Name: Kwantificering van fluoride in serum, bot en tanden in een muismodel met behulp van hexamethyldisiloxaan-gefaciliteerde diffusie en metingen met ionselectieve elektroden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-28T12:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Leer fluoride kwantificeren in serum, bot en tanden van muizen met hexamethyldisiloxaan-gefaciliteerde diffusie en ionselectieve elektroden. Deze gevoelige methode detecteert fluoride in zeer kleine monsters voor toxicologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Het in deze publicatie beschreven onderzoek werd ondersteund door de Japan Society for the Promotion of Science; JSPS Overseas Research Fellowships 202560528 (S.Y.), Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP); 2024/07452-9 (J.S.T.), en het National Institute of Dental and Craniofacial Research van de National Institutes of Health; R01DE027648 (M.S.) en K02DE029531 (M.S.).

<ol>
	<li>Podgorski J, Berg M. Global analysis and prediction of fluoride in groundwater. Nat Commun. 2022;13(1):4232. doi:10.1038/s41467-022-31940-x</li>
	<li>Iheozor-Ejiofor Z, Worthington HV, Walsh T, O&#39;Malley L, Clarkson JE, Macey R, et al. Water fluoridation for the prevention of dental caries. Cochrane Database Syst Rev. 2015;2015(6):Cd010856. doi:10.1002/14651858.CD010856.pub2</li>
	<li>Manchanda S, Sardana D, Liu P, Lee GH, Li KY, Lo EC, et al. Topical fluoride to prevent early childhood caries: Systematic review with network meta-analysis. J Dent. 2022;116:103885. doi:10.1016/j.jdent.2021.103885</li>
	<li>Chan AKY, Tamrakar M, Jiang CM, Tsang YC, Leung KCM, Chu CH. Clinical evidence for professionally applied fluoride therapy to prevent and arrest dental caries in older adults: A systematic review. J Dent. 2022;125:104273. doi:10.1016/j.jdent.2022.104273</li>
	<li>Zamperini CA, Bedran-Russo AK. Immediate and Sustained Root Caries Prevention of Fluoride Varnish Combined with Toothpastes. Caries Res. 2023;57(5-6):592-601. doi:10.1159/000533279</li>
	<li>Melough MM, Sathyanarayana S, Zohoori FV, Gustafsson HC, Sullivan EL, Chi DL, et al. Impact of Fluoride on Associations between Free Sugars Intake and Dental Caries in US Children. JDR Clin Trans Res. 2023;8(3):215-23. doi:10.1177/23800844221093038</li>
	<li>Suzuki M, Everett ET, Whitford GM, Bartlett JD. 4-phenylbutyrate Mitigates Fluoride-Induced Cytotoxicity in ALC Cells. Front Physiol. 2017;8:302. doi:10.3389/fphys.2017.00302</li>
	<li>Suzuki M, Shin M, Simmer JP, Bartlett JD. Fluoride affects enamel protein content via TGF-beta1-mediated KLK4 inhibition. J Dent Res. 2014;93(10):1022-7. doi:10.1177/0022034514545629</li>
	<li>Everett ET, McHenry MA, Reynolds N, Eggertsson H, Sullivan J, Kantmann C, et al. Dental fluorosis: variability among different inbred mouse strains. J Dent Res. 2002;81(11):794-8.</li>
	<li>Kong H, He Z, Li H, Xing D, Lin J. The association between fluoride and bone mineral density in US children and adolescents: a pilot study. Nutrients. 2024. doi:10.3390/nu16172948</li>
	<li>Mazzoli R, Filippini T, Iamandii I, De Pasquale L, Veneri F, Birnbaum LS, et al. The association of fluoride exposure with bone density and fracture risk: a dose-response meta-analysis. Environ Health. 2025;24(1):73.</li>
	<li>Suzuki M, Bandoski C, Bartlett JD. Fluoride induces oxidative damage and SIRT1/autophagy through ROS-mediated JNK signaling. Free Radic Biol Med. 2015;89:369-78.</li>
	<li>Kubota K, Lee DH, Tsuchiya M, Young CS, Everett ET, Martinez-Mier EA, et al. Fluoride induces endoplasmic reticulum stress in ameloblasts responsible for dental enamel formation. J Biol Chem. 2005;280(24):23194-202. doi:10.1074/jbc.M503288200</li>
	<li>Yamashita S, Okamoto M, Mendonca M. Fluoride alters gene expression via histone H3K27 acetylation in ameloblast-like LS8 cells. Int J Mol Sci. 2024. doi:10.3390/ijms25179600</li>
	<li>Deng H, Fujiwara N, Cui H, Whitford GM, Bartlett JD, Suzuki M. Histone acetyltransferase promotes fluoride toxicity in LS8 cells. Chemosphere. 2020;247:125825.</li>
	<li>Deng H, Ikeda A, Cui H, Bartlett JD, Suzuki M. MDM2-Mediated p21 Proteasomal Degradation Promotes Fluoride Toxicity in Ameloblasts. Cells. 2019;8(5). doi:10.3390/cells8050436</li>
	<li>Fujiwara N, Whitford GM, Bartlett JD, Suzuki M. Curcumin suppresses cell growth and attenuates fluoride-mediated Caspase-3 activation in ameloblast-like LS8 cells. Environ Pollut. 2021;273:116495. doi:10.1016/j.envpol.2021.116495</li>
	<li>Suzuki M, Ikeda A, Bartlett JD. Sirt1 overexpression suppresses fluoride-induced p53 acetylation to alleviate fluoride toxicity in ameloblasts responsible for enamel formation. Arch Toxicol. 2018;92(3):1283-93. doi:10.1007/s00204-017-2135-2</li>
	<li>Regelson S, Dehghan M, Tantbirojn D, Almoazen H. Evaluation of fluoride levels in commercially available tea in the United States. 2020/12/23 ed2021 Jan-Feb. 17-20 p.</li>
	<li>Cantoral A, Luna-Villa LC, Mantilla-Rodriguez AA, Mercado A, Lippert F, Liu Y, et al. Fluoride Content in Foods and Beverages From Mexico City Markets and Supermarkets. Food Nutr Bull. 2019;40(4):514-31. doi:10.1177/0379572119858486</li>
	<li>Institute of Medicine SCotSEoDRI. Dietary Reference Intakes for Calcium, Phosphorus, Magnesium, Vitamin D, and Fluoride. Washington, DC: National Academy Press; 1997.</li>
	<li>Otal E.H. KML, Kimura M. Fluoride Detection and Quantification, an Overview from Traditional to Innovative Material-Based Methods. In: Wambu E.W. LGJ, Kiplagat A., editor. Fluoride. London: IntechOpen; 2022.</li>
	<li>Whitford GM. Absorption and Plasma Concentrations of Fluoride, 1996.</li>
	<li>Taves DR. Determination of submicromolar concentrations of fluoride in biological samples. Talanta. 1968;15(10):1015-23. doi:10.1016/0039-9140(68)80109-2</li>
	<li>Buzalaf MA, Caroselli EE, de Carvalho JG, de Oliveira RC, da Silva Cardoso VE, Whitford GM. Bone surface and whole bone as biomarkers for acute fluoride exposure. J Anal Toxicol. 2005;29(8):810-3.</li>
	<li>Zohoori FV, Maguire A, Martinez-Mier EA, Buzalaf MAR, Sanderson R, Eckert GJ. A Comparison of Simple Analytical Methods for Determination of Fluoride in Microlitre-Volume Plasma Samples. Caries Res. 2019;53(3):275-83. doi:10.1159/000492339</li>
	<li>Mart&#237;nez-Mier EA, Cury JA, Heilman JR, Katz BP, Levy SM, Li Y, et al. Development of gold standard ion-selective electrode-based methods for fluoride analysis. Caries Res. 2011;45(1):3-12. doi:10.1159/000321657</li>
	<li>Boivin G, Chapuy MC, Baud CA, Meunier PJ. Fluoride content in human iliac bone: results in controls, patients with fluorosis, and osteoporotic patients treated with fluoride. J Bone Miner Res. 1988;3(5):497-502.</li>
	<li>Yamashita S, Okamoto M, Fujiwara N, Achong-Bowe R, Brueckner S, Mendonca M, et al. Developmental vulnerability to fluoride toxicity: enamel and clearance differences in adolescent versus mature mice. Arch Toxicol. 2025.</li>
	<li>Chiba K, Hisamatsu, S., Takizawa, Y, Katsura, K. Determination of fluoride in biological materials by ion chromatography. Journal of Chromatography. 1982;245:8.</li>
	<li>Ikenishi K, Chiba, K., Hisamatsu, S, Takizawa, Y. Determination of fluoride in biological samples by ion chromatography. Journal of Chromatography. 1988;437:8.</li>
	<li>Venkateswarlu P, Reddy, D.S., Reddy, T.S. Spectrophotometric determination of fluoride using the SPADNS method. Analyst 1971;96:5.</li>
	<li>Kakabadse G. KN, Davies C.W. The Spectrophotometric Determination of Fluoride with SPDNS-Zirkonium Lake. Analyst. 1971;96:8.</li>
	<li>Mendham J, Denney RC, Barnes JD, Thomas MJK. Vogel&#39;s Textbook of Quantitative Chemical Analysis. 6th ed. Harlow, England: Prentice Hall; 2000.</li>
	<li>Ku&#269;era J, &#352;tef&#225;nik, M. &#38; Veselka, P. Fluorine determination in biological and environmental samples with INAA using fast neutrons from a p(19 MeV)+Be neutron generator. Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry 2019;322:7.</li>
	<li>Okamoto M, Yamashita S, Memida T, Mendonca M, Brueckner S, Nakamura S, et al. Microhardness Measurements on Tooth and Alveolar Bone in Rodent Oral Disease Models. J Vis Exp. 2024(206). doi:10.3791/66583</li>
	<li>Okamoto M, Yamashita S, Mendonca M, Brueckner S, Achong-Bowe R, Thompson J, et al. Ultrastructural evaluation of adverse effects on dentine formation from systemic fluoride application in an experimental mouse model. Int Endod J. 2025;58(1):128-40.</li>
	<li>Frant MS, Ross JW, Jr. Electrode for sensing fluoride ion activity in solution. Science. 1966;154(3756):1553-5.</li>
	<li>Umezawa Y, Umezawa, K and Sato, H. Selectivity coefficients for ion-selective electrodes: recommended methods for reporting KRB values, 1995.</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Fluoridemetingen werden uitgevoerd met een fluoride-selectieve ion-selectieve elektrode (ISE) met een lanthaanfluoride (LaF₃) kristalmembraan38,39. Dit membraan vormt zeer stabiele La–F bindingen, wat resulteert in een sterke voorkeur voor fluoride-ionen boven andere halogeniden. Volgens vastgestelde elektrochemische literatuur en fabrikantspecificaties vertoont het LaF₃-membraan zeer lage selectiviteitscoëfficiënten voor chloride, wat aangeeft dat chloride-ionen geen meetbare interferentie veroorzaken onder de in dit protocol gebruikte omstandigheden. Hoewel chloride van nature aanwezig is in tanden en botten, beïnvloedt de activiteit hiervan de elektrodepotentiaal niet, en weerspiegelt het geregistreerde signaal specifiek de fluoride-activiteit. De lagere detectielimiet van 0,02 ppm komt overeen met de door de fabrikant gevalideerde minimale kwantificeerbare concentratie voor de Orion fluoride-selectieve elektrode. Deze limiet weerspiegelt de laagste fluorideconcentratie waarbij de elektrode een stabiele Nernstiaanse respons en een lineaire relatie met de kalibratiecurve behoudt. Omdat de detectielimiet wordt bepaald door de membraankenmerken van de elektrode en is gevalideerd door de fabrikant, was er voor dit protocol geen aanvullende experimentele bepaling nodig; wat betreft het bovenste detectiebereik merkten de auteurs echter op dat fluoridemassa's die ongeveer 38.000&#160;ng overschreden in een 50&#160;µL NaOH-val resulteerden in een niet-lineaire elektroderespons, wat aangeeft dat de kalibratiecurve niet langer betrouwbaar is bij zeer hoge fluoridelast. Deze niet-lineariteit is waarschijnlijk te wijten aan het overschrijden van de optimale ionsterkte en activiteitsrange voor de elektrode onder de gegeven experimentele omstandigheden, in plaats van een inherente bovengrens van de ISE zelf. Voor monsters waarvan wordt verwacht dat ze fluoridemassa's boven deze drempelwaarde bevatten, is het raadzaam om het volume van de NaOH-val te verhogen om metingen binnen het lineaire dynamische bereik van de elektrode te houden.
Deze overweging moet in acht worden genomen bij het toepassen van het protocol op monsters met een ongebruikelijk hoog fluoridegehalte. Omdat de diffusiestap het volledige monstervolume verbruikt, konden er geen dubbele metingen en spike-and-recovery-experimenten worden uitgevoerd op de biologische monsters. Om de analytische nauwkeurigheid en precisie te waarborgen, werden kwaliteitscontrolestandaarden (QC-standaarden) met bekende fluorideconcentraties opgenomen in elke meetserie. Deze QC-standaarden werden op identieke wijze verwerkt en gemeten als de experimentele monsters. Over alle runs heen lagen de gemeten fluorideconcentraties van de QC-standaarden consistent binnen 5% van hun verwachte waarden. Voor elke serie van 10–20 specimenmonsters werden twee onafhankelijke sets van 5–6 kalibratiemonsters parallel aan de specimenmonsters voorbereid, en er werd een kalibratiecurve geregistreerd voorafgaand aan elke meetsessie. Het kalibratiebereik werd voor elke run aangepast om de verwachte fluoridemassa's van de specimenmonsters te benaderen, wat afhankelijk was van het specimen-type, de massa van het materiaal dat aan de diffusieschaal was toegevoegd, en de behandelingsgroep en leeftijd van het dier. Voor serummetingen kwamen de kalibratiestandaarden overeen met fluorideconcentraties van ongeveer 0,06–1,20 ppm in het specimen. Voor metingen aan bot en tand kwamen de kalibratiestandaarden overeen met fluorideconcentraties van ongeveer 19–7.600 ppm in het specimen.
Dit protocol biedt een gevoelige en reproduceerbare methode voor het kwantificeren van de fluoride-ionmassa in serum, bot en tanden met behulp van hexamethyldisiloxaan-gefaciliteerde diffusie gevolgd door ISE-analyse. De methode brengt betrouwbaar fluoride in kaart dat is vrijgekomen uit diverse biologische matrices en maakt een kwantitatieve beoordeling mogelijk van fluoride-accumulatie na gecontroleerde blootstelling. Representatieve resultaten van adolescente en volwassen muizen tonen duidelijke leeftijd- en dosisafhankelijke verschillen in fluoride-depositie in verschillende weefsels, wat het nut van deze aanpak onderstreept voor het bestuderen van fluoride-metabolisme en toxicokinetiek in vivo.
Een belangrijk voordeel van dit protocol is het gebruik van diffusieschalen die de fluoride-vrijmakende reactie fysiek scheiden van de fluoride-vangende omgeving. Het met petrolatum afgesloten ontwerp minimaliseert atmosferische uitwisseling en zorgt voor een efficiële opvang van vrijgekomen fluoride-ionen door natriumhydroxidedruppels op het deksel. Met HMDS verzadigd zwavelzuur biedt een sterke en consistente drijvende kracht voor de vrijgave van fluoride uit gemineraliseerde weefsels, waaronder sterk gecalcificeerde structuren zoals botten en tanden. De daaropvolgende ISE-meting, gekalibreerd met diffusie-overeenkomstige standaarden, maakt een nauwkeurige kwantificering mogelijk over een breed dynamisch bereik. Een ander voordeel van deze aanpak is de mogelijkheid om fluoride in extreem kleine biologische monsters te kwantificeren. Gemineraliseerde weefsels van muizen, in het bijzonder de mandibulaire snijtanden, leveren slechts 3–5 mg as per tand op. Conventionele analytische methoden vereisen vaak grotere monstermassa's of een hoger fluoridegehalte om een betrouwbare detectie te bereiken. In tegenstelling hiermee concentreert het op diffusie gebaseerde ontwerp alle fluoride die uit het gehele specimen is vrijgekomen in een klein, gedefinieerd volume, waardoor nauwkeurige kwantificering mogelijk is, zelfs in minuscule monsters met een lage absolute fluoridemassa. Deze eigenschap is bijzonder waardevol voor studies met kleine dieren, beperkte weefselbeschikbaarheid of micro-gedissecteerde gemineraliseerde structuren.
Een primaire beperking van deze methode is de detectielimiet van de ISE die in deze studie is gebruikt (0,02 ppm). Serummonsters van fluoride-vrije controledieren vielen vaak onder deze drempelwaarde, waardoor kwantificering van extreem lage fluorideconcentraties niet mogelijk was. Wanneer sporenconcentraties nabij of onder de detectielimiet worden gemeten, kan een grotere massa of een groter volume van het monster in de diffusieschaal, indien beschikbaar, of het gebruik van alternatieve analytische technieken vereist zijn. Daarnaast vereist de methode een diffusie gedurende de nacht en een zorgvuldige hantering van corrosieve reagentia, wat de doorvoersnelheid in studies met een groot volume kan beperken. Hoewel ISE een gevoelige kwantificering van het totale fluoride biedt, kan het de ruimtelijke verdeling binnen weefsels niet beoordelen. Complementaire benaderingen, zoals scanning elektronenmicroscopie gekoppeld aan energie-dispersieve röntgenspectroscopie (SEM-EDX) of particle-induced gamma-ray emission (PIGE), kunnen worden geïntegreerd om de fluorideverdeling op micro- tot macroschaal te visualiseren en in kaart te brengen. Deze op beeldvorming gebaseerde modaliteiten maken de evaluatie van lokale fluoride-accumulatie in gemineraliseerde of zachte weefsels mogelijk, waardoor ze de ISE-metingen aanvullen en een uitgebreider assessment van het fluoridegehalte in het weefsel bieden.
Verschillende terugkerende technische factoren kunnen de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van de fluoride-diffusie en -meting in dit protocol beïnvloeden, en onze observaties benadrukken hoe de voorbereiding van de kalibratie, het afdichten van de diffusieschaal, de pH-controle, de prestaties van de elektrode en de monsterbehandeling gezamenlijk de datakwaliteit bepalen. Mogelijke oorzaken voor een niet-lineaire kalibratiecurve (R2 &#60; 0,99) of metingen van weefselmonsters buiten het verwachte bereik zijn rekenfouten bij het volume NaF-stamoplossing dat aan de diffusieschaal wordt toegevoegd of pipetteerfouten tijdens de bereiding van de kalibratiestandaarden. Aanbevolen actie: Bereid voor elke run ten minste twee onafhankelijke sets kalibratiemonsters voor, zodat er een reserveset beschikbaar is als één kalibratiecurve buiten het verwachte bereik valt. Een onvolledige afdichting van de diffusieschaal kan ook leiden tot fluorideverlies tijdens de diffusie, wat resulteert in kunstmatig lage metingen. Dit gebeurt doorgaans wanneer er onvoldoende vaseline op de rand van het deksel van de diffusieschaal is aangebracht. Aanbevolen actie: Breng een royale hoeveelheid vaseline aan rond de rand van het deksel van de diffusieschaal en druk stevig aan om een volledige afdichting te garanderen. Pipetteerfouten bij het toevoegen van de azijnzuuroplossing aan de NaOH-val kunnen de pH van het monster buiten het optimale bereik van pH 5,0 verschuiven, wat leidt tot een onnauwkeurig fluorideherstel. Aanbevolen actie: Controleer de pH van elk monster met pH-papier en gooi elk monster weg dat buiten pH 5 valt. Kalibratiemonsters kunnen ook buiten de geldige registratielimieten van de fluoride-selectieve elektrode vallen. Concentraties onder 0,02 ppm liggen onder de detectielimiet van de elektrode. Aanbevolen actie: Gebruik geen kalibratiemonsters die minder dan 0,02 ppm fluoride bevatten. Omgekeerd kunnen kalibratiemonsters met excessief hoge fluorideconcentraties de ionsterkte van de oplossing veranderen en niet-lineaire elektroderesponsen produceren. Aanbevolen actie: Bereid aan het begin van het project kalibratieoplossingen voor over een breed fluorideconcentratiebereik om het lineaire werkbereik van de specifieke gebruikte elektrode te bepalen. Als weefselmonsters dit lineaire bereik overschrijden, verlaag dan de weefselmassa of verhoog het volume van de NaOH-val en pas het volume azijnzuur dienovereenkomstig aan om pH 5 te handhaven. Moeite met het verkrijgen van lineaire kalibratiecurves in het bereik 0,02–1 ppm: Een veelvoorkomende oorzaak is veroudering van de elektrode. Oudere fluoride-selectieve elektroden verliezen hun gevoeligheid bij zeer lage fluorideconcentraties. Aanbevolen actie: Vervang de fluoride-selectieve elektrode. Onstabiele potentiometermetingen (signaaldrift of sprongen) treden gewoonlijk op wanneer het meetoppervlak van de elektrode niet volledig is ondergedompeld in de monsteroplossing. Aanbevolen actie: Laat de elektrode zakken zodat het meetoppervlak volledig door het vloeibare monster wordt bedekt.
Over het algemeen biedt dit protocol een robuuste, op kalibratie gebaseerde aanpak voor het kwantificeren van fluoride in diverse biologische matrices en is het uitermate geschikt voor studies naar fluorideblootstelling, weefseldepositie en toxicologische uitkomsten in muismodellen.

Fluoride is een natuurlijk voorkomend anion, en een optimaal fluoridegehalte is effectief bij het voorkomen van cariës1,2,3,4,5. In de Verenigde Staten (U.S.) is fluoridering van het gemeentelijk water op 0.7 ppm geïmplementeerd als volksgezondheidsstrategie om de incidentie van cariës te verminderen en de mondgezondheid te bevorderen6. Echter kan langdurige inname van overmatig fluoride meerdere weefsels nadelig beïnvloeden. Blootstelling aan hoge concentraties fluoride verstoort de glazuurvorming7,8,9, verandert de botvorming10 en tast de skeletintegriteit aan11.
Op cellulair niveau induceert blootstelling aan fluoride verschillende metabole verstoringen, waaronder oxidatieve stress12, stress van het endoplasmatisch reticulum13, epigenetische modificaties die de genexpressie veranderen14 en apoptose in ameloblasten15,16,17,18. Wereldwijd vormen verhoogde fluorideconcentraties in grondwater (&gt;1.5 ppm) een aanzienlijk gezondheidsrisico. Een recente predictieve modelstudie schatte dat ongeveer 180 miljoen mensen wereldwijd potentieel worden beïnvloed door overmatige blootstelling aan fluoride, waarbij de hoogste last voorkomt in Azië en Afrika1. Naast drinkwater vindt blootstelling aan fluoride ook plaats via voedingsmiddelen (bijv. zeevruchten; ~1.9 ppm), dranken (bijv. thee; 0.5–6 ppm19) en tandverzorgingsproducten zoals tandpasta20 (1.000–1.500 ppm).
Inzicht in fluoride-blootstelling, metabolisme en weefseldepositie is daarom essentieel voor het evalueren van zowel de therapeutische voordelen als de potentiële toxicologische gevolgen. Nauwkeurige kwantificering van fluoride in biologische monsters — waaronder urine, serum, bot en tanden — is een cruciaal onderdeel van dit werk. Meting is echter analytisch uitdagend vanwege het chemische gedrag van fluoride en de sterke affiniteit ervan voor calciumrijke matrices. Ongeveer 99% van het fluoride in het lichaam bevindt zich in gemineraliseerde weefsels zoals bot en tanden21. Om deze uitdagingen aan te pakken, zijn diverse analytische technieken ontwikkeld, waaronder ionselectieve elektrode (ISE) potentiometrie, ionchromatografie, colorimetrische assays, titrimetrische procedures en nucleaire of activatiegebaseerde methoden22. Hiervan is de door hexamethyldisiloxaan (HMDS) gefaciliteerde diffusietechniek, gecombineerd met fluoride-selectieve elektrodemeting, een van de meest betrouwbare en veelgebruikte benaderingen voor biologische matrices gebleken vanwege de gevoeligheid, reproduceerbaarheid en compatibiliteit met diverse monstertypes23,24,25,26,27,28,29.
Ondanks de beschikbaarheid van meerdere analytische methoden heeft elke benadering beperkingen die het gebruik in experimenteel of klinisch onderzoek kunnen belemmeren. Ionchromatografie biedt een hoge gevoeligheid en selectiviteit, maar vereist gespecialiseerde instrumentatie en uitgebreide monstervoorbereiding30,31. Colorimetrische assays, zoals de SPADNS-methode (natrium 2‑(parasulfophenylazo)‑1,8-dihydroxynaphthalen-3,6‑disulfonaat), zijn eenvoudig en goedkoop, maar zijn gevoelig voor interferentie door troebelheid en endogene chromoforen, wat hun betrouwbaarheid in complexe biologische monsters beperkt22,32,33. Titrimetrische methoden zijn kosteneffectief en ongecompliceerd, maar missen de gevoeligheid die nodig is voor de detectie van fluoride op spuurniveau in de meeste biologische monsters34. Nucleaire of activatiegebaseerde technieken bieden een uitzonderlijke gevoeligheid, maar vereisen toegang tot reactoren of accelerator-gebaseerde neutronenbronnen, waardoor ze onpraktisch zijn voor routinematig laboratoriumgebruik35. In contrast hiermee biedt HMDS-gefaciliteerde diffusie gevolgd door ISE-meting een praktische balans tussen gevoeligheid, kosten en toegankelijkheid, terwijl een volledige vrijgave van fluoride uit zowel zachte als gemineraliseerde weefsels wordt gegarandeerd. Dit is bijzonder voordelig voor studies met kleine dieren, waarbij de weefselbeschikbaarheid beperkt is en gemineraliseerde structuren, zoals snijtanden van muizen, slechts 3–5 mg as per tand opleveren.
Het vermogen van de diffusie-ISE-methode om al het vrijgekomen fluoride te concentreren in een klein, gedefinieerd volume maakt nauwkeurige kwantificering mogelijk, zelfs in extreem kleine monsters. Dit maakt de methode zeer geschikt voor toxicokinetische studies, dosis-responsexperimenten en onderzoeken naar de fluoride-metabolisme in verschillende ontwikkelingsstadia. Kleine knaagdieren, in het bijzonder C57BL/6J-muizen, zijn veelvuldig gebruikt als diermodellen voor het bestuderen van de effecten van fluoride7,9,12,29,36 .
In dit protocol passen de auteurs de HMDS-gefaciliteerde diffusietechniek toe, gevolgd door meting met een fluoride-selectieve elektrode, om fluoride te kwantificeren in serum, bot en tanden verzameld van muizen die zijn blootgesteld aan een hoge fluoridedosis (125 ppm) vergeleken met onbehandelde controles. De auteurs vergelijken verder de fluorideaccumulatie in adolescente (6 weken bij aanvang van de behandeling) en volwassen (18 weken bij aanvang van de behandeling) muizen om leeftijdsafhankelijke verschillen in fluoridemetabolisme en weefseldepositie te evalueren. De mandibulaire snijtanden werden gekozen als representatief tandweefsel omdat knaagersnijtanden continu doorbreken en rond de leeftijd van 7 weken een steady-state balans bereiken tussen doorbraak en occlusale slijtage. Dit continue groeipatroon biedt een consistente en toegankelijke gradiënt van glazuurontwikkeling, waardoor muisnijtanden een veelgebruikt en goed gevalideerd model zijn voor het onderzoek naar glazuurvorming en dentale fluorose.

<table><tbody><tr><td>Azijnzuur, glaciaal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Supelco, GR ACS</td><td>AX0073-6</td></tr><tr><td>Aluminakruisels</td><td>Advalue Technology</td><td>12 mm buitendiameter &amp;times; 25 mm H, AL-6212</td><td>AL-6212</td></tr><tr><td>Analytische balans</td><td>VWR</td><td>VWR 124B2, d = 0,1 mg</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>Kralenbeater</td><td>Referentiekader</td><td>BeadBug 6</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>Sproeinaald voor spuit</td><td>Amazon</td><td>Industriële stomp kop naald, 14 G &amp;times; 0,5 inch</td><td>X001TT8KX1</td></tr><tr><td>Koolstofdioxide</td><td>AirGas</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>Chemische zuurkast</td><td>Mott Manufacturing</td><td>Model 7421040</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>D(+)-sucrose</td><td>Thermo Scientific</td><td>99,7% voor biochemie</td><td>177142500</td></tr><tr><td>Elektrodevuloplossing</td><td>Thermo Scientific</td><td>Orion IonPlus vuloplossing</td><td>900061</td></tr><tr><td>Ethylalcoholoplossing</td><td>Koptec</td><td>140 Proof</td><td>2401</td></tr><tr><td>Vriezer, &amp;minus;80 &amp;deg;C</td><td>Thermo Scientific</td><td>Revco RDE-serie</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>Hittebestendige handschoenen</td><td>Fisher Scientific</td><td>Bel-Art Clavies biohazard-autoclaafhandschoenen</td><td>H13201</td></tr><tr><td>Hexamethyldisiloxaan (HMDS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>TCI H0091, &gt;98%</td><td>H0091</td></tr><tr><td>Waterstofperoxide</td><td>VWR</td><td>J.T. Baker, 30%</td><td>2204-01</td></tr><tr><td>Ion-selectieve elektrode</td><td>Thermo Scientific</td><td>Orion Fluoride ISE, dubbelkanaals</td><td>9609BNWP</td></tr><tr><td>Magnetische roerder</td><td>VWR</td><td>360-graden roerder</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>Microspatel</td><td>Amazon</td><td>Wascarvespatel #7A, roestvrij staal</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5427R</td><td>5404000131</td></tr><tr><td>Moffeloven</td><td>Thermo Scientific</td><td>Thermolyne kleine moffeloven voor op het aanrecht, 1,3 L, FB1315M</td><td>FB1315M</td></tr><tr><td>Oven</td><td>Boekel Scientific</td><td>Boekel RapidFISH</td><td>240200</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde-oplossing in PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>4% paraformaldehyde in PBS</td><td>J19943-K2</td></tr><tr><td>Petrischaal</td><td>VWR</td><td>60 &amp;times; 15 mm, Onbehandeld</td><td>25384-092</td></tr><tr><td>Petrolatum</td><td>Thermo Scientific</td><td>Petrolatum, wit, zuiver</td><td>417090010</td></tr><tr><td>pH-indicatorpapier</td><td>Fisher Scientific</td><td>pH-Fix 4,5&amp;ndash;10.0</td><td>92120.3</td></tr><tr><td>Porseleinen schaal</td><td>Fisher Scientific</td><td>Fisherbrand smeltkroes, 5 mL, 20 mm hoogte, hoge vorm</td><td>FB-965-B</td></tr><tr><td>Potentiometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>Orion Dual Star pH/ISE-meter</td><td>2115102</td></tr><tr><td>Statief met klem</td><td>VWR</td><td>Ringklem, 15 cm</td><td>470104-526</td></tr><tr><td>Knaagdierdieet</td><td>Bio-Serv</td><td>F1515, AIN-76A, &amp;frac12; Pellets</td><td>F1515</td></tr><tr><td>Scherenkrik</td><td>Amazon</td><td>Laboratorium schaarlift</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>Scheidingskolf</td><td>Fisher Scientific</td><td>Eisco, borosilicaatglas, 2 L</td><td>S89285</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>Gecertificeerd ACS, kristallijn</td><td>S271-1</td></tr><tr><td>Natriumfluoride</td><td>Fisher Scientific</td><td>Gecertificeerd ACS, poeder</td><td>S299-100</td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>Witte pellets</td><td>BP359-500</td></tr><tr><td>Roestvrijstalen kraaltjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>Scientific Industries, 5 mm, 100 stuks</td><td>SI-CS05</td></tr><tr><td>Zwavelzuur</td><td>Fisher Scientific</td><td>ACS-kwaliteit</td><td>A300-500</td></tr><tr><td>TISAB II</td><td>Thermo Scientific</td><td>Orion IonPlus Applicatieoplossing</td><td>940909</td></tr><tr><td>Vacuümexsikkaator</td><td>Fisher Scientific</td><td>Bel-Art Space Saver vacuümdesiccator, 10 inch</td><td>F42010-0000</td></tr><tr><td>Vacuümfilter</td><td>Fisher Scientific</td><td>Flow Bottle-Top Filter, PES, 90 mm, 0.2 &amp;micro;m</td><td>597-4520</td></tr><tr><td>Variabele Rocker</td><td>MidSci</td><td>LabDoctor / Benchmark Scientific</td><td>&amp;mdash;</td></tr></tbody></table>

kwantificering van fluoride in serum, bot en tanden in een muismodel met behulp van hexamethyldisiloxaan-gefaciliteerde diffusie en metingen met ionselectieve elektroden

Quantification of Fluoride in Serum, Bone, and Teeth in a Murine Model Using Hexamethyldisiloxane-Facilitated Diffusion and Ion-Selective Electrode Measurements

Het kwantificeren van fluoridegehalten in biologische weefsels is essentieel voor het begrijpen van fluorideblootstelling, metabolisme en toxiciteit. Dit protocol beschrijft een gevoelige en reproduceerbare methode voor het meten van de fluoride-ionmassa in serum, botten en tanden met behulp van door hexamethyldisiloxaan (HMDS) gefaciliteerde diffusie, gevolgd door analyse met een ion-selectieve elektrode (ISE). Biologische monsters, waaronder serum, dijbeenderen en mandibulaire snijtanden, worden verzameld van muizen die zijn blootgesteld aan gecontroleerde fluoridebehandelingen. Bot- en tandmonsters worden geasst, gemalen en gehydrateerd, terwijl serum direct wordt verwerkt. Elk monster wordt overgebracht naar een diffusieschaal met ultrapuur water en afgesloten met een met petrolatum bekleed deksel voorzien van natriumhydroxidedruppels die dienen als fluoridetraps. Injectie van HMDS-verzadigd zwavelzuur initieert de afgifte en diffusie van fluoride, waardoor de vrijgekomen fluoride-ionen kwantitatief in de traps worden opgevangen. Na een nachtelijke diffusie worden de druppels uit de fluoridetraps samengevoegd tot één enkel monster, aangezuurd tot het vereiste pH-bereik en aangepast naar een gedefinieerd volume voor ISE-meting. Kalibratie-diffusieschalen, geprepareerd met bekende fluoridemassa's, genereren een standaardcurve voor kwantificering, en kwaliteitscontrolemonsters verifiëren de stabiliteit van de elektrode. Representatieve resultaten van adolescente en volwassen muizen die zijn blootgesteld aan 0 of 125 ppm fluoride tonen het vermogen van de methode aan om leeftijds- en dosisafhankelijke verschillen in fluoridegehaltes in serum, botten en tanden te detecteren. Dit protocol biedt een robuuste, op kalibratie gebaseerde benadering voor het kwantificeren van fluoride in diverse biologische matrices en is uitermate geschikt voor studies naar fluorideblootstelling, weefseldepositie en toxicologische uitkomsten in muismodellen. Een belangrijk voordeel van deze methode is het vermogen om fluoride nauwkeurig te kwantificeren in extreem kleine monsters, waaronder de 3–5 mg as verkregen uit individuele muissnijtanden, omdat het diffusieproces al het vrijgekomen fluoride concentreert in een meetbaar monstervolume van minder dan 100&#160;µL.

Om de toepassing van dit protocol voor het meten van fluoride (F-)concentraties in biologisch materiaal aan te tonen, werden monsters gegenereerd uit serum, bot en mandibulaire snijtanden, verzameld van muizen die waren blootgesteld aan gecontroleerde fluoridebehandelingen. Mannelijke C57BL/6J-muizen werden verdeeld over twee leeftijdscategorieën, adolescent (6 weken) en volwassen (18 weken), en kregen gedurende een blootstellingsperiode van 6 weken ofwel fluoridevrij gedeïoniseerd water (0 ppm F⁻) of drinkwater aangevuld met natriumfluoride (125 ppm F⁻). Per leeftijd en behandelconditie waren vijf dieren betrokken. Aan het einde van de blootstellingsperiode werden serum, femurs en mandibulaire snijtanden geoogst, waarna de monsters werden geprepareerd en geanalyseerd volgens het protocol. De representatieve fluorideconcentraties gemeten in serum, bot en tanden zijn hieronder samengevat.
<img alt="Figuur 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71488/71488fig4.jpg" /> 
Figuur 4Fluorideconcentraties gemeten in serum, femurbeen en mandibulaire snijtanden. Mannelijke C57BL/6J-muizen werden toegewezen aan twee leeftijdscategorieën, adolescent (6 weken, open staaf) en volwassen (18 weken, gevulde staaf), en kregen ofwel fluoridevrij gedeïoniseerd water (0 ppm F&#8315;) of drinkwater aangevuld met natriumfluoride (125 ppm F&#8315;) gedurende een blootstellingsperiode van 6 weken. Aan het einde van de blootstellingsperiode werden de fluoridegehaltes gemeten in (A) serum, (B) femur (dijbeen) en (C) mandibulaire snijtanden van dezelfde behandelingsgroepen. Serumwaarden onder de detectielimiet (&#60;0,02 ppm) werden uitgezet voor visualisatie, maar uitgesloten van de statistische analyse. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelden &#177; SD. Vergelijkingen tussen de adolescente en de volwassen groepen werden uitgevoerd met behulp van een Mann-Whitney U-toets met Bonferroni-Dunn-correctie voor meervoudige vergelijkingen. *p &#60; 0.05, **p &#60; 0,01 (N = 5/groep). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71488/71488fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Fluorideconcentraties in serum 
In zowel de adolescente als de volwassen groepen die werden behandeld met 0 ppm fluoride, lagen de serumfluorideconcentraties onder de detectielimiet van de ion-selectieve elektrode (&lt;0,02 ppm). In de groepen die werden behandeld met 125 ppm steeg het serumfluoride naar 0,3 ± 0,2 ppm in de adolescente groep en naar 0,7 ± 0,2 ppm in de volwassen groep (p = 0,06). De vergelijking tussen de adolescente en de volwassen groep die met 125 ppm werden behandeld, werd uitgevoerd met een Mann–Whitney U-test met Bonferroni–Dunn-correctie voor meervoudige vergelijkingen. *p &lt; 0,05, **p &lt; 0,01 (N = 5/groep). De groepen die met 0 ppm werden behandeld, werden uitgesloten van de statistische analyse. (Afbeelding 4A, Tabel 1).
Fluorideconcentraties in het dijbeen 
In de 0‑ppm behandelingsgroepen waren de fluorideconcentraties in het dijbeen significant lager bij adolescenten (292 ± 39 ppm) vergeleken met volwassen dieren (896 ± 55 ppm) (p &#60; 0,01). In contrast waren in de 125‑ppm groepen de fluorideconcentraties bij adolescenten (4.108 ± 482 ppm) significant hoger dan bij volwassen dieren (2.966 ± 612 ppm) (p = 0,04). Vergelijkingen tussen adolescente en volwassen groepen werden uitgevoerd met een Mann–Whitney U-test met Bonferroni–Dunn correctie voor meervoudige vergelijkingen. *p &#60; 0,05, **p &#60; 0,01 (N = 5/groep). (Figuur 4B, Tabel 1). Figuur 5A toont de fold‑change in fluoride in het dijbeen tussen de 0‑ppm en 125‑ppm behandelingen voor elke leeftijdsgroep. Adolescenten vertoonden een 14-voudige toename van de fluorideniveaus bij 125 ppm, terwijl volwassen muizen een 3-voudige toename vertoonden.
Fluorideconcentraties in de mandibulaire snijtanden 
In de 0 ppm-groepen waren de fluorideconcentraties in de mandibulaire snijtanden significant lager bij adolescenten (35 ± 4 ppm) vergeleken met volwassen dieren (123 ± 23 ppm) (p = 0,03). In de 125 ppm-behandelgroepen stegen de fluorideconcentraties in de snijtanden naar 5641 ± 955 ppm bij adolescenten en 4392 ± 1694 ppm bij volwassen dieren. Vergelijkingen tussen de adolescente en volwassen groepen werden uitgevoerd met een Mann–Whitney U-test met Bonferroni–Dunn-correctie voor meervoudige vergelijkingen. *p &#60; 0,05, **p &#60; 0,01 (N = 5/groep). (Figuur 4C, Tabel 1). Hoewel de absolute fluorideconcentraties bij 125 ppm niet significant verschilden tussen de leeftijdsgroepen, was de fold-change van 0 ppm naar 125 ppm significant groter bij adolescente muizen (161-voudige toename) dan bij volwassen muizen (36-voudige toename) (Figuur 5B).
<img alt="Figuur 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71488/71488fig5.jpg" /> 
Figuur 5: Adolescenten vertonen een grotere relatieve toename in fluorideaccumulatie in het bot en de incisiven dan volwassen muizen. Relatieve verandering in fluorideconcentraties bij een behandeling van 0 ppm naar 125 ppm fluoride in adolescente (open staaf) en volwassen (gevulde staaf) muizen. (A) Femuraal bot en (B) mandibulaire incisief uit dezelfde behandelingsgroepen. Gegevens zijn uitgedrukt als gemiddelden ± SD. Vergelijkingen tussen de adolescente en volwassen groepen zijn uitgevoerd met een ongepaaide t-toets. * p &#60; 0,05, (N = 5/groep). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71488/71488fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Monster</td>
			<td colspan="4" >Serum</td>
			<td colspan="4" >Femur</td>
			<td colspan="4" >Mandibulaire snijtand</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Leeftijdscategorie</td>
			<td colspan="2" >Adolescent</td>
			<td colspan="2" >Volwassen</td>
			<td colspan="2" >Adolescent</td>
			<td colspan="2" >Volwassen</td>
			<td colspan="2" >Adolescent</td>
			<td colspan="2" >Volwassen</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Behandelingsgroep</td>
			<td >0 ppm</td>
			<td >125 ppm</td>
			<td >0 ppm</td>
			<td >125 ppm</td>
			<td >0 ppm</td>
			<td >125 ppm&#160;</td>
			<td >0 ppm</td>
			<td >125 ppm&#160;</td>
			<td >0 ppm</td>
			<td >125 ppm</td>
			<td >0 ppm</td>
			<td >125 ppm</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.2</td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.8</td>
			<td>324</td>
			<td>4576</td>
			<td>933</td>
			<td>3081</td>
			<td>37</td>
			<td>4824</td>
			<td>161</td>
			<td>3229</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.1</td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.8</td>
			<td>229</td>
			<td>3778</td>
			<td>924</td>
			<td>3326</td>
			<td>39</td>
			<td>5451</td>
			<td>127</td>
			<td>2654</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.7</td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>1.0</td>
			<td>300</td>
			<td>4683</td>
			<td>877</td>
			<td>3713</td>
			<td>31</td>
			<td>5544</td>
			<td>112</td>
			<td>6997</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.4</td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.5</td>
			<td>323</td>
			<td>3832</td>
			<td>807</td>
			<td>2519</td>
			<td>35</td>
			<td>5114</td>
			<td>103</td>
			<td>4169</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.3</td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.5</td>
			<td>283</td>
			<td>3669</td>
			<td>937</td>
			<td>2192</td>
			<td>N/A</td>
			<td>7271</td>
			<td>111</td>
			<td>4909</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Gemiddelde</td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.3</td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.7</td>
			<td>292</td>
			<td>4108</td>
			<td>896</td>
			<td>2966</td>
			<td>35</td>
			<td>5641</td>
			<td>123</td>
			<td>4392</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >SD</td>
			<td>NA</td>
			<td>0.2</td>
			<td>NA</td>
			<td>0.2</td>
			<td>39</td>
			<td>482</td>
			<td>55</td>
			<td>612</td>
			<td>3</td>
			<td>955</td>
			<td>23</td>
			<td>1694</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabel 1: Individuele fluoride-metingen in serum, dijbeen en mandibulaire snijtanden. Tabel 1 vermeldt de individuele fluorideconcentraties (ppm F⁻) gemeten in serum, dijbeen en monsters van mandibulaire snijtanden van adolescente en volwassen muizen die werden blootgesteld aan respectievelijk 0 ppm of 125 ppm fluoride. Voor elk weefseltype worden de gegevens gepresenteerd in kolommen die overeenkomen met de vier behandelingsgroepen: adolescent 0 ppm, adolescent 125 ppm, volwassen 0 ppm en volwassen 125 ppm. Elke kolom bevat de vijf individueel geregistreerde waarden (N = 5), gevolgd door het berekende gemiddelde en de standaarddeviatie (SD). In de adolescente 0 ppm serumgroep lagen alle geregistreerde waarden onder de detectielimiet van de ion-selectieve elektrode (&lt;0,02 ppm). De tabel biedt de ruwe numerieke gegevens die ten grondslag liggen aan de samenvattende waarden en statistische vergelijkingen getoond in Figuur 4.

Dit protocol beschrijft de bereiding van diffusieschalen gefaciliteerd door hexamethyldisiloxaan (HMDS), gevolgd door metingen met ion-selectieve elektroden om de massa aan fluoride-ionen in het serum, bot en gebit van muizen te kwantificeren. De methode biedt een gevoelige, op kalibratie gebaseerde benadering voor het evalueren van fluoride-accumulatie in biologische monsters.

Kwantificering van fluoride in serum, bot en tanden in een muismodel met behulp van hexamethyldisiloxaan-gefaciliteerde diffusie en metingen met ionselectieve elektroden

Het kwantificeren van fluoridegehaltes in biologische weefsels is essentieel voor het begrijpen van fluorideblootstelling, metabolisme en toxiciteit. Dit protocol beschrijft een ...

Ons onderzoek richt zich op het kwantificeren van de fluorideconcentratie in het serum, botten en tanden van fluoride-behandelde muizen. Bestaande methoden vereisen grote monsters of dure instrumenten. Dit protocol meet fluoride in microliter- of milligrammonsters.Begin met het verwijderen van de pootbeenderen van adolescente en volwassen C57BL/6J-muizen die drinkwater kregen dat ofwel was aangevuld met natriumfluoride of fluoridevrij was. Breng het bot na het drogen over in een aluminiumoxidekroes en as deze vervolgens in een muffeloven bij 600 °C gedurende zes uur, met een opwarmingssnelheid van 150 °C per uur.Plaats een onbehandelde Petrischaal van 60 bij 15 millimeter op een schoon oppervlak. Smelt met een verhitte injectienaald van 18 gauge een klein gaatje in het deksel van de Petrischaal. Breng vervolgens met een spuit van 10 milliliter, voorzien van een stompe naald van 14 gauge, een continue afsluiting van petrolatum aan op de binnenrand van het deksel van de Petrischaal. Maal de geasde botten in de microcentrifugebuisjes van 1,5 milliliter met een microspatel tot een fijn poeder en verwerk de gepulveriseerde botas onmiddellijk. Voer de met botas verontreinigde verbruiksartikelen af via de institutionele chemische afvalstroom. Breng de gemalen botas over in een klein porseleinen schaaltje om de statische lading te minimaliseren en verspreiding van het poeder te voorkomen. Plaats daarna de lege bodem van de Petrischaal op een analytische balans met een afleesbaarheid van ten minste 0,1 milligram. Voeg met een microspatel ongeveer 5 milligram van de botas toe en noteer het exacte gewicht. Bedek de gewogen as onmiddellijk met 3 milliliter ultrapuur water.Voeg 50 microliter 0,05 normaal natriumhydroxide, in drie druppels, toe aan het binnenoppervlak van het deksel van de Petri-schaal, weg van de rand, om een fluorideval te vormen. Keer het deksel van de Petri-schaal om zonder de druppels natriumhydroxide te verstoren. Sluit het deksel stevig af op de bodem van de Petri-schaal met petrolatum. Bereid een drie normale HMDS-verzadigde zwavelzuuroplossing door gelijke volumes van de zes normale HMDS-verzadigde zwavelzuuroplossing en ultrapuur water te mengen. Laad onmiddellijk 3 milliliter van de bereide oplossing in een spuit van 10 milliliter die is voorzien van een 20-gauge naald. Injecteer de oplossing door het gat in het deksel in het water op de bodem van de diffusieschaal. Trek de naald voorzichtig terug zonder zuur op het binnenoppervlak van het deksel te spatten. Sluit het injectiegat snel en volledig af met een druppel petrolatum. Plaats de diffusieschalen op een variabele rocker die is ingesteld op een lage snelheid en incubeer dit gedurende de nacht bij kamertemperatuur.Voordat u met de metingen begint, plaatst u de gevulde ion-selectieve elektrode in de houder en sluit u deze aan op de potentiometer. Plaats een onbehandelde Petrischaal op een schaarlift onder het detectieoppervlak van de elektrode, waarbij u erop let dat het detectieoppervlak parallel loopt aan de bodem van de schaal. Verhoog de tafel van de schaarlift totdat de Petrischaal de elektrode bijna raakt. Verwijder na de incubatieperiode de diffusieschaal van de rocker. Til het deksel voorzichtig op door de petrolatumafdichting te verbreken. Keer het deksel vervolgens om op een vlak oppervlak zonder de drie fluoride-trapdruppels te verstoren. Gebruik daarna een P20-pipet om 15 tot 20 µL 0,2 normaal azijnzuur toe te voegen aan een van de fluoride-trapdruppels en voeg alle drie de druppels samen tot één druppel zonder de pipetpunt te vervangen. Houd het gecombineerde monster op het omgekeerde deksel. Stel een P100-pipet in op 75 µL. Zuig het volledige volume van de fluoride-trap op zonder lucht binnen te laten en stel het monstervolume bij tot precies 75 µL met ultrapuur water. Ga onmiddellijk over tot de meting. Breng het monster aan tussen het detectieoppervlak van de fluoride-selectieve elektrode en de Petrischaal. Zorg ervoor dat het volledige detectieoppervlak is ondergedompeld in de vloeistof zonder de Petrischaal te raken. Laat de aflezing stabiliseren en noteer vervolgens het elektrodepotentiaal in millivolt vanaf het display van de potentiometer.Bij muizen die fluoridevrij drinkwater kregen, was de kortstondige fluorideconcentratie significant lager bij de adolescenten dan bij de volwassen muizen. Daarentegen keerde blootstelling aan 125 parts per million fluoride dit patroon om, met significant hogere fluorideconcentraties in het dijbeen bij de adolescenten dan bij de volwassen muizen. Na blootstelling aan fluoride vertoonden de adolescente muizen een 14-voudige toename van de fluorideconcentratie in het dijbeen, terwijl de volwassen muizen een kleinere, drievoudige toename vertoonden.Dit protocol meet nauwkeurig fluorideconcentraties in serum en gemineraliseerde weefsels bij zeer kleine monstervolumes. Het is essentieel dat de nauwkeurig gewogen as volledig wordt overgebracht naar de diffusieschaal, aangezien elk verlies de resultaten beïnvloedt. We hopen dat toekomstige studies deze aanpak zullen gebruiken om te ontrafelen hoe fluorideaccumulatie de weefselgezondheid, het ziekterisico en de veroudering beïnvloedt.

quantification-fluoride-serum-bone-teeth-murine-model-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een methode om de verdeling van beenmerg hematopoietische stamcellen in flowcytometrie en efficiënt isoleren sterk gezuiverde hematopoietische stamcellen (HSC) analyse beschreven. De isolatie procedure is in hoofdzaak gebaseerd op magnetische verrijking van c-Kit + cellen en cel sortering tot HSCs voor cellulaire en moleculaire studies te zuiveren.

Fenotypische analyse en isolatie van Murine hematopoëtische stamcellen en Lineage-geëngageerde voorouders

We beschrijven hier een techniek die nu standaard wordt gebruikt om stabiel gebonden ribosoom ontluikende keten complexen (RNC) te isoleren. Deze techniek maakt gebruik van de ontdekking dat een 17 aminozuur lange SecM "arrestatie sequentie" kan vertaling rek halt toe te roepen in een prokaryotische...

Met behulp van SecM Arrestatie sequentie als een Tool om Ribosoom Bound Polypeptiden Isoleer

Hier beschreven is een snelle en efficiënte procedure voor de functionele reconstitutie van gezuiverde wildtype en mutante CFTR-eiwit dat activiteit behoudt deze chloride kanaal, die defect in Cystic Fibrosis. Jodide efflux uit opgelost proteoliposomen gemedieerd door CFTR maakt studies van het kanaal en de effecten van kleine moleculen.

Functionele Het oplossen en Channel activiteit Metingen van gezuiverde wildtype en mutante CFTR eiwit

Transporters in celmembranen maken differentiële segregatie van ionen over celmembranen of cellagen mogelijk en spelen een cruciale rol tijdens weefselfysiologie, herstel en pathologie. We beschrijven de ion-selectieve zelfrefererende micro-elektrode die de meting van specifieke ionfluxen bij enkele cellen en weefsels in vivo mogelijk maakt.

Meting van de extracellulaire Ion Flux gebruik van de Ion-selectieve Zelf referencing micro-elektrode Techniek

Kernmembraaneiwitten spelen een centrale rol in veel fundamentele biologische processen en zijn betrokken geweest bij een verscheidenheid aan menselijke ziekten. Dit protocol beschrijft een nieuw Cre/Lox-gebaseerd muismodel dat de ruimtelijk-tijdelijke controle van LINC-complexen-verstoring mogelijk maakt.

Validatie van een muismodel voor LINC Complexen verstoren in een cel-specifieke manier

Immunohistochemmie is een krachtige laboratoriumtechniek voor het evalueren van eiwitlokalisatie en -expressie in weefsels. Huidige semi-automatische methoden voor kwantificering introduceren subjectiviteit en leiden vaak tot onherhaalbare resultaten. Hier beschrijven we methoden voor multiplexte immunohistochemmie en objectieve kwantificering van eiwitexpressie en co-lokalisatie met behulp van multispectrale beeldvorming.

Kwantificering van eiwitexpressie en Co-localisatie behulp multiplexverzending Immuno-histochemische kleuring en multispectrale

Verschillende niveaus en patronen van vloeistofschuifspanning zijn bekend om hun modulatie van endothèle genexpressie, fenotype en gevoeligheid voor ziekten. We bespreken de samenstelling en het gebruik van'schuifringen': een model dat unidirectionele, periodieke schuurspanningspatronen produceert. Schuifringen zijn eenvoudig te assembleren, economisch en kunnen hoge celopbrengsten produceren.

De Algemene Vergadering en de toepassing van &#39;Shear Rings&#39;: A Novel endotheliale Model voor Orbital, Unidirectionele en Periodieke Fluid Flow en Shear Stress

Hier gedemonstreerd zijn protocollen voor het isoleren van (1) vers intact cerebrale endothelial "buizen" en (2) gelijktijdige metingen van endothelial calcium en membraanpotentiaal tijdens endotheel afkomstige hyperpolarisatie. Verder, deze methoden toestaan voor farmacologische tuning van endothelial cel calcium en elektrische signalering als individuele of interactieve experimentele variabelen.

Gelijktijdige metingen van intracellulair Calcium en membraanpotentiaal in vers geïsoleerd en Intact muis cerebrale endotheel

Hier beschreven is een vereenvoudigde standaard werkings procedure voor microbiome profilering met behulp van 16S rRNA metagenomic sequencing en analyse met behulp van vrij beschikbare instrumenten. Dit protocol zal onderzoekers die nieuw zijn in het microbiome veld en degenen die updates vereisen over methoden om bacteriële profilering bij een hogere resolutie te bereiken helpen.

Microbiota-analyse met behulp van twee-stap PCR en de volgende generatie 16S rRNA Gensequencing

Hier karakteriseren we cellulaire proteotoxische stressreacties in de nematode C. elegans door het meten van de activering van fluorescerende transcriptieverslaggevers en assaying gevoeligheid voor fysiologische stress.

Metingen van fysiologische stressreacties in C. Elegans

Leer fluoride kwantificeren in serum, bot en tanden van muizen met hexamethyldisiloxaan-gefaciliteerde diffusie en ionselectieve elektroden. Deze gevoelige methode detecteert fluoride in zeer kleine monsters voor toxicologisch onderzoek.

Kwantificering van fluoride in serum, bot en tanden in een muismodel met behulp van hexamethyldisiloxaan-gefaciliteerde diffusie en metingen met ionselectieve elektroden (Video) | JoVE Journal

Kwantificering van fluoride in serum, bot en tanden in een muismodel met behulp van hexamethyldisiloxaan-gefaciliteerde diffusie en metingen met ionselectieve elektroden

Meer video's verkennen