Een UV-gebaseerde ChIRP-methode voor de verifieerbare identificatie van eiwitten die direct interageren met LncRNA: van gekweekte cellen tot muistestikels

Ons onderzoek heeft cPDiRT ontwikkeld, een UV-crosslinkingmethode om interacties tussen RNA en eiwitten direct in kaart te brengen in zowel gekweekte cellen als in natuurlijk weefsel, zoals de testes, en om de moleculaire mechanismen van TUG1 bij de spermatogenese te ontrafelen. Dit protocol maakt het mogelijk om interacties tussen RNA en eiwitten direct in kaart te brengen in een breder scala aan systemen, van gekweekte cellen tot intact natuurlijk weefsel. Begin met het drie keer wassen van de GC2-cellen met PBS om resten van het kweekmedium te verwijderen.

Voeg vervolgens drie milliliter PBS toe aan de schaal en verdeel dit gelijkmatig vóór het crosslinken. Bestraal de cellen in een ultraviolette crosslinker van 254 nanometer met een dosis van 4.000 millijoules per vierkante centimeter. Verzamel de cellen in PBS en centrifugeer de celsuspensie bij 3000G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.

Gooi het supernatant weg, weeg het pellet en bevestig dat de minimale pelletmassa 500 milligram per monster bedraagt. Verzamel de testikels van vier weken oude mannelijke C57BL6-muizen. Was het gedecapsuleerde testikelweefsel tweemaal met 5 tot 10 milliliter DMEM.

Incubeer vervolgens 100 mg weefsel met 10 mL DMEM bevatten 1 mg/mL collagenase IV bij 37 °C. Zet de digestie voort gedurende 5 tot 15 minuten totdat de zaadbuisjes zijn vrijgekomen. Centrifugeer de suspensie daarna bij 1000G gedurende één minuut bij 4 °C en verwijder het supernatant.

Was de pellet met 5 tot 10 milliliters DMEM. Centrifugeer de suspensie opnieuw bij 1000G gedurende één minuut bij vier graden Celsius. Resuspendeer de pellet vervolgens in 0,25% trypsine bevattend één milligram per milliliter deoxyribonuclease I. Incubeer de suspensie bij 37 graden Celsius gedurende 5 tot 15 minuten.

Voeg vervolgens een gelijk volume DMEM aan, aangevuld met 10%FBS, om de enzymatische digestie te stoppen. Filtreer de suspensie door een cellzeef van 70 micrometer. Centrifugeer de cellen bij 2000G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.

Verwijder het supernatant en was het pellet met 5 tot 10 milliliters PBS. Centrifugeer de suspensie opnieuw bij 2000G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Resuspendeer de enkelcel-suspensie in PBS en verdeel deze gelijkmatig over een 15-centimeter kweekschaal.

Crosslink de testiculaire cellen zoals eerder gedemonstreerd voor GC2-cellen. Laat de bestraling weg voor de controlecellen. Verzamel de gecrosslinkte cellen.

Centrifugeer de suspensie bij 3000G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en gooi het supernatant weg. Zorg voor een minimale pelletmassa van 500 milligram door testiculaire cellen te poolen die geïsoleerd zijn van ten minste 10 tot 12 muizen. Resuspendeer de pellet na het wegen in cellysebuffer in een verhouding van 100 milligram pellet per één milliliter buffer.

Sonicate het monster na het vortexen met een gefocuste ultrasone cleaner of een waterbad-sonicator totdat het lysaat visueel helder wordt. Verdeel vervolgens ongeveer 10 µL van het lysaat in microcentrifugebuisjes voor RNA- en eiwitanalyse. Voeg 30 µL vooraf gewassen magnetische beads toe aan het lysaat.

Incubeer de monsters 30 minuten bij 37 °C met voorzichtig mengen in een hybridisatieoven. Plaats de monsters ongeveer één minuut op een magnetische standaard of totdat de oplossing helder wordt. Breng het geklaarde lysaat over naar een nieuwe buis.

Plaats de nieuwe buis op het magnetische rek. Draag het lysaat vervolgens over naar een andere buis om eventuele resterende beads te verwijderen. Voeg aan elk monster twee volumes hybridisatiebuffer toe die is voorverwarmd tot 37 °C.

Voeg gebiotineerde DNA-sondes toe in een verhouding van één microliter 100 micromolair sonde-stockoplossing per één milliliter lysaat. Incubeer de monsters gedurende 12 tot 16 uur bij 37 graden Celsius met end-over-end rotatie in een hybridisatieoven. Was vlak voor gebruik 100 microliters streptavidine-magnetische kralen drie keer met cellysebuffer.

Verwijder vervolgens de resterende buffer na de laatste wasbeurt. Centrifugeer de hybridisatiereactiebuisjes kort. Voeg daarna het gehybridiseerde monster toe aan de gewassen beads en meng dit voorzichtig.

Breng de kraal-suspensie terug in de oorspronkelijke buis en incubeer deze 30 tot 40 minuten bij 37 °C onder menging. Centrifugeer de monsters na incubatie kortstondig. Plaats de buizen één tot twee minuten op een magneethouder, of totdat de oplossing helder wordt.

Verwijder vervolgens het supernatant. Om de beads te wassen, voegt u één milliliter van de wasbuffer toe en incubeert u de buisjes in de hybridisatieoven bij 37 °C gedurende vijf minuten. Na vijf wasbeurten brengt u 1-10% van de beads over naar een nieuw buisje voor RNA-analyse.

Voeg tot slot 40 µL 1X SDS-monsterbuffer toe aan de resterende beads. Kook de monsters 30 minuten lang bij 95 °C om de eiwitten te elueren en de cross-links ongedaan te maken. Herwin de eiwitten voor verdere analyse middels massaspectrometrie.

Analyse via ChIRP-massaspectrometrie identificeerde meer dan 190 eiwitten die verrijkt waren ten opzichte van de negatieve controle in GC2-cellen. Bij een UV-dosis van 4 000 millijoules per vierkante centimeter identificeerde cPDiRT-MS een selectievere set eiwitten. Meer dan tweederde van deze eiwitten overlapte met de eiwitten die waren geïdentificeerd via conventionele ChIRP-MS.

De meeste eiwitten die werden geïdentificeerd met ten minste twee unieke peptiden, werden reproduceerbaar gedetecteerd in biologische replica's van zowel GC2-cellen als muizenteisjes. Gene ontology-analyse van de reproduceerbaar geïdentificeerde eiwitten onthulde biologische processen die grotendeels consistent waren met de bekende functies van TUG1. Vergelijking van de datasets van de GC2-cellen en muizenteisjes identificeerde 15 eiwitten die gemeenschappelijk verrijkt waren.

Verbeterde cross-linking immunoprecipitation sequencing onthulde duidelijke en specifieke bindingspieken op het TUG1-transcript voor PABPC1 en CCT3. cPDiRT stelt onderzoekers in staat om eiwitten te identificeren en te kwantificeren die direct interageren met specifiek gekoppeld RNA, zowel in kweekcellen als in native weefsels. De belangrijkste uitdaging is het bereiken van een efficiënte UV-cross-linking, terwijl een hoge specificiteit voor directe RNA- en eiwitinteracties wordt gewaarborgd.

Ons protocol zal toekomstige studies ondersteunen om deze aanpak toe te passen op andere RNA's en weefsels, om zo de directe interactie tussen RNA en proteïnen tijdens de ontwikkeling en voortplanting in kaart te brengen.