ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het Cancer Biology and Precision Therapeutics Center van de China Medical University, vanuit het Featured Areas Research Center Program in het kader van het Higher Education Sprout Project van het Ministerie van Onderwijs (MOE) in Taiwan (CBPTC-PROJ-5-2).
Wij danken het Cancer Biology and Precision Therapeutics Center voor de financiering en de academische ondersteuning.

<ol>
	<li>Sung, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2020:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).</li><li>Perou, C. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+portraits+of+human+breast+tumours.">Molecular portraits of human breast tumours.</a> Nature. 406 (6797), 747-752 (2000).</li><li>Foulkes, W. D., Smith, I. E., Reis-Filho, J. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple-negative+breast+cancer.">Triple-negative breast cancer.</a> N Engl J Med. 363 (20), 1938-1948 (2010).</li><li>Dent, R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple-negative+breast+cancer:+Clinical+features+and+patterns+of+recurrence.">Triple-negative breast cancer: Clinical features and patterns of recurrence.</a> Clin Cancer Res. 13 (15 Pt 1), 4429-4434 (2007).</li><li>Lin, N. U., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sites+of+distant+recurrence+and+clinical+outcomes+in+patients+with+metastatic+triple-negative+breast+cancer:+High+incidence+of+central+nervous+system+metastases.">Sites of distant recurrence and clinical outcomes in patients with metastatic triple-negative breast cancer: High incidence of central nervous system metastases.</a> Cancer. 113 (10), 2638-2645 (2008).</li><li>Bianchini, G., De Angelis, C., Licata, L., Gianni, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+landscape+of+triple-negative+breast+cancer+-+expanded+options,+evolving+needs.">Treatment landscape of triple-negative breast cancer - expanded options, evolving needs.</a> Nat Rev Clin Oncol. 19 (2), 91-113 (2022).</li><li>Lecoultre, M., Dutoit, V., Walker, P. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+function+of+tumor-associated+macrophages+as+a+key+determinant+of+tumor+progression+control:+A+review.">Phagocytic function of tumor-associated macrophages as a key determinant of tumor progression control: A review.</a> J Immunother Cancer. 8 (2), (2020).</li><li>Mantovani, A., Allavena, P., Marchesi, F., Garlanda, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+as+tools+and+targets+in+cancer+therapy.">Macrophages as tools and targets in cancer therapy.</a> Nat Rev Drug Discov. 21 (11), 799-820 (2022).</li><li>Chan, S. H., Lin, C. Y., Tseng, H. J., Wang, L. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cd24a+knockout+results+in+an+enhanced+macrophage-+and+cd8&#x207A;+t+cell-mediated+anti-tumor+immune+responses+in+tumor+microenvironment+in+a+murine+triple-negative+breast+cancer+model.">Cd24a knockout results in an enhanced macrophage- and cd8&#x207A; t cell-mediated anti-tumor immune responses in tumor microenvironment in a murine triple-negative breast cancer model.</a> J Biomed Sci. 32 (1), 73 (2025).</li><li>Majeti, R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD47+is+an+adverse+prognostic+factor+and+therapeutic+antibody+target+on+human+acute+myeloid+leukemia+stem+cells.">CD47 is an adverse prognostic factor and therapeutic antibody target on human acute myeloid leukemia stem cells.</a> Cell. 138 (2), 286-299 (2009).</li><li>Barkal, A. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD24+signalling+through+macrophage+siglec-10+is+a+target+for+cancer+immunotherapy.">CD24 signalling through macrophage siglec-10 is a target for cancer immunotherapy.</a> Nature. 572 (7769), 392-396 (2019).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD24-siglec+axis+is+an+innate+immune+checkpoint+against+metaflammation+and+metabolic+disorder.">CD24-siglec axis is an innate immune checkpoint against metaflammation and metabolic disorder.</a> Cell Metab. 34 (8), 1088-1103.e6 (2022).</li><li>Chan, S. H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+novel+role+of+CD24+as+an+oncogenesis+regulator+and+therapeutic+target+for+triple-negative+breast+cancer.">Identification of the novel role of CD24 as an oncogenesis regulator and therapeutic target for triple-negative breast cancer.</a> Mol Cancer Ther. 18 (1), 147-161 (2019).</li><li>Huang, S., Zhang, X., Wei, Y., Xiao, Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Checkpoint+CD24+function+on+tumor+and+immunotherapy.">Checkpoint CD24 function on tumor and immunotherapy.</a> Front Immunol. 15, 1367959 (2024).</li><li>Weiskopf, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+are+critical+effectors+of+antibody+therapies+for+cancer.">Macrophages are critical effectors of antibody therapies for cancer.</a> MAbs. 7 (2), 303-310 (2015).</li><li>Cao, X., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+antibody-dependent+cellular+phagocytosis+for+effective+macrophage-based+cancer+immunotherapy.">Promoting antibody-dependent cellular phagocytosis for effective macrophage-based cancer immunotherapy.</a> Sci Adv. 8 (11), eabl9171 (2022).</li><li>Aderem, A., Underhill, D. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+phagocytosis+in+macrophages.">Mechanisms of phagocytosis in macrophages.</a> Annu Rev Immunol. 17, 593-623 (1999).</li><li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+phagocytosis.">The cell biology of phagocytosis.</a> Annu Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).</li><li>Denardo, D. G., Ruffell, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+as+regulators+of+tumour+immunity+and+immunotherapy.">Macrophages as regulators of tumour immunity and immunotherapy.</a> Nat Rev Immunol. 19 (6), 369-382 (2019).</li><li>Horsthemke, M., Wilden, J., Bachg, A. C., Hanley, P. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+3d+imaging+of+phagocytosis+by+mouse+macrophages.">Time-lapse 3d imaging of phagocytosis by mouse macrophages.</a> J Vis Exp. (140), e57566 (2018).</li></ol>

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Verschillende stappen in dit protocol zijn cruciaal voor het verkrijgen van betrouwbare en reproduceerbare resultaten. Ten eerste hebben de kwaliteit en zuiverheid van de PBMC-isolatie een directe invloed op de opbrengst van macrofagen en de efficiëntie van de differentiatie. Voorzichtige gelaagdheid van verdund bloed over de Ficoll-gradiënt en centrifugatie waarbij de rem is uitgeschakeld, zijn essentieel om de interface van de buffy coat te behouden. Onvolledige RBC-lyse of een te lange incubatie met lysebuffer zal de ...

Borstkanker is de meest gediagnosticeerde maligniteit onder vrouwen wereldwijd, met jaarlijks ongeveer 2,3 miljoen nieuwe gevallen1. De ziekte is klinisch heterogeen en wordt ingedeeld in ten minste vier belangrijke moleculaire subtypen op basis van de status van hormoonreceptoren — de oestrogeenreceptor (ER) en de progesteronreceptor (PR) — en de expressie van het human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) oncogen2. Luminale A-tumoren brengen ER en/of PR tot expressie zonder HER2-overexpressie (ER/PR+ en HER2−); luminale B-tumoren brengen ER/PR en HER2 gelijktijdig tot expressie (ER/PR+ en HER2+); HER2+-tumoren worden gekenmerkt door een hoge HER2-expressie onafhankelijk van de hormoonreceptorstatus; en triple-negatieve borstkanker (TNBC) vertoont geen expressie van deze drie markers (ER−, PR− en HER2−)2,3. Van deze subtypen vormt TNBC de klinisch meest uitdagende vorm en is verantwoordelijk voor ongeveer 15%–20% van alle gevallen van borstkanker. Patiënten met TNBC vertonen het meest agressieve ziekteverloop, met de slechtste prognose en de kortste 5-jaarsoverleving, vanwege de geringe respons op conventionele chemotherapie en het ontbreken van effectieve doelgerichte therapieën3,4. Bovendien vertoont TNBC een significant hoge neiging tot viscerale metastasering, in het bijzonder naar de longen binnen 5 jaar na de diagnose, en patiënten met gevorderde of gemetastaseerde TNBC (mTNBC) hebben een mediane overleving die zelden de 2 jaar overschrijdt5,6. Deze statistieken onderstrepen de kritieke en onvervulde behoefte aan nieuwe therapeutische strategieën voor TNBC.
De tumoromgeving (TME) speelt een cruciale rol bij de progressie van borstkanker en immuunontwijking. Tumor-geassocieerde macrofagen behoren tot de meest voorkomende immuuncellen binnen de TME en zijn recentelijk erkend als kritische mediatoren van de aangeboren anti-tumorimmuniteit7,8,9. Hoewel TAM's historisch gezien werden onderverdeeld in pro-inflammatoire “M1”- en pro-tumorale “M2”-toestanden, slaagt dit binaire model er niet in om de werkelijke omvang van de heterogeniteit van macrofagen vast te leggen. In plaats daarvan beslaan TAM's een dynamisch functioneel spectrum en evolueren ze als reactie op de diverse biochemische signalen binnen de TME. Binnen dit complexe landschap ondermijnen kankercellen actief de macrofaagactiviteit via diverse strategieën voor immuunontwijking, met name de overexpressie van “niet opeten”-signalen. De CD47/SIRPα-as was het eerste geïdentificeerde aangeboren immuuncheckpoint in deze context6,10, en recentelijk is CD24 naar voren gekomen als een nieuw en krachtig antifagocytisch signaal11,12. CD24 is een klein en sterk geglycosyleerd mucine-type glycoproteïne dat via een glycosylfosfatidylinositol-koppeling aan het celmembraan is verankerd13. Het komt onder fysiologische omstandigheden voor in verschillende immuuncellijnen, maar wordt vaak overgeëxpresseerd in solide tumoren, waaronder borst-, eierstok-, pancreas- en colorectale kanker14. Op tumorcellen bindt CD24 aan de inhiberende receptor sialinezuurbindend immunoglobuline-achtig lectine 10 (Siglec-10) die op macrofagen tot expressie komt. Deze interactie triggert de fosforylering van de immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif-domeinen in de cytoplasmatische staart van Siglec-10, waardoor de SHP-1- en SHP-2-fosfatasen worden geactiveerd die de stroomafwaartse fagocytische signalering onderdrukken11. Het blokkeren van de CD24/Siglec-10-interactie met monoklonale antilichamen heeft aangetoond dat de fagocytose van CD24-expresserende menselijke tumoren door macrofagen robuust wordt versterkt. Onze recente studie toonde ook aan dat knockout van CD24a in borstkankercellen hun vatbaarheid voor macrofaagfagocytose verhoogt in een muismodel voor triple-negatieve borstkanker9.
Antilichaam-afhankelijke cellulaire fagocytose (ADCP) is een cruciaal mechanisme waarmee antilichamen macrofagen aansturen om tumorcellen te fagocyteren15,16. Na binding aan op tumorcellen tot expressie gebrachte antigenen, bindt de Fc-regio van het antilichaam aan Fcγ-receptoren (FcγRs) op macrofagen, wat intracellulaire signaleringscascades activeert die leiden tot reorganisatie van het cytoskelet, vorming van de fagocytosecup en insluiting van de doelcel17.
In deze studie hebben we een time-lapse live-cell imagingprotocol ontwikkeld en gevalideerd voor het meten van antilichaam-gestuurde fagocytose van borstkankercellen door macrofagen. De methode maakt gebruik van macrofagen afgeleid van perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC) van gezonde menselijke donoren, gedifferentieerd met macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) en vervolgens gestimuleerd met lipopolysaccharide (LPS) en interferon gamma (IFN-γ). Flowcytometrie-analyse bevestigde de upregulatie van CD80 binnen de CD11b⁺ populatie na stimulatie (Figuur 1), wat het klassiek geactiveerde fenotype ondersteunt. Deze activatiestatus verleent een robuuste antilichaam-gemedieerde fagocytische capaciteit, waardoor deze zeer geschikt is voor het evalueren van antilichaam-afhankelijke cellulaire fagocytose (ADCP). GFP-getagde CD24-positieve borstkankercellen dienen als doelcellen en worden vóór co-cultuur geopsoniseerd met een therapeutisch anti-CD24 monoklonaal antilichaam. Fagocytische gebeurtenissen worden gedurende een periode van 16 h geregistreerd met een geautomatiseerde microscoop onder gecontroleerde omgevingsomstandigheden. Om kwantitatieve beoordeling parallel aan dynamische visualisatie mogelijk te maken, wordt een aparte endpoint-assay uitgevoerd onder identieke co-cultuurcondities, wat een nauwkeurige meting van fagocytose mogelijk maakt na verwijdering van niet-geïnternaliseerde doelcellen. Dit protocol biedt een gestandaardiseerd, reproduceerbaar en visueel informatief platform voor het evalueren van ADCP gemedieerd door een anti-CD24 antilichaam. Cruciaal is dat de integratie van time-lapse imaging met een complementaire op endpoints gebaseerde kwantificeringsstrategie gelijktijdige evaluatie van de fagocytische kinetiek en omvang mogelijk maakt. De methode kan worden aangepast voor het onderzoeken van andere immunotherapeutische targets gericht op macrofagen. Dit protocol is het meest geschikt voor het evalueren van ADCP gemedieerd door therapeutische monoklonale antilichamen tegen oppervlakteantigenen op kankercellen. Het is zeer geschikt voor vergelijkende screening van kandidaat-antilichamen, dosis-respons karakterisering en mechanistische studies naar Fc–FcγR interacties, inclusief de effecten van blokkade van "don't-eat-me"-signalen (bijv. CD47–SIRPα). Omdat de assay gebruikmaakt van primaire menselijke macrofagen, is deze ook geschikt voor translationele studies waarbij beoordeling van donor-tot-donor variabiliteit vereist is voorafgaand aan klinische ontwikkeling.
<img alt="Figuur 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71461/71461fig1.jpg" /> 
Figuur 1. Generatie en flowcytometrie-validatie van IFN-γ/LPS-gestimuleerde macrofagen afgeleid van mononucleaire cellen uit perifeer bloed. Bovenste paneel: Mononucleaire cellen uit perifeer bloed (PBMCs) worden geïsoleerd van gezonde donoren via dichtheidsgradiëntcentrifugatie met Ficoll-oplossing bij 400 × g gedurende 30 min bij 20°C, waarbij alle reagentia vooraf zijn geëquilibreerd op 20°C ± 2°C. Geïsoleerde PBMCs worden 7 dagen lang gekweekt in ImmunoCult-SF medium aangevuld met 100 ng/mL macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) om macrofaagdifferentiatie te stimuleren (Dag 0–7), met aanvulling van het medium op Dag 5. Op Dag 8 worden de gedifferentieerde macrofagen 48 u gedurende gestimuleerd met 100 ng/mL IFN-γ en 1 µg/mL LPS (Dag 8–10). De cellen worden vervolgens onderworpen aan flowcytometrie-analyse. Onderste paneel: Flowcytometrie-analyse van macrofagen. Cellen werden gekleurd met een oppervlaktepaneel bestaande uit CD11b-FITC, CD80-PE en CD206-PerCP-Cy5.5, gevolgd door de toevoeging van DAPI vóór acquisitie voor de uitsluiting van dode cellen. Gating-strategie: Cellen werden eerst gegated op levende cellen (DAPI⁻), gevolgd door CD11b⁺-identificatie op een CD11b-FITC versus FSC-A plot om de macrofaagidentiteit te bevestigen. Levende CD11b⁺-events werden vervolgens geanalyseerd op een CD80 versus CD206 dot plot om de CD80⁺CD206⁻ populatie geïnduceerd door IFN-γ/LPS-stimulatie te bevestigen. Rechts: Representatieve dot plot van CD11b-FITC versus FSC-A die aantoont dat 99,8% van de gegatede cellen CD11b⁺ was, wat de macrofaagidentiteit bevestigt. Links: De meerderheid van de CD11b⁺-cellen viel binnen de CD80⁺CD206⁻ gate (Q1: 95,2%), wat wijst op het verwachte pro-inflammatoire fenotype onder de toegepaste stimulatiecondities. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71461/71461fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Gebruikers moeten rekening houden met verschillende beperkingen bij het toepassen van deze techniek. Ten eerste kan donorvariabiliteit in uit PBMC afgeleide macrofagen leiden tot aanzienlijke variantie in de fagocytische output; wij raden aan om meerdere donoren (n ≥ 3) te gebruiken en individuele donorgegevens naast de gepoelde resultaten te rapporteren. Ten tweede bootst het 2D co-cultuurformaat de tumormicro-omgeving niet na, waardoor bevindingen moeten worden gevalideerd in 3D- of in vivo-modellen voordat klinische conclusies kunnen worden getrokken. Ten derde legt het beeldvormingsvenster van 16 uur vroege fagocytische gebeurtenissen vast, maar weerspiegelt het geen langetermijnprocessen zoals antigeenpresentatie of secundaire immuunactivatie. De gecombineerde inzet van real-time beeldvorming en eindpuntkwantificering biedt dus een complementair kader dat zowel de interpreteerbaarheid als de reproduceerbaarheid van ADCP-metingen verbetert.

<table><tbody><tr><td>0,5 M ethylendiaminetetraazijnzuur (EDTA) voorraadoplossing</td><td>Sigma-Aldrich (of gelijkwaardig)</td><td>E7889 (of equivalent)</td><td>Gebruikt voor het bereiden van een 10 mM EDTA-werkoplossing in PBS voor celdetachering</td></tr><tr><td>24-well weefselkweekplaten (TC-behandeld)</td><td>Corning (of gelijkwaardig)</td><td>3524</td><td>Gebruikt voor co-cultuur van macrofagen en kankercellen tijdens de fagocytose-assay</td></tr><tr><td>Anti-humaan CD206-antilichaam (flowcytometrie)</td><td>BioLegend (of gelijkwaardig)</td><td>321122 (of equivalent)</td><td>Marker voor alternatief macrofaagfenotype</td></tr><tr><td>Anti-humaan CD24 monoklonaal antilichaam</td><td>Thermo Fisher Scientific (of gelijkwaardig)</td><td>MA1-91384 (of equivalent)</td><td>Wordt gebruikt om kankercellen te opsoniseren voor antilichaam-afhankelijke fagocytose</td></tr><tr><td>Geautomatiseerd live-cell imaging-systeem met omgevingscontrolekamer (bijv. Lionheart FX)</td><td>Agilent Technologies (of gelijkwaardig)</td><td>BioTek Lionheart FX geautomatiseerde microscoop</td><td>Maakt langdurige time-lapse-beeldvorming mogelijk onder gecontroleerde temperatuur en &lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; condities</td></tr><tr><td>Beeldvormingssoftware voor geautomatiseerde live-cell imaging (bijv. Gen5)</td><td>Agilent Technologies (of gelijkwaardig)</td><td>Omdat er geen brontekst is verstrekt, kan ik geen vertaling produceren. Voer aub de Engelse tekst in die u vertaald wilt hebben naar het Nederlands.</td><td>Gebruikt voor de acquisitie en analyse van time-lapse imaging-data</td></tr><tr><td>Centrifuge (swing-bucket rotor)</td><td>Thermo Fisher Scientific (of gelijkwaardig)</td><td>Multifuge X4R Pro met TX-1000 rotor (of equivalent)</td><td>Gebruikt voor de isolatie van PBMC's en cellenwasstappen</td></tr><tr><td>&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator (37°C)&amp;deg;C, 5% &lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Thermo Fisher Scientific (of gelijkwaardig)</td><td>Forma Direct Heat &lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Incubator (of equivalent)</td><td>Handhaaft fysiologische omstandigheden voor celkweek</td></tr><tr><td>&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; gasvoorziening met drukregelaar</td><td>Agilent Technologies (of gelijkwaardig)</td><td>Geen gegevens beschikbaar</td><td>Benodigdheden &lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; voor omgevingscontrole van de incubator en het imagingsysteem</td></tr><tr><td>Conische buizen (15 ml en 50 ml)</td><td>Corning (of gelijkwaardig)</td><td>352070 (of equivalent)</td><td>Gebruikt voor de isolatie, het wassen en de centrifugatiestappen van PBMC's</td></tr><tr><td>met EDTA gecoate bloedafnamebuizen (vacutainers)</td><td>BD Biosciences (of gelijkwaardig)</td><td>367863 (of gelijkwaardig)</td><td>Gebruikt voor de afname van volbloedmonsters van donoren</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>Cytiva (of gelijkwaardig)</td><td>17144003 (of equivalent)</td><td>Dichtheidsgradiërmedium voor de isolatie van PBMC's</td></tr><tr><td>Flowcytometer (bijv. FACSCanto II)</td><td>BD Biosciences (of gelijkwaardig)</td><td>BD FACSCanto II&amp;nbsp;</td><td>Gebruikt voor fenotypische analyse van macrofagen</td></tr><tr><td>Compensatieparels (flowcytometrie)</td><td>Biolegend (of gelijkwaardig)</td><td>424602</td><td>Gebruikt voor eenkleurige compensatiecontroles</td></tr><tr><td>FITC anti-human CD11b-antilichaam (flowcytometrie)</td><td>BioLegend (of gelijkwaardig)</td><td>101205 (of gelijkwaardig)</td><td>Marker gebruikt voor de identificatie van macrofagen</td></tr><tr><td>PE anti-human CD80-antilichaam (flowcytometrie)</td><td>BioLegend (of gelijkwaardig)</td><td>375410 (of equivalent)</td><td>Marker geassocieerd met geactiveerd macrofaagfenotype</td></tr><tr><td>GFP-expresserende borstkankercellijn (MDA-MB-468)</td><td>ATCC (of equivalent)</td><td>HTB-132 (of equivalent)</td><td>Doelcellen gebruikt in fagocytose-assay; GFP maakt visualisatie mogelijk</td></tr><tr><td>ImmunoCult-SF macrofaagmedium</td><td>STEMCELL Technologies (of gelijkwaardig)</td><td>10961 (of equivalent)</td><td>Serumvrij medium gebruikt voor macrofaagdifferentiatie</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific (of gelijkwaardig)</td><td>12100046</td><td>Gebruikt voor de kweek en resuspensie van kankercellen</td></tr><tr><td>Isotype-controleantilichaam (IgG)</td><td>Bio X Cell (of gelijkwaardig)</td><td>BE0297 (of equivalent)</td><td>Negatieve controle voor antilichaam-afhankelijke fagocytose-assay</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide (LPS)</td><td>Sigma-Aldrich (of equivalent)</td><td>L2630 (of gelijkwaardig)</td><td>Stimulus gebruikt voor de activatie van macrofagen in combinatie met IFN-&amp;gamma;</td></tr><tr><td>Recombinant humaan interferon gamma (IFN-&amp;gamma;)</td><td>STEMCELL Technologies (of gelijkwaardig)</td><td>78020 (of gelijkwaardig)</td><td>Cytokine gebruikt voor macrofaagactivatie</td></tr><tr><td>Recombinant menselijke macrofaag-koloniestimulerende factor (M-CSF)</td><td>STEMCELL Technologies (of gelijkwaardig)</td><td>78057 (of equivalent)</td><td>Groeifactor gebruikt voor macrofaagdifferentiatie</td></tr><tr><td>Pasteurpipetten of serologische pipetten</td><td>Jetbiofil (of equivalent)</td><td>GSP010010 (of gelijkwaardig)</td><td>Gebruikt voor vloeistofbehandeling tijdens PBMC-isolatie en celkweek</td></tr><tr><td>PBS (Ca2+-vrij)&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;-/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;-vrij)</td><td>Thermo Fisher Scientific (of gelijkwaardig)</td><td>BP399-500 (of equivalent)</td><td>Buffer gebruikt voor het wassen van cellen en verdunningsstappen</td></tr><tr><td>Petrischalen (100 mm, niet-behandeld)&amp;ndash;(behandeld voor weefselkweek)</td><td>Corning (of gelijkwaardig)</td><td>430591</td><td>Gebruikt voor macrofaagdifferentiatie via adherentieselectie</td></tr><tr><td>Lysisbuffer voor rode bloedcellen (RBC)</td><td>BioLegend (of gelijkwaardig)</td><td>420301 (of equivalent)</td><td>Wordt gebruikt voor het verwijderen van rode bloedcellen tijdens de isolatie van PBMC's</td></tr><tr><td>Viability 405/452 Fixable Dye</td><td>Miltenyi Biotec (of gelijkwaardig)</td><td>130-130-404 (of equivalent)</td><td>Wordt gebruikt om de celviabiliteit te beoordelen tijdens flowcytometrie-analyse</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich (of gelijkwaardig)</td><td>D9542 (of equivalent)</td><td>Gebruikt voor de uitsluiting van dode cellen bij flowcytometrie</td></tr></tbody></table>

time-lapse-beeldvorming van antilichaam-gestuurde fagocytose van met groen fluorescent eiwit gelabelde triple-negatieve borstkankercellen door macrofagen

Time-Lapse Imaging of Antibody-Driven Macrophage Phagocytosis of Green Fluorescence Protein&#8211;Labeled Triple-Negative Breast Cancer Cells

Antilichaam-afhankelijke cellulaire fagocytose is een belangrijk mechanisme waarmee macrofagen antilichaam-opsoniseerde kankercellen insluiten. Dit protocol beschrijft een methode voor time-lapse live-cell imaging om de antilichaam-afhankelijke fagocytose door macrofagen van groen fluorescent eiwit-gelabelde, CD24-expresserende triple-negatieve borstkankercellen te visualiseren. Macrofagen worden afgeleid van mononucleaire cellen uit menselijk perifeer bloed, gedifferentieerd met macrophage colony–stimulating factor en gepolariseerd met interferon gamma en lipopolysacharide om een pro-inflammatoir fenotype te genereren. Kankercellen worden opsoniseerde met een anti-CD24 monoklonaal antilichaam voorafgaand aan co-cultuur met macrofagen bij een gedefinieerde effector-to-target ratio. Fagocytische gebeurtenissen worden gedurende een periode van 16 h geregistreerd met behulp van een geautomatiseerde microscoop uitgerust met omgevingscontrole om fysiologische omstandigheden te handhaven. De beeldvorming wordt uitgevoerd met helderveld- en fluorescentiekanalen, waardoor kankercellen kunnen worden geïdentificeerd en hun internalisatie door macrofagen kan worden gemonitord. Representatieve time-lapse beelden tonen de progressieve insluiting van fluorescente kankercellen in de loop van de tijd. Om een kwantitatieve beoordeling mogelijk te maken, wordt een parallelle endpoint-assay uitgevoerd onder identieke co-cultuurcondities, waarbij niet-geïnternaliseerde kankercellen vóór de beeldvorming worden verwijderd om een nauwkeurige meting van fagocytische gebeurtenissen mogelijk te maken. Deze methode biedt een gestandaardiseerde en reproduceerbare aanpak voor het visualiseren van antilichaam-gestuurde macrofaagfagocytose in vitro. Belangrijk is dat de integratie van time-lapse imaging met endpoint-gebaseerde kwantificering een complementaire evaluatie van de kinetiek en de omvang van de fagocytose mogelijk maakt. Dit protocol ondersteunt de evaluatie van therapeutische antilichamen en macrofaag-gerichte kankerimmunotherapieën in een gecontroleerde in vitro setting.

De succesvolle generatie en polarisatie van macrofagen uit PBMC's werden bevestigd middels morfologische beoordeling en flowcytometrie-analyse (Figuur 1). PBMC's die waren geïsoleerd via dichtheidsgradiëntcentrifugatie werden gekweekt in medium aangevuld met M-CSF, wat tegen dag 7 resulteerde in adherente cellen met een kenmerkende macrofaagmorfologie. Na stimulatie met IFN-γ en LPS vertoonden de cellen een fenotype dat consistent was met activatie onder de toegepaste condities. Flowcytometr...

Dit protocol beschrijft een time-lapse live-cell imaging methode om antilichaam-afhankelijke fagocytose van met groen fluorescent proteïne gelabelde triple-negatieve borstkankercellen door macrofagen te visualiseren, met gebruik van macrofagen afgeleid van mononucleaire cellen uit perifeer bloed en een geautomatiseerde microscoop.

Time-lapse-beeldvorming van antilichaam-gestuurde fagocytose van met groen fluorescent eiwit gelabelde triple-negatieve borstkankercellen door macrofagen

Antilichaam-afhankelijke cellulaire fagocytose is een belangrijk mechanisme waarmee macrofagen antilichaam-opsoniseerde kankercellen insluiten. Dit protocol beschrijft een ...

time-lapse-imaging-antibody-driven-macrophage-phagocytosis-green

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

De compartimentering van eiwitten, hetzij binnen het plasma membraan of in de intracellulaire locaties is een regulerend mechanisme die sterk kunnen beïnvloeden signalering resultaten, vandaar dat te begrijpen signalering is het van belang het bestuderen van de ruimtelijke en temporele gedrag van de betrokken eiwitten. We beschrijven hier een TIRF microscopie gebaseerde systeem om signaaltransductie in T-cellen te bestuderen, maar is breed toepasbaar.

Een TIRF Microscopie Techniek voor Real-time, gelijktijdige beeldvorming van de TCR en de bijbehorende signaaleiwitten

This video demonstrates an assay to monitor independent macrophage-mediated red blood cell (RBC) phagocytosis events. Mouse immunoglobulin G (IgG)-opsonized human RBCs are incubated with mouse macrophages and observed under a confocal microscope. The RBCs are engulfed by macrophages via a phagocytic cup formation and targeted for lysosomal degradation.

Real-Time Imaging of Macrophage Phagocytosis of IgG-Opsonized Red Blood Cells

We beschrijven een werkwijze voor beeldvorming respons op...

Leef Imaging van de Drug antwoorden in de tumor micro-omgeving in muismodellen van Kanker van de Borst

Hier presenteren we een protocol om fagocytose van fluorescerende deeltjes door een adherante macrofaag-cellijn te kwantificeren met behulp van een fluorometrische methode. Deze methode maakt een hoge doorvoerkwantificering van deeltjesinternalisatie mogelijk, evenals de resulterende actinepolymerisatie.

High Throughput Fluorometrische Techniek voor Evaluatie van Macrophage Fagocytose en actine polymerisatie

Dit protocol beschrijft het gebruik van multiphoton microscopie tot uitgebreide time-lapse beeldvorming van meercellige interacties uit te voeren in real time, in vivo bij enkele resolutie cel.

Extended Time-lapse intravitale Imaging van Real-time Meercellige Dynamiek in de tumor micro

Hier beschrijven we het model en de aanpak om functies van pulmonaire alveolaire macrofagen in kankermetastase te bestuderen. Om de rol van deze cellen in metastase te demonstreren, werd het syngene (4T1) model van borstkanker gebruikt in combinatie met de depletie van alveolaire macrofagen met clodronat liposomen.

Het bestuderen van de rol van alveolaire macrofagen in de uitzaaiing van borstkanker

We beschrijven een experimentele opstelling om fagosoombevorming en -afsluiting in drie dimensies in levende macrofagen met ongekend hoge resolutie te visualiseren, met behulp van total internal reflection fluorescentiemicroscopie. Het maakt het mogelijk om de basis van de fagocytische cup, de uitbreidende pseudopoden, evenals de precieze plaats van fagosooombaan te monitoren.

&quot;Phagosome Closure Assay&quot; naar phagosome Formatie Visualiseer in drie dimensies behulp van totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie (TIRFM)

Hier beschrijven we methoden draaiende schijf confocale microscopie afbeelding één fagocytische gebeurtenissen via muis resident peritoneale macrofagen. De protocollen kunnen worden uitgebreid tot andere fagocytische cellen.

Time-lapse 3D beeldvorming van fagocytose door macrofagen van de muis

Efferocytosis, de fagocytische verwijdering van apoptotic cellen, is nodig om de homeostase te handhaven en wordt vergemakkelijkt door de receptoren en signaalroutes waarmee voor de erkenning, de engulfment, en de internalisering van de apoptotic cellen. Hierin presenteren wij een fluorescentie microscopie protocol voor de kwantificering van efferocytosis en de activiteit van efferocytic signaalroutes.

Kwantificering van Efferocytosis door eencellige fluorescentie microscopie

Macrofaag fagocytische activiteit tegen kankercellen, in het bijzonder 4T1 muis borstklier carcinoom cellen, werd afgebeeld in deze studie. Het cocultuurmodel van de levende cellen werd vastgesteld en waargenomen met behulp van een combinatie van fluorescerende en differentiële interferentie contrast microscopie. Deze beoordeling is gemaakt met behulp van imaging software om multipoint time-lapse-video te ontwikkelen.

Time-lapse 2D-beeldvorming van fagocytische activiteit in M1 macrophage-4T1 muis borstkanker cellen in co-culturen

Hier presenteren we een protocol voor intravitale beeldvorming van een verzwakte, door BSL-2 goedgekeurde Mycobacterium tuberculosis. Spanning in de muislong met behulp van een permanent longvenster. Deze benadering maakt longitudinale, enkelcelresolutie-analyse mogelijk van vroege interacties tussen gastheer en pathogeen, waaronder bacillaire lokalisatie, vasculaire dynamiek en opname van macrofagen binnen dezelfde longmicroomgeving.

Intravitale beeldvorming van verzwakte auxotrofe mycobacterium tuberculosis in muislong tijdens vroege intravasculaire infectie

National Taiwan University Hospital.  This protocol describes a time-lapse live-cell imaging method to visualize antibody-dependent macrophage phagocytosis of green fluorescent protein–labeled triple-negative breast cancer cells using peripheral blood mononuclear cell–derived macrophages and an automated microscope.

Time-lapse-beeldvorming van antilichaam-gestuurde fagocytose van met groen fluorescent eiwit gelabelde triple-negatieve borstkankercellen door macrofagen

Meer video's verkennen