Functionele karakterisering van individuele pre- en postsynaptische partners in het centrale zenuwstelsel van de Drosophila-larve met behulp van CaMPARI

Ons onderzoek richt zich op het beoordelen van functionele synaptische connectiviteit tussen gedefinieerde neurale knooppartners in levende en gedissecte Drosophila-larven. Conventionele methoden vereisen dissectie of fysieke stimulatie. Dit protocol gebruikt optogenetica in intacte larven, waardoor artefacten worden verminderd.

Begin met het smelten van het maïsmeel-agarmedium 8-10 seconden in de magnetron zonder te koken en laat het afkoelen op kamertemperatuur zonder te stollen. Voeg vóór volledige afkoeling all-transretinal, of ATR, toe aan een concentratie van 0,5 millimolair om het medium aan te vullen voor vliegen die csChrimson-activatie nodig hebben. Bedek de flesjes volledig met aluminiumfolie om lichtblootstelling te voorkomen.

Kruis maagdelijke vrouwen met de CaMPARI- en csChrimson-genen, waarbij mannen de GAL4- en LexA-drivergenen dragen in plastic flesjes met het voorbereide medium. Bereid parallelle flesjes voor zonder ATR als controle. Breng de flesjes uit op 25 graden Celsius totdat de larven het derde stadium bereiken.

Gebruik een verfkwast om een larve van het derde stadium te verzamelen. Spoel de larve af in een microspotplaat met drie putjes met 0,1 molaire PBS om eventuele hechtende voedingsmiddelen te verwijderen. Plaats een kleine hoeveelheid modelleerklei op elke hoek van een schone 18 x 18 millimeter deklaag.

Plaats de larve in een druppel PBS op het deksel en laat het met de buikzijde naar beneden liggen. Plaats een schoon microscoopglaasje over het deksel met de larve. Bevestig de deksel door boetseringsklei op de hoeken aan te brengen, met net genoeg druk om de larve te immobiliseren zonder het te verpletteren of het glas te breken.

Plaats de glaasglaasplaat met de larve op het podium van een confocale microscoop uitgerust met een 40x/1.2 objectieflens. Klik in de microscoop-softwareinterface op Live. Klik vervolgens onder het Z-stackpaneel op Set First en vervolgens Set Last gevolgd door Stop om een baseline Z-stack van postsynaptische neuronen te verkrijgen, die CaMPARI uitdrukken.

Stel onder het menu Kanalen het groene kanaal van 488 nanometer in met 0,8% laservermogen. Stel vervolgens het 561 nanometer rode kanaal in op 0,8% laservermogen. Stel onder het Z-stackmenu de intervalwaarde in op 1 micrometer.

Selecteer in het Acquisitiemenu Presets om de resolutie van 256 x 256 pixels in te stellen. Een lijngemiddelde waarde van 2, bidirectionele scanning en een scansnelheid van 9, waardoor de pixeltijd automatisch kan worden bijgewerkt. Voer alle beeldvorming uit in een donkere omgeving, waarbij identieke acquisitieparameters gedurende het hele experiment behouden blijven.

Stel het 405 nanometer fotoconversielicht in op 0,5% laservermogen. En de 561 nanometer optogenetische stimulatieverlichting tot 0,8% laservermogen. Klik op Live en selecteer vervolgens Beste Fit onder het histogrampaneel.

Laat beide lasers de larve gelijktijdig 30 seconden stimuleren en stop daarna de stimulatie. Tijdens poststimulatie ZStack-verwerving met dezelfde parameters als de basislijn, observeer rode CaMPARI-fluorescentie in lasergestimuleerde neuronen van ATR-gevoede larven met minimale fotoconversie en controles. Klik in de Fiji ImageJ-software op Bestand en kies vervolgens Open.

In het BioFormats importoptiesvenster met standaardinstellingen klik je op OK om de verkregen ZStack-afbeelding te openen. Kies onder het afbeeldingsmenu Kleur en vervolgens Split Channels om de rode en groene kanalen van de verkregen afbeelding te bekijken. Voor achtergrondaftrekking klik je op Proces en selecteer dan Achtergrond aftrekken.

Stel in het pop-upvenster de rollende balstraal in op 50 pixels, klik dan op OK en selecteer Ja in het Proces Stapel-venster. Selecteer vervolgens onder het menu Analyseren Tools, kies vervolgens ROI Manager om het ROI-venster te openen. Gebruik de vrijhandse selectietool om interessegebieden rond individuele cellen te schetsen.

Selecteer in het ROI-venster Toevoegen om de geselecteerde overzicht op te slaan. Klik vervolgens op Meten om resultaten van oppervlakte, gemiddelde, standaarddeviatie en geïntegreerde dichtheid te genereren. Het proces herhaalt voor meerdere cellen van dezelfde larve over zowel groene als rode kanalen apart.

Na het exporteren van de resultaten naar een spreadsheet meet je de rood-groen- of R-bij-G-verhouding van de geïntegreerde dichtheden voor elke cel, en gemiddeld je deze waarden om de gemiddelde R-x-G-verhouding per larve te berekenen voor zowel de pre- als poststimulatiebeelden. Ten slotte bereken je de verandering in fluorescentie of delta R met G door de pre-stimulatie R bij G-verhouding af te trekken van de post-stimulatie R bij G-verhouding om de postsynaptische calciumactiviteit te kwantificeren. De functionele connectiviteitsstudies tussen klasse IV dendritische arborisatie- of cIVda-neuronen en basin-4 interneuronen in larven van het derde stadium toonden aan dat de basin-4 interneuronen groene fluorescentie vertoonden door cytosolische CaMPARI-expressie vóór fotoconversie en optogene lichtstimulatie.

Er werd geen rode fluorescentie gedetecteerd onder basisomstandigheden, wat de afwezigheid van fotoconversie vóór stimulatie bevestigde. Gelijktijdige fotoconversie, lichtblootstelling en optogenetische stimulatie resulteerden in CaMPARI-fotoconversie van groen naar rood fluorescentie. De afwezigheid van rode fluorescentie in de controle geeft aan dat de fotoconversie specifiek werd aangedreven door csChrimson-gemedieerde neuronale activiteit.

Delta rood bij groene fluorescentie was significant hoger bij proefdieren dan bij geen ATR-controles. Dit protocol kan worden gebruikt om synaptische partnerschap te bevestigen door het volgen van presynaptische stimulatie gevolgd door directe postsynaptische responsen bij levend ontwikkelende dieren mogelijk te maken. De meest uitdagende stap is het correct immobiliseren van het dier; het vereist voldoende druk om beweging te voorkomen zonder het dier te beschadigen.

Toekomstige studies zouden het mogelijk kunnen maken om synaptische verbindingen tussen specifieke neuronale populaties tijdens een zich ontwikkelend dier te volgen, te vormen, te versterken en zelfs te elimineren.