Steriele</td></tr><tr><td>24-well weefselcultuurplaat (weefselcultuur&ndash;behandeld)</td><td>Corning</td><td>3524</td><td>Gebruikt voor NK-celrecuperatie</td></tr><tr><td>96-well heldere ronde bodem plaat (weefselcultuur&ndash;behandeld)</td><td>Corning</td><td>3799</td><td>Gebruikt voor co-cultuur en flowcytometrie assays</td></tr><tr><td>96-well platte heldere bodem zwarte polystyreen plaat (weefselcultuur&ndash;behandeld)</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>Compatibel met live-cell beeldvormingssystemen</td></tr></tbody></table>

kwantificatie van nk-cel cytotoxiciteit versterkt door chimerische antigeenreceptoren en therapeutische antilichamen met behulp van live-cell imaging en flowcytometrie

Quantifying NK-Cell Cytotoxicity Potentiated by Chimeric Antigen Receptors and Therapeutic Antibodies Using Live-Cell Imaging and Flow Cytometry

Kwantificatie van NK-cel cytotoxiciteit versterkt door chimerische antigeenreceptoren en therapeutische antilichamen met behulp van live-cell imaging en flowcytometrie

Natural killer (NK) cells are innate lymphocytes that play a critical role in protective immunity against diverse intracellular pathogens and cancers. ...

Ons laboratorium bestudeert de rol van natural killer-cellen bij gezondheid en ziekte, met als doel hun potentieel te benutten om behandelingen voor solide tumoren en bloedkankers te verbeteren. Bestaande assays voor de cytotoxiciteit van NK-cellen missen standaardisatie over verschillende platforms en opstellingen heen. Dit protocol biedt reproduceerbare methoden voor live-cell imaging en flowcytometrie voor een nauwkeurige bepaling van de cytotoxiciteit.Begin met het bereiden van 10 milliliters 2x SYTOX Orange door de SYTOX Orange-stamlopulutie te verdunnen in NK-92-kweekmedium in een centrifugebuis van 15 milliliter met een conische bodem. Tel de doelcellen met een Luna Counter na menging met Trypan Blue of gebruik een andere gevalideerde methode voor celtelling op basis van kleurexclusie. Breng de benodigde hoeveelheid doelcellen over in een centrifugebuis van 15 milliliter met een conische bodem.Centrifugeer de buis 5 minuten bij 300G op kamertemperatuur en verwijder het supernatant. Resuspendeer vervolgens de doelcellen tot een uiteindelijke concentratie van 250.000 cellen per milliliter in 2X SYTOX Orange medium. Beoordeel voor de voorbereiding van de effectorcel de viabiliteit en concentratie van de NK-92 cellen, en ga alleen verder als de viabiliteit hoger is dan 80%, aangezien een lagere viabiliteit de prestaties van de assay kan beïnvloeden.Tel het benodigde aantal NK-92-cellen en breng deze over in individuele centrifugebuizen van 15 milliliter met een kegelvormige bodem. Resuspendeer de cellen na centrifugatie tot een uiteindelijke concentratie van 500 000 cellen per milliliter. Bereid verdunningen van effectorcellen voor door 240 microliters effectorcellen toe te voegen aan de wells van een 96-wells plaat met ronde bodem voor de effector-target-ratio van twee op één, en voeg 120 microliters medium toe aan de overige wells.Voer tweevoudige seriële verdunningen uit van effector-doelwitverhoudingen van 2:1 tot 1:1 tot 0,25:1, waarbij grondig wordt gemengd door ten minste vijf keer te pipetteren en de tips tussen de overbrengingen worden gewisseld. Neem vervolgens de met polylysine gecoate 96-wellplaat met platte bodem om de co-cultuur op te zetten. Resuspendeer de doelwit- en effectorcellen vlak voor de overdracht grondig zonder bellen te vormen, en voeg vervolgens 100 µL van elke cel-suspensie toe aan de betreffende wells.Voeg vervolgens 200 µL PBS toe aan de omliggende ongebruikte wells. Centrifugeer de plaat bij 100G gedurende twee minuten bij kamertemperatuur. Plaats de plaat in het live-cell imaging-systeem.Neem elke uur gedurende 24 uur beelden op bij 37 °C met 5% koolstofdioxide. Controleer de beeldkwaliteit na de eerste scan en pas indien nodig de beeldinstellingen aan. Pas de spectrale ontmenging aan om spillover van SYTOX Orange naar het groene kanaal te corrigeren.Verifieer dat oranje positieve dode cellen niet onterecht worden geïdentificeerd als groen positieve cellen. Om de cel-voor-cel-analyse van niet-adherente cellen te configureren, stelt u de verwachte objectdiameter in op 15 micrometers om overeen te komen met de geschatte celdiameter. Stel de drempelsensitiviteit en textuursensitiviteit in op vijf, en de randensensitiviteit op 10 om de scheiding van celclusters te vergemakkelijken.Stel het filterbereik voor het geaccepteerde objectoppervlak in op 50 tot 2.000 vierkante micrometer om debris en grote objecten uit te sluiten. Stel de maximale excentriciteit in op 0,95 om niet-cellulaire objecten uit te sluiten. Gebruik primaire humane NK-cellen die gedurende 16 tot 24 uur zijn gekweekt.Breng 500, 000 doelcellen over in een conische centrifugebuis van 15 milliliter. Was de cellen één keer met 10 milliliters PBS. Centrifugeer de cellen bij 300G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Verwijder vervolgens het supernatant. Bereid een werkoplossing van 0,5 µM carboxyfluoresceïne-succinimidylester of CFSE in PBS door één µL van de 5 mM CFSE-stamoplossing te verdunnen in 10 mL PBS. Resuspendeer het verkregen pellet in de CFSE-oplossing op een concentratie van ongeveer één miljoen cellen per mL.Incubeer de cellen gedurende 15 minuten bij 37 °C, gewikkeld in aluminiumfolie om ze tegen licht te beschermen. Stop vervolgens de reactie door vijf tot 10 volumes kweekmedium toe te voegen en incubeer gedurende vijf minuten bij 37 °C. Na het centrifugeren van de cellen wordt de celpellet opnieuw gesuspendeerd op 250.000 cellen per milliliter, zodat 100 µL 25.000 cellen bevat.Voeg met een meerkanaals pipet 100 µL doelcellen per well toe aan de aangewezen wells van een 96-wells plaat met ronde bodem. Zet elke conditie in triplikaat op. Bereid vervolgens voor elk testantilichaam en bijbehorende isotypecontrole 200 µL 4X antilichaamoplossing voor in NK-celkweekmedium.Overbreng de antilichaamoplossingen naar een deep well plate. Voeg 50 µL antilichaamoplossing toe aan elke well met de doelcellen en meng dit grondig door ten minste vijf keer te pipetteren. Voeg 50 µL NK-cel kweekmedium per well toe aan de controle-wells zonder antilichaam en meng dit grondig door te pipetteren.Incubeer de plaat gedurende 25 tot 30 minuten onder standaard incubatieomstandigheden. Tel de cellen en verkrijg 200.000 NK-cellen; ga alleen verder als de levensvatbaarheid groter is dan of gelijk is aan 75%. Resuspendeer de cellen tot 250.000 cellen per milliliter in 800 µL primair humaan NK-celkweekmedium. Voeg per putje 50 µL NK-cellen toe aan de overeenkomstige putjes en meng grondig door ten minste vijf keer op en neer te pipetteren.Pipette vervolgens 50 µL kweekmedium per putje in de controleputjes en meng dit grondig. Inspecteer de 96-wells plaat met ronde bodems zorgvuldig om te bevestigen dat alle putjes 200 µL bevatten met uniforme meniscusniveaus en zonder luchtbellen. Centrifugeer de plaat gedurende twee minuten bij 100G en incubeer deze vervolgens gedurende 16 tot 18 uur onder standaard incubatieomstandigheden.Centrifugeer de plaat gedurende vijf minuten bij 300G en verwijder het supernatant. Was alle wells met 200 µL per well fluorescence-activated cell sorting- of FACS-buffer. Bereid een mastermix van oppervlakte-antilichamen in FACS-buffer voor zoals hier beschreven.Resuspendeer de cellen in 50 µL per well van de antilichaam-mastermix en meng grondig door minstens vijf keer op en neer te pipetteren. Incubeer de plaat gedurende 15 minuten bij 4 °C, gewikkeld in aluminiumfolie om deze tegen licht te beschermen. Voeg 150 µL FACS-buffer per well toe.Resuspendeer de cellen na centrifugatie in 100 µL per well van 5 µM DAPI in FACS-buffer. Ga onmiddellijk over tot flowcytometrie-acquisitie zonder incubatie voorafgaand aan de acquisitie. Voer de flowcytometrie uit met het Cytek Aurora-instrument en registreer de fluorescentiekanalen voor CFSE, BV421, BV785, PE-Cy7, DAPI en eventuele aanvullende fluoroforen.Tijdens de co-cultuur werden effectorcellen, levende doelcellen en dode cellen gevisualiseerd met behulp van real-time live-cell microscopie. CAR2- en CAR3-NK-92-cellen vertoonden een snellere killing-kinetiek dan CAR1-NK-92-cellen, met name op vroege tijdstippen bij een gelijke effector-doelcelratio. De doding van doelcellen nam toe bij hogere effector-doelcelratio's, inclusief controle NK-92-cellen, die natuurlijke cytotoxiciteit vertoonden.CAR2- en CAR3-NK-92-cellen vertoonden een grotere potentie bij lagere effector-doelwitverhoudingen op latere tijdstippen. Daarentegen werd op eerdere tijdstippen een verhoogde potentie waargenomen bij gemiddelde effector-doelwitverhoudingen. Drie parameters, KR50, KT50 en IKI-50, werden gedefinieerd om de potentie van CAR-NK-92-cellen, de kill-kinetiek en de algehele cytotoxische prestaties over effectorpopulaties te kwantificeren.De toevoeging van alleen daratumumab verminderde de overleving van de doelcellen niet, wat bevestigt dat het antilichaam geen direct effect had op de levensvatbaarheid van de doelcellen in afwezigheid van effectorcellen. Co-cultuur met alleen NK-cellen verminderde de overleving van de doelcellen tot ongeveer 70%, wat wijst op een baseline natuurlijke cytotoxiciteit. De toevoeging van daratumumab verminderde de celoverleving verder tot ongeveer 37%, wat consistent is met een verhoogde antilichaam-gemedieerde cytotoxiciteit.Daarentegen vertoonde de isotype-controleconditie een overleving van ongeveer 62%, wat vergelijkbaar was met de conditie met enkel NK-cellen. De degranulatie van NK-cellen was het laagst in de co-cultuur van NK-cellen en doelcellen zonder antilichaam en het hoogst in de met daratumumab behandelde conditie met ongeveer 31%, terwijl de isotype-controle een tussenliggende degranulatie vertoonde van ongeveer 19%. Dit protocol stelt onderzoekers in staat om de natuurlijke cytotoxiciteit van NK-cellen te kwantificeren, de tumor-dodend vermogen van CAR-NK-ontwerpen te evalueren en de ADCC-efficiëntie van monoclonale antilichamen te vergelijken. Een belangrijk aandachtspunt bij het uitvoeren van dit protocol is het handhaven van nauwkeurig en consistent tellen, pipetteren en uitplaten van NK- en doelcellen om betrouwbare en interpreteerbare resultaten te garanderen.Toekomstige studies kunnen deze protocollen gebruiken om immuunontwijking door NK-cellen te onderzoeken, tumorgevoeligheid te vergelijken en nieuwe op NK-cellen gebaseerde immunotherapieën bij verschillende soorten kanker te evalueren.

quantifying-nk-cell-cytotoxicity-potentiated-chimeric-antigen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates the lytic activity of natural killer cells against fluorescently-stained target cells. The method enables NK cell-induced cytotoxicity measurement by staining dead cells and using a flow cytometer to quantify live and dead target cells.

Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity Assay Sample Preparation for Flow Cytometric Analysis

We beschrijven een single-cell high-throughput assay voor cytotoxiciteit van T-cellen te meten wanneer geïncubeerd met tumor doelcellen. Deze werkwijze gebruikt een dichte, elastomeer reeks sub-nanoliter wells (~ 100.000 putjes / array) ruimtelijk beperken de T-cellen en doelcellen met gedefinieerde verhoudingen en is gekoppeld met fluorescentie microscopie effector-target conjugatie en daaropvolgende apoptose controleren.

Quantitative High-throughput Eencellige cytotoxiciteit T cellen

Dit protocol beschrijft een gevoelige, cel-gebaseerde cytotoxiciteit assay. Door het tellen van de afname in frequentie van levende doelwit CD4+ T-cellen in aanwezigheid van een toenemend aantal effector CD8+ T-cellen, staat deze assay toe de directe beoordeling van de cytolytische activiteit van antigeen-specifieke CD8+ T-cellen.

Celgebaseerde flowcytometrie-test om cytotoxische activiteit te meten

Een eenvoudige en betrouwbare werkwijze is beschreven om een ​​set van NK celfuncties zoals degranulatie cytokine en chemokine productie in verschillende NK cel subsets te analyseren.

Flowcytometrie-gebaseerde test voor het toezicht op NK celfuncties

Dit werk beschrijft een geavanceerd werkproces voor de nauwkeurige en snelle bepaling van het NK (Natural Killer) celgetal en de NK celcytotoxiciteit in menselijke bloedmonsters.

Flow cytometrische analyse van de NK-cel lytische activiteit in humaan volbloed

Een stroom cytometry gebaseerde methode om kwantitatief de cytotoxische activiteit van menselijke natural killer cellen wordt hier weergegeven.

Een stroom Cytometry gebaseerde cytotoxiciteit Assay voor de beoordeling van menselijke NK cel activiteit

We beschrijven een kwantitatieve real-time in vitro cytolysis assay systeem om de potentie van chimere antigeen receptor T-cellen gericht op vloeibare en solide tumorcellen te evalueren. Dit protocol kan worden uitgebreid om andere immuuneffector cellen te beoordelen, evenals combinatie behandelingen.

Een real-time potentie test voor Chimerische antigeen receptor T-cellen gericht op vaste en hematologische kankercellen

Een protocol om kwantitatieve tumorceldoding te evalueren door Jurkat-cellen die chimere antigeenreceptor (CAR) tot expressie brengen die gericht zijn op een enkel tumorantigeen. Dit protocol kan worden gebruikt als een screeningsplatform voor snelle optimalisatie van CAR-scharnierconstructies voorafgaand aan bevestiging in perifere bloed-afgeleide T-cellen.

Snelle in-vitrocytotoxiciteitsevaluatie van Jurkat die chimere antigeenreceptor tot expressie brengt met behulp van fluorescerende beeldvorming

Hier presenteren we een methode om verbindingen te identificeren die het ADCC-mechanisme moduleren, een belangrijk kankerceldodend mechanisme van antitumorantilichamen. Het cytotoxische effect van NK-cellen wordt gemeten in sferoïden van borstkankercellen in aanwezigheid van Trastuzumab. Beeldanalyse identificeert levende en dode killer- en doelcellen in sferoïden.

Kwantificering van antilichaamafhankelijke cellulaire cytotoxiciteit in een tumorsferoïde model: aanvraag voor ontdekking van geneesmiddelen

Hier beschrijven we een methode voor het maken van dubbele emulsiedruppeltjes die één T-cel en een kankerdoelcel inkapselen om celdoding op eencellig niveau te onderzoeken. Deze methode maakt dubbele kwantificering mogelijk van zowel cytotoxische moleculen als apoptose van doelcellen binnen een grote populatie T-cellen.

Op druppels gebaseerde cytotoxiciteitstest om chimere antigeenreceptor-T-cellen op eencellig niveau te beoordelen

Ragon Institute of Mass General, MIT, and Harvard.  Dit protocol biedt een gestandaardiseerde in vitro. workflow voor consistente meting van natuurlijke, chimere antigeenreceptor-gemedieerde en antistofafhankelijke cytotoxiciteit van menselijke natuurlijke moordenaars met behulp van live-cell imaging en flowcytometrie.

Kwantificatie van NK-cel cytotoxiciteit versterkt door chimerische antigeenreceptoren en therapeutische antilichamen met behulp van live-cell imaging en flowcytometrie

Meer video's verkennen