Mapping Microglial Parameters Software (MMPS): Een open-source, gebruiksvriendelijke tool voor kwantitatieve microglia-morfologieanalyse

Het in kaart brengen van microgliale parametersoftware, of MMPS, stelt ons in staat te bestuderen hoe ferroptose microgliale subpopulaties verandert na een ischemische beroerte. MMPS pakt belangrijke knelpunten aan binnen het microgliale analyseveld en omzeilt omslachtige softwarevereisten en vereiste programmeerkennis. Om te beginnen opent u de GitHub-repository op de computer en downloadt u de Mapping Microglial Parameters Software of het losse MMPS-pakket.

In de downloadmap dubbelklik je om de archieftool te starten en automatisch de gecomprimeerde map uit te pakken. Dubbelklik op het geëxplueerde MMPS-applicatiepictogram om te verifiëren en het MMPS-pakket te openen. Klik op de optie om de afbeeldingsmap te selecteren en navigeer door de map van de computer om de projectbestanden te vinden.

Geef maptoegangsrechten en kies de afbeeldingsopslagmap. Klik vervolgens op selecteer outputmap en selecteer vervolgens de outputmap. Selecteer de afbeelding die verwerkt moet worden en kies vervolgens afbeeldingslabeling.

Wijs dieridentificaties en behandelgroepen toe aan de afbeelding en sla de invoer op. Om de pixelgrootte van de afbeelding te berekenen, selecteer je kalibreren in de schaalbalk. Selecteer het begin- en eindpunt van de schaalbalk, voer de bekende schaalbalk afstand in micrometers in en klik op toepassen.

Selecteer het fluorescentiekanaal met het microgliale signaal. Selecteer afbeeldingen voor verwerking door het vakje naast elke afbeeldingsnaam aan te vinken en ze afzonderlijk te verwerken als de achtergrondfluorescentie per afbeelding verschilt. Bekijk de tabbladen origineel, preview, verwerkt en maskeren om beeldverwerkingsfasen te vergelijken.

Selecteer de huidige afbeelding te bekijken om extra verwerkingsinstellingen aan te passen. Voor achtergrondaftrekking stel je de waarde van de rolling ball in tussen vijf en 150 pixels. Om verlichtingsartefacten te verminderen, gebruik je een denoisingswaarde van drie en stel je de scherpingswaarden tussen één en twee om de randdefinitie te verbeteren.

Na optimalisatie van de beeldverwerkingsinstellingen klik je op de geselecteerde beelden verwerken. Selecteer vervolgens 'pick somas', alle afbeeldingen. Klik op toon kleur C voor RGB composietweergave.

Selecteer kanalen en selecteer vervolgens ongebruikte kanalen als het beeld vervormd van kleur lijkt. Klik op de weergave-instellingen om de kanaalhelderheid in de RGB-weergave aan te passen. Selecteer microgliasoma's die DAPI en geïoniseerd calciumbindingsadaptermolecuul één tonen, of IBA1-colokalisatie.

Verwijder verkeerd geselecteerde soma met de backspace- of delete-toets. Druk enter of return om naar de volgende afbeelding te gaan. Selecteer alle soma's nadat de keuze van de soma is voltooid.

Omlijn de soma perimeter van elke geselecteerde microgliacel met minstens acht omlijningspunten, exclusief de cellulaire processen. Verwijder verkeerd geplaatste omtrekpunten met het ongedaan maken van het laatste punt, verwijderen of backspace. Druk op enter, return, dubbelklik of rechtsklik om elke soma outline af te ronden.

Klik op 'generate all masks' na voltooiing van de SOMA-outline. In maskergeneratie-instellingen stel je de minimale intensiteit aan om achtergrondpixels te verminderen en een balans te houden tussen achtergrondonderdrukking en tak preserve. Selecteer QA voor alle maskers om te beginnen met kwaliteitscontrole van maskers, en bekijk alle gepresenteerde maskers van grootste tot kleinste gebieden.

Vergelijk elk masker met de bijbehorende microglia met behulp van de bewerkte en maskertabbladen. Om maskers te accepteren, gebruik je de sneltoets A-toetsenbord. Om maskers te weigeren, gebruik je de sneltoets van R.

Om een acceptatie of afwijzing ongedaan te maken, druk je op B. Gebruik de pijltjestoetsen om door de afmetingen van maskers te navigeren. Kies het grootste acceptabele masker dat microgliale vertakkingen nauwkeurig vastlegt zonder naburige cellen, overmatige achtergrond, beeldranden of schaalbalken toe te voegen. Als de meeste onnauwkeurig zijn, gebruik dan de optie 'alle maskers verwijderen' om de maskers met een andere drempelwaarde te regenereren.

Selecteer vervolgens eenvoudige kenmerken berekenen om verschillende parameters voor geaccepteerde maskers te berekenen, en klik dan op oké. Voor aanvullende analyse, download fractalanalysisimagej. Py, Sholl.

py, en skeletonanalysisimagej. PY-plugins. Voor fractale en rompanalyses open en voer fractalanalysisimagej uit.

py als een Fiji-plugin. Voer dan de locatie van de uitvoermap in. Voer de pixelgrootte in en kies de optie voor alleen het grootste masker om het grootste geaccepteerde masker per cel te analyseren.

Voor sholl-analyse, open sholl. py als een Fiji-plugin. Voer de locatie van de uitvoerdirectory, gewenste pixelgrootte, stapgrootte in.

Selecteer gebruik de soma-radius als startstraal, of voer een vaste soma-radius in als MMPS-afgeleide soma-radius niet worden gebruikt. Open skeletonanalyseafbeeldingj. py als een Fiji-plugin voor skeletanalyse.

Blader door en voer de paden in voor de masks-directory, outputmap en pixelgrootte wanneer daarom wordt gevraagd. Na afloop exporteer je alle door plugins gegenereerde resultaten als komma-gescheiden waarden bestanden naar de specifieke uitvoermappen. Validatiestudie van MMPS met behulp van een lipopolysaccharide of door LPS geïnduceerd knaagdierneuro-ontstekingsmodel toonde aan dat LPS-toediening significant de gemiddelde centroideafstand en celomtrek verminderde vergeleken met met voertuigbehandelde controles.

Er werden geen significante verschillen waargenomen in mondkapoppervlak, rondheid of excentriciteit tussen behandelgroepen. Het soma-gebied was significant vergroot bij met LPS behandelde dieren vergeleken met voertuigcontroles die consistent zijn met activatie-geassocieerde morfologische remodellering van gliale cellen. Verder stroomafwaarts toonden geavanceerde morfologische analyses slechts een zwakke correlatie aan tussen de rondheid en omtrek van microglia bij met voertuigen behandelde ratten, en een sterke correlatie bij met LPS behandelde ratten, wat wijst op een verband tussen verhoogde microgliale activatie en verminderde rondheid en omtrek.

Daarnaast vertoonde het maskergebied sterke positieve correlaties met de gemiddelde centroideafstand in zowel de door het voertuig behandelde als de LPS-behandelde groepen, wat consistent is met veranderingen in vertakking die verband houden met microgliale activatie. Dit protocol stelt onderzoekers in staat om ingewikkelde microgliale vertakkingen, morfologische homogeniteit en structurele complexiteit te bestuderen. Het verkrijgen van immunofluorescentiebeelden met hoge resolutie is cruciaal voor het nauwkeurig gebruik van MMPS.

Toekomstige studies kunnen MMPS gebruiken om te onderzoeken hoe ferroptotische remmers de microgliale morfologie veranderen na verschillende aandoeningen van het zenuwstelsel zoals beroertes.