Functionele karakterisering van individuele pre- en postsynaptische partners in het centrale zenuwstelsel van de Drosophila-larve met behulp van CaMPARI
June 16th, 2026
Dit protocol beoordeelt functionele synaptische activiteit tussen gedefinieerde neuronale partners in vivo in het centrale zenuwstelsel van Drosophila melanogaster-larven met behulp van genetisch gecodeerde instrumenten. CsChrimson-gemedieerde optogenetische stimulatie van presynaptische cIVda-sensorneuronen induceert calciumafhankelijke fotoconversie van CaMPARI in postsynaptische Basin-4 interneuronen.
Ons onderzoek richt zich op het beoordelen van functionele synaptische connectiviteit tussen gedefinieerde neurale knooppuntpartners in levende en ontlede Drosophila-larven. Conventionele methoden vereisen ontleding of fysieke stimulatie. Dit protocol gebruikt optogenetica in intacte larven, waardoor artefacten worden verminderd.
Om te beginnen, smelt u het cornmeal-agar medium in een magnetron gedurende 8-10 seconden zonder te koken en laat het op kamertemperatuur afkoelen zonder te stollen. Voeg voor het volledig afkoelen all-trans-retinal, of ATR, toe tot een concentratie van 0,5 millimolair om het medium aan te vullen voor vliegen die csChrimson-activering vereisen. Bedek de flesjes volledig met aluminiumfolie om lichtblootstelling te voorkomen.
Kruis maagdelijke vrouwtjes die de CaMPARI en csChrimson genen dragen met mannetjes die de GAL4 en LexA driver genen dragen in plastic flesjes met het voorbereide medium. Bereid parallelle flesjes zonder ATR voor als controles. Incubeer de flesjes bij 25 graden Celsius tot de larven de derde larvenstadium bereiken.
Gebruik een penseel om een derde larvenstadium te verzamelen. Spoel de larve af in een micro spotplaat met drie welven die 0,1 molair PBS bevat om alle aanhechtende voeding te verwijderen. Plaats een kleine hoeveelheid modelklei bij elke hoek van een schone 18 x 18 millimeter dekglas.
Plaats de larve in een druppel PBS op het dekglas en laat het zich oriënteren met de ventrale kant naar beneden. Plaats een schone microscoopglazen over het dekglas met de larve. Bevestig het dekglas door modelklei op de hoeken aan te brengen, met net genoeg druk om de larve te immobiliseren zonder het te verpletteren of het glas te breken.
Plaats de schuif met de larve op de tafel van een confocale microscoop uitgerust met een 40x/1,2 objectieflens. Klik in de microscoopsoftwareinterface op Live. Klik vervolgens onder het Z Stack-paneel op Set First en vervolgens op Set Last gevolgd door Stop om een basislijn Z Stack van postsynaptische neuronen, die CaMPARI tot expressie brengen, te verkrijgen.
Stel onder het kanalenmenu het 488 nanometer groene kanaal in met 0,8% laservermogen. Stel vervolgens het 561 nanometer rode kanaal in op 0,8% laservermogen. Onder het Z Stack-menu stelt u de intervalwaarde in op 1 micrometer.
Kies in het menu Acquisitie Presets om de resolutie van 256 x 256 pixels in te stellen. Een lijngemiddelde waarde van 2, bidirectioneel scannen en een scansnelheid van 9, waardoor automatische update van pixeltijd mogelijk is. Voer alle beeldvorming uit in een donkere omgeving, waarbij de identieke acquisitieparameters gedurende het hele experiment worden gehandhaafd.
Stel het 405 nanometer fotoconversielicht in op 0,5% laservermogen. En stel het 561 nanometer optogenetische stimulatielicht in op 0,8% laservermogen. Klik op Live en selecteer vervolgens Best Fit onder het histogrampaneel.
Laat beide lasers de larve gedurende 30 seconden gelijktijdig stimuleren en stop vervolgens met de stimulatie. Tijdens post-stimulatie ZStack-acquisitie met dezelfde parameters als basislijn, observeer rode CaMPARI-fluorescentie in laser-gestimulatede neuronen van ATR-gevoede larven met minimale fotoconversie en controles. Klik in de Fiji ImageJ-software op Bestand en kies vervolgens Openen.
In het BioFormats importoptiesvenster met standaardinstellingen, klikt u op OK om de verkregen ZStack-afbeelding te openen. Kies onder het menu Afbeelding eerst Kleur en vervolgens Kanalen splitsen om de rode en groene kanalen van de verkregen afbeelding te bekijken. Voor achtergrondsubtrectie klikt u op Proces en selecteert u vervolgens Achtergrond aftrekken.
Stel in het pop-upvenster de rolling ball-radius in op 50 pixels, klik vervolgens op OK en selecteer Ja in het Process Stack-venster. Kies vervolgens onder het menu Analyse, Gereedschappen en kies ROI Manager om het ROI-venster te openen. Gebruik de vrijehands selectietool om regio's van belang rond individuele cellen te omlijnen.
Selecteer in het ROI-venster Toevoegen om de geselecteerde omtrek op te slaan. Klik vervolgens op Meten om oppervlakte-, gemiddelde-, standaarddeviatie- en geïntegreerde dichtheidsresultaten te genereren. Herhaal het proces voor meerdere cellen van dezelfde larve over de groene en rode kanalen afzonderlijk.
Na het exporteren van de resultaten naar een spreadsheet, meet u de rode naar groene of R door G-verhouding van de geïntegreerde dichtheden voor elke cel en berekent u deze waarden gemiddeld om de gemiddelde R door G-verhouding per larve te berekenen voor zowel de pre- als post-stimulatiebeelden. Bereken tenslotte de verandering in fluorescentie of delta R door G door de pre-stimulatie R door G-verhouding van de post-stimulatie R door G-verhouding af te trekken om post-synaptische calciumactiviteit te kwantificeren. De functionele connectiviteitsstudies tussen klasse IV dendritische arborisatie of cIVda-neuronen en basin-4-interneuronen in derde larvenstadium larven toonden aan dat de basin-4-interneuronen groene fluorescentie vertoonden als gevolg van cytosolische CaMPARI-expressie vóór fotoconversie en optogene lichtstimulatie.
Er werd geen rode fluorescentie gedetecteerd onder basislijncondities, wat de afwezigheid van fotoconversie vóór stimulatie bevestigt. Gelijktijdige blootstelling aan fotoconversielicht en optogenetische stimulatie resulteerde in CaMPARI-fotoconversie van groen naar rode fluorescentie. De afwezigheid van rode fluorescentie in de controle geeft aan dat de fotoconversie specifiek werd aangedreven door csChrimson-gemedieerde neuronale activiteit.
Delta rood door groene fluorescentie was significant hoger bij experimentele dieren dan bij controles zonder ATR. Dit protocol kan worden gebruikt om synaptische partnerschap te bevestigen door het volgen van presynaptische stimulatie gevolgd door onmiddellijke postsynaptische reacties in levend-ontwikkelende dieren mogelijk te maken. De meest uitdagende stap is de juiste immobilisatie van het dier, wat voldoende druk vereist om beweging te voorkomen zonder het dier te schaden.
Toekomstige studies zouden het volgen mogelijk kunnen maken, de vorming, versterking en zelfs eliminatie van synaptische verbindingen
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overview
This article presents a method to functionally validate synaptic connectivity in the Drosophila larval nervous system by combining optogenetic activation with CaMPARI-based calcium imaging. The approach enables researchers to assess activity-dependent synaptic signaling between identified sensory neurons and interneurons in intact, undissected third-instar larvae.
Key Study Components
Area of Science
- Neurobiology
- Functional connectomics
- Optogenetics
- Calcium imaging
Background
- Connectome studies have mapped synaptic connectivity in various species, including Drosophila.
- Electron microscopy provides detailed anatomical data but lacks functional information.
- Recent Drosophila research has identified key neuronal networks underlying specific behaviors, such as nociception.
- Class IV dendritic arborization (cIVda) sensory neurons form major synaptic contacts with Basin-4 interneurons by the third instar larval stage.
Purpose of Study
- To functionally assess synaptic connectivity between cIVda nociceptors and Basin-4 interneurons in Drosophila larvae.
- To demonstrate the utility of CaMPARI as an activity-dependent reporter in live, undissected larvae.
- To establish a proof-of-principle protocol combining optogenetic stimulation and CaMPARI photoconversion.
Methods Used
- Immobilization of third-instar Drosophila larvae on microscope slides.
- Optogenetic activation of cIVda nociceptors using the red-shifted channelrhodopsin CsChrimson.
- Simultaneous CaMPARI photoconversion in Basin-4 interneurons to detect calcium influx.
- Fluorescence imaging to monitor CaMPARI color change as a readout of synaptic activity.
Main Results
- Calcium-dependent photoconversion of CaMPARI was observed in Basin-4 interneurons following optogenetic stimulation of cIVda neurons.
- The method provided functional evidence of synaptic connectivity despite internal larval movements and focal plane changes.
- The approach validated the anatomical connections identified by connectome studies with functional data.
Conclusions
- CaMPARI-based photoconversion is a reliable indicator of synaptic activation in intact Drosophila larvae.
- The protocol enables functional validation of connectomic data in vivo.
- This method can be broadly applied to study neuronal network function in genetically tractable organisms.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Functional validation of synaptic connectivity is critical for de-risking target selection and advancing mechanistic understanding in neurobiology-driven drug discovery. This CaMPARI-based approach enables direct assessment of activity-dependent signaling between defined neuronal partners in intact systems, bridging the gap between anatomical connectomics and actionable functional data. Such methods enhance predictive confidence at the target validation and early discovery inflection points, supporting portfolio decisions in CNS and neurodevelopmental pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of functional synaptic connectivity beyond anatomical mapping.
- Supports mechanistic de-risking by confirming physiologically relevant neuronal interactions.
- Improves predictive confidence for target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Facilitates development of validated, activity-dependent readouts for neuronal assays.
- Provides quantitative, ratiometric outputs suitable for reproducible screening workflows.
- Enables robust assay standardization by integrating optogenetic stimulation with functional imaging.
Translational & Preclinical Research
- Aligns functional synaptic data with disease-relevant neural circuits in preclinical models.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by linking connectomic and functional endpoints.
- De-risks translational biomarker strategies by confirming in vivo neuronal activity patterns.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target validation through assay development and preclinical research, providing a reusable platform for functional connectomics in genetically tractable systems.
- Discovery Biology: Validates synaptic function and pathway engagement in intact neural circuits.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible readouts for compound or genetic perturbation studies.
- Analytics: Enables ratiometric measurement of calcium-dependent activity for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges anatomical and functional data to inform disease-relevant model selection.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable workflow adaptable to diverse neuronal targets and circuits.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neural target validation.
- Operational Value: Standardizes functional readouts and supports reproducibility across experiments.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and prioritizes targets with validated functional relevance.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of CNS and neurodevelopmental programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optogenetics, calcium imaging, and genetic model systems.
- Needs fluorescence microscopy infrastructure and precise light delivery systems.
- Demands cross-team standardization for assay reproducibility and data interpretation.
- Adaptation to other model systems depends on genetic tractability and optical accessibility.
- Internal movement and focal plane changes in live imaging must be managed for reliable outputs.