Name: Generatie van GABAerge neuronen uit menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van doxycycline-induceerbare ASCL1/DLX2-expressie bij AAVS1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-31T12:55:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Leer hoe je GABAerge neuronen genereert uit menselijke iPS-cellen met een doxycycline-induceerbaar systeem voor ASCL1/DLX2 bij AAVS1. Deze methode biedt een betrouwbaar model voor neurologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<ol>
	<li>Mertens J, Marchetto MC, Bardy C, Gage FH. Evaluating cell reprogramming, differentiation, and conversion technologies in neuroscience. Nat Rev Neurosci. 2016 Jul;17(7):424-37.</li>
	<li>Barabino A, Flamier A, Hanna R, H&#233;on E, Freedman BS, Bernier G. Deregulation of Neuro-Developmental Genes and Primary Cilium Cytoskeleton Anomalies in iPSC Retinal Sheets from Human Syndromic Ciliopathies. Stem Cell Reports. 2020 Mar 10;14(3):357-73.</li>
	<li>Katbe A, Hanna R, Flamier A, Serhani D, Hamam R, Barabino A, et al. Epigenomic alterations and neural development anomalies in induced pluripotent stem cells from sporadic Alzheimer&#8217;s disease. Development. 2026 Jan 1;153(1):dev204910.</li>
	<li>Liu Y, Flamier A, Bell GW, Diao AJ, Whitfield TW, Wang HC, et al. MECP2 directly interacts with RNA polymerase II to modulate transcription in human neurons. Neuron. 2024 Jun;112(12):1943-1958.e10.</li>
	<li>Flamier A, Bisht P, Richards A, Tomasello DL, Jaenisch R. Human iPS cell-derived sensory neurons can be infected by SARS-CoV-2. iScience. 2023 Sep 15;26(9).</li>
	<li>Wogram E, S&#252;mpelmann F, Khalil A, Flamier A, Fu D, Bell GW, et al. Human iPSC-Derived Microglia Integrate Into Cerebral Organoids and Assume an In&#160;Vivo-Like Phenotype. Eur J Neurosci. 2025 Nov;62(9):e70281.</li>
	<li>Mar&#237;n O. Interneuron dysfunction in psychiatric disorders. Nat Rev Neurosci. 2012 Jan 18;13(2):107&#8211;20. PubMed PMID: 22251963.</li>
	<li>Yang N, Ng YH, Pang ZP, S&#252;dhof TC, Wernig M. Induced neuronal cells: how to make and define a neuron. Cell Stem Cell. 2011 Dec 2;9(6):517-25.</li>
	<li>Busskamp V, Lewis NE, Guye P, Ng AHM, Shipman SL, Byrne SM, et al. Rapid neurogenesis through transcriptional activation in human stem cells. Mol Syst Biol. 2014 Nov 17;10(11):760.</li>
	<li>Barretto N, Zhang H, Powell SK, Fernando MB, Zhang S, Flaherty EK, et al. ASCL1- and DLX2-induced GABAergic neurons from hiPSC-derived NPCs. J Neurosci Methods. 2020 Mar 15;334:108548.</li>
	<li>Gu J, Rollo B, Liu Z, O&#8217;Brien TJ, Kwan P, Cromer B, et al. Forward programming of human pluripotent stem cells to generate glutamatergic and GABAergic neurons in a tri-culture model with astrocytes. Stem Cell Res Ther. 2026 Feb 25;17(1):125.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>4D-Nucleofector&trade; Core Unit</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002B</td><td>Voor elektroporatie/nucleofectie van hiPSC's.</td></tr><tr><td>6-well culture plates</td><td>Sarstedt</td><td>83.3920300</td><td>Op weefsel gekweekte platen voor het onderhoud en de differentiatie van hiPSC's.</td></tr><tr><td>BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78005</td><td>Recombinant humaan eiwit voor neuronale rijping; bereid volgens de instructies van de fabrikant en gebruik bij een eindconcentratie van 10 ng/mL.</td></tr><tr><td>Cell counter (Countess)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10283</td><td>Gebruikt voor celtelling.</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>VWR</td><td>76468-134</td><td>Voor het pelletten van cellen.</td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Heracell VIOS 160i of equivalent</td><td>Celcultuurincubator die 37 &deg;C, bevochtigde atmosfeer en 5% CO2 handhaaft.</td></tr><tr><td>Cryotubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5000-0020</td><td>Steriele cryogenes flessen voor het invriezen van hiPSC's; equivalent extern draadgebonden 1,8&ndash;2,0 mL cryoflessen mag worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract</td><td>Bio-Techne</td><td>BME001-05</td><td>Standaard BME-coatingmatrix gebruikt in het protocol. Controleer de lotspecifieke voorraadconcentratie uit het Bio-Techne-analysecertificaat en verdun in DMEM/F-12 tot 80 &micro;g/mL werkconcentratie.</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Wisent</td><td>319-090-CL</td><td>Basismedium gebruikt voor het verdunnen van BME.</td></tr><tr><td>DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Cryoprotecteur gebruikt bij de bereiding van vriesmedium.</td></tr><tr><td>Donor plasmid: inducible ASCL1-P2A-DLX2 AAVS1 targeting cassette</td><td>Custom plasmid</td><td>Addgene accession in afwachting</td><td>Aangepast AAVS1 donorplasmide dat een doxycycline-induceerbare ASCL1-P2A-DLX2 cassette en selectie/reporter-elementen bevat. Zorg voor een plasmidekaart en volledige sequentie als aanvullend bestand of op verzoek.</td></tr><tr><td>Doxycycline hyclate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td>Gebruikt om ASCL1-P2A-DLX2 expressie te induceren. Bereid steriele stockoplossing, verdeel in aliquoten, bescherm tegen licht, bewaar ingevroren en gebruik bij een eindconcentratie van 1 &micro;g/mL.</td></tr><tr><td>Ethanol (70%)</td><td>Commercial Alcohols / Greenfield Global</td><td>P016EAAN</td><td>Voor sterilisatie binnen de biologische veiligheidskast; gebruik institutioneel goedgekeurde 70% ethanol of equivalent.</td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>ECHO</td><td>Revolve R4</td><td>Microscoop gebruikt voor fasecontrast- en fluorescentiebeeldvorming van reporterexpressie en neuronale morfologie.</td></tr><tr><td>GDNF (Glial-Derived Neurotrophic Factor)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78058</td><td>Recombinant humaan eiwit voor neuronale rijping; bereid volgens de instructies van de fabrikant en gebruik bij een eindconcentratie van 10 ng/mL.</td></tr><tr><td>hiPSC line PGP1</td><td>EditCo Bio</td><td>PGP1 human iPSC line</td><td>Commercieel verkrijgbare open-consent menselijke iPSC-lijn gebruikt in dit protocol; noteer passagenummer en QC-status vóór bewerking en differentiatie.</td></tr><tr><td>Image-analysis software</td><td>ImageJ/Fiji</td><td>Open-source; versie die wordt gebruikt, moet worden gerapporteerd</td><td>Voor fluorescentiekwantificering en representatieve beeldverwerking.</td></tr><tr><td>KnockOut&trade; Serum Replacement (KOSR)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828028</td><td>Gebruikt bij de bereiding van vriesmedium.</td></tr><tr><td>Laminin-521</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>200-0117</td><td>Optionele troubleshooting reagent alleen. Niet onderdeel van het standaardcoatingprotocol; kan worden gebruikt als alternatief of dubbelcoatingmatrix als neuronale loslating aanhoudt.</td></tr><tr><td>Liquid nitrogen dewar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Locator 6 Plus of equivalent</td><td>Langdurige opslag van ingevroren hiPSC's in vapor-fase of vloeibare stikstof volgens institutionele cryogeen veiligheidsprocedures.</td></tr><tr><td>Mr. Frosty&trade; Freezing Container</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td>Voor gecontroleerd temperatuurverlagingsvriesproces van cellen bij -80 &deg;C.</td></tr><tr><td>mTeSR&trade; Plus</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>100-0276</td><td>Feeder-vrij onderhoudsmedium voor hiPSC's.</td></tr><tr><td>Neuro-induction medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>08582</td><td>Commercieel neuro-inductiemedium gebruikt voor vroege neuronale inductie.</td></tr><tr><td>Neuro-maturation base medium (BrainPhys&trade; Neuronal Medium)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05790</td><td>Basismedium voor neuronale rijping; suppleteer met BDNF, GDNF, NT-3, doxycycline en PluriSln-1 zoals beschreven in het protocol.</td></tr><tr><td>NT-3 (Neurotrophic Factor 3)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78074</td><td>Recombinant humaan eiwit voor neuronale rijping; bereid volgens de instructies van de fabrikant en gebruik bij een eindconcentratie van 10 ng/mL.</td></tr><tr><td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofector&trade; X Kit</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3024</td><td>Kit met oplossing P3 en cuvettes voor hiPSC nucleofectie.</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Optioneel antibioticum om het risico op bacteriële contaminatie te verminderen.</td></tr><tr><td>Plasmocin&trade; prophylactisch</td><td>InvivoGen</td><td>ant-mpp</td><td>Optioneel antibioticum om mycoplasmacontaminatie te voorkomen.</td></tr><tr><td>PluriSIn-1</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72822</td><td>Pluripotente celoverlevingsremmer om ongedifferentieerde hiPSC's te elimineren; bereid stock volgens de instructies van de fabrikant en gebruik bij een eindconcentratie van 20 &micro;M.</td></tr><tr><td>Puromycin Dihydrochloride</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1113803</td><td>Antibioticum gebruikt voor selectie; bereid steriele stockoplossing, verdeel in aliquoten, bewaar ingevroren en bepaal de eindwerkconcentratie door een killcurve, typisch 0,4&ndash;0,6 &micro;g/mL.</td></tr><tr><td>pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 AAVS1 gRNA plasmid</td><td>Addgene</td><td>85802</td><td>CRISPR/Cas9 plasmid gebruikt voor AAVS1 targeting; vermeld de AAVS1 gRNA-sequentie in de plasmidekaart of aanvullende informatie.</td>

generatie van gabaerge neuronen uit menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van doxycycline-induceerbare ascl1/dlx2-expressie bij aavs1

Generation of GABAergic Neurons from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Doxycycline-Inducible ASCL1/DLX2 Expression at AAVS1

Generatie van GABAerge neuronen uit menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van doxycycline-induceerbare ASCL1/DLX2-expressie bij AAVS1

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) offer an unprecedented opportunity to model human neurological diseases in vitro. Reliable generation of ...

Ons onderzoek richt zich op het genereren van zuivere populaties GABAerge neuronen uit hiPSCs om menselijke neuronale diversiteit en ziekten te modelleren. Bestaande protocollen vereisen herhaalde virale transductie bij elke differentiatie. Dit protocol pakt deze beperking aan door gebruik te maken van een AAVS1-cellijn.Bereid eerst het invriesmedium door 40 milliliter knock-out serum replacement of KOSR en 10 milliliter DMSO te combineren in een conische buis van 50 milliliter. Homogeniseer het invriesmedium door 10 keer op en neer te pipetteren en bewaar de oplossing bij 4 °C. Verdun vervolgens het basement membrane extract of BME in DMEM en F12-medium tot een eindconcentratie van 80 µg/mL. Voeg 1 milliliter van het verdunde BME toe aan elke well van een six-well plaat. Kantel de plaat om de oplossing gelijkmatig over het gehele oppervlak van de wells te verdelen, zodat er geen onbehandelde gebieden overblijven, en incubeer de plaat minimaal 30 minuten bij 37 °C.Zuig met een aspiratiepipet het medium af uit de wells die menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen, of hiPSCs, bevatten. Voeg 1 milliliter ReLeSR toe aan de well en laat dit 30 seconden incuberen bij kamertemperat

generation-gabaergic-neurons-from-human-induced-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

De Stemgent Dox Induceerbare Mouse TF lentivirus Set kan herprogrammeren muis embryonale fibroblasten (MEF) om geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen. Hier hebben we het protocol voor DOX-induceerbare expressie van muis herprogrammering transcriptiefactoren Oct4 te tonen, om Sox2, Klf4 en c-Myc genereren iPS kolonies die uitdrukken gemeenschappelijke MES pluripotentie markers.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen door herprogrammeren embryonale fibroblasten van muizen met een vier transcriptiefactor, Doxycycline Induceerbare Lentivirale transductiesysteem

We hebben een protocol voor de inductie van neuroblasts rechtstreeks van pluripotente menselijke embryonale stamcellen gehouden onder bepaalde voorwaarden met kleine moleculen, die afleiding van een groot aanbod van menselijke neurale voorouders en neuronale celtypes in het ontwikkelen van CNS voor neurale reparatie mogelijk maakt.

Efficiënte Afleiding van de Mens Neuronale voorouders en neuronen van pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

This video demonstrates the process of differentiating embryoid bodies (EBs) into neuroepithelial aggregates and their subsequent division into neuronal and glial cells. This method allows the efficient generation of neuronal and glial cells in vitro, which serve as test systems for toxicity testing as well as assessment of different pathways involved in neurotoxicity.

Generating Neurons and Glial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Embryoid Bodies

This video demonstrates the process of inducing human pluripotent stem cells to differentiate into neurons by transfecting them with engineered lentiviruses carrying a neurogenic transcription factor gene under the control of  tetracycline-responsive element, followed by treatment with a tetracycline derivative and maturation medium.

Human Pluripotent Stem Cell Differentiation in Neurons Using Engineered Lentiviruses

Deze procedure levert telencephalic neuronen door door checkpoints die vergelijkbaar zijn met die waargenomen in menselijke ontwikkeling. De cellen mogen spontaan differentiëren blootgesteld aan risicofactoren te duwen naar de neurale stam, geïsoleerd en uitgeplaat op dekglaasjes om voor terminale differentiatie en maturatie.

De Specificatie van Telencephalic glutamaat neuronen van menselijke pluripotente stamcellen

Deze procedure laat zien hoe interneuronen in de zich ontwikkelende voorhersenen van muizen kunnen worden gericht door middel van in utero elektroporatie. Deze techniek was bijzonder efficiënt om selectieve genexpressie in interneuron-subtypen te bereiken die bestemd zijn voor de oppervlakkige lagen van de cortex.

Subtype-selectieve Electroporatie van corticale Interneurons

Wij hebben, op basis van kennis uit de ontwikkelingsbiologie en gepubliceerd onderzoek, een geoptimaliseerd protocol ontwikkeld om efficiënt A9 middenhersen-dopaminerge neuronen te genereren uit zowel menselijke embryonale stamcellen als menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen, wat nuttig zou zijn voor ziektemodellering en celvervangende therapie voor de ziekte van Parkinson.

Geregisseerd Dopaminerge Neuron Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen

Het modelleren van de ontwikkeling van de menselijke hersenen is belemmerd door de ongekende complexiteit van neurologisch epitheelweefsel. Hier wordt een methode beschreven voor de robuuste generatie van hersenorganoïden om vroege gebeurtenissen van de menselijke hersenontwikkeling af te bakenen en om microcefalie in vitro te modelleren.

Genereren van iPSC afgeleide Human Brain Organoids naar Early Neurodevelopmental Disorders Model

Dit protocol wordt een methode voor het genereren van corticale interneuron progenitoren en post mitotische interneuron precursoren van muis embryonale stamcellen met een gewijzigde embryoid lichaam-aan-enkelgelaagde methode beschreven. Deze progenitoren/precursoren kunnen worden gebruikt in vitro fluorescently gesorteerd en getransplanteerd in neonatale neocortex voor het bestuderen van de bepaling van het lot of gebruikt in therapeutische toepassingen.

Differentiatie van muis embryonale stamcellen in de corticale Interneuron precursoren

De neuron-gliale interacties bij neurodegeneratie worden niet goed begrepen als gevolg van ontoereikende hulpmiddelen en methoden. Hier beschrijven we geoptimaliseerde protocollen om geïnduceerde neuronen, oligodendrocytenvoorlopercellen en oligodendrocyten te verkrijgen uit menselijke pluripotente stamcellen en geven we voorbeelden van de waarden van deze methoden bij het begrijpen van celtypespecifieke bijdragen bij de ziekte van Alzheimer.

Generatie van menselijke neuronen en oligodendrocyten uit pluripotente stamcellen voor het modelleren van neuron-oligodendrocyteninteracties

Transplantatie van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide GABAerge neuronen gegenereerd door neuronale programmering zou een potentiële behandelingsbenadering kunnen zijn voor neurologische ontwikkelingsstoornissen. Dit protocol beschrijft de generatie en transplantatie van menselijke stamcel-afgeleide GABAerge neuronale voorlopers in de hersenen van neonatale muizen, waardoor langdurig onderzoek van geënte neuronen en evaluatie van hun therapeutisch potentieel mogelijk is.

Transplantatie van menselijke stamcel-afgeleide GABAerge neuronen in de vroege postnatale muis hippocampus om neurologische ontwikkelingsstoornissen te verminderen

Leer hoe je GABAerge neuronen genereert uit menselijke iPS-cellen met een doxycycline-induceerbaar systeem voor ASCL1/DLX2 bij AAVS1. Deze methode biedt een betrouwbaar model voor neurologisch onderzoek.

Generatie van GABAerge neuronen uit menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van doxycycline-induceerbare ASCL1/DLX2-expressie bij AAVS1 (Video) | JoVE Journal

Generatie van GABAerge neuronen uit menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van doxycycline-induceerbare ASCL1/DLX2-expressie bij AAVS1

Meer video's verkennen