ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Dr. Shital Suryavanshi en het personeel van de dierhouderij van het Tata Institute of Fundamental Research voor hun uitstekende ondersteuning. Wij danken Dr. Sundar Naganathan voor het genereus toestaan van het gebruik van de Olympus MVX10 stereo macro zoom microscoop in zijn laboratorium voor het opnemen van de video van de procedure. Dit werk werd gefinancierd door een beurs van het Department of Atomic Energy (DAE), Government of India, Project Identification No. RTI4003 en RTI4015 (ST); ICMR-DHR SUG-beurs, GAP00303, ANRF PMECRG-beurs GAP00313 (AP).

Alle procedures zijn goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de Institutional Animal Ethics Committee van het Tata Institute of Fundamental Research.
1. Materiaalpreparatie
<ol>
	<li>Zorg ervoor dat alle benodigde instrumenten voor microdissectie (zie de Tabel met Materialen) zijn voorbereid voordat de procedure begint. Steriliseer alle instrumenten met 70% ethanol. Voor het verzamelen van preparaten voor downstream toepassingen zoals ruimtelijke transcriptomica/in situ hybridisatie, veeg de instrumenten af met een RNase-decontaminatieoplossing.</li>
	<li>Maak de tafel van de dissectiemicroscoop schoon met RNase-decontaminatieoplossing en houd een fles ijskoud 1× PBS bij de hand nabij de dissectiebank.</li>
	<li>Houd de volgende instrumenten en plasticware gereed voordat u aan deze procedure begint:
	<ol>
		<li>Voor de dierpreparatie, houd het volgende gereed: 2 paren stompe pincetten, 1 paar chirurgische scharen, 2 petrischalen (10 cm), meerdere petrischalen (6 cm; naar behoefte, één per kop).</li>
		<li>Voor het isoleren van de hersenen, houd het volgende gereed: 1 paar #5 pincetten, 1 paar #55 pincetten, 1 paar microdissectiescharen en verzamelbuisjes/schalen die geschikt zijn voor de downstream toepassing.</li>
		<li>OPMERKING: Als de downstream toepassing in situ hybridisatie of ruimtelijke transcriptomica omvat, maak de dissectie-instrumenten dan vóór gebruik schoon met RNase-decontaminatieoplossing.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Voorbereiding van de dieren
<ol>
	<li>Volg stappen (2.1.1– 2.1.6) voor dieren E14.5–P0
	<ol>
		<li>Euthanaseer de drachtige moederdier in overeenstemming met de richtlijnen van de Institutionele Commissie voor Dierethiek. In het getoonde voorbeeld werd het moederdier geëuthanaseerd door middel van cervicale dislocatie.</li>
		<li>Maak een midline incisie in de buikholte van het drachtige moederdier om de baarmoeder bloot te leggen. Trek de uterine hoorns voorzichtig uit met stompe pincetten en plaats deze in een steriele schaal van 10 cm met ijskoud 1×&#160;PBS.</li>
		<li>Isoleer de individuele foetussen zorgvuldig door ze te scheiden van de omringende vruchtzak en placenta.&#160;</li>
		<li>Verplaats de foetussen naar een schone petrischaal van 10 cm met ijskoud 1× PBS en houd ze op ijs tot ze een voor een worden genomen voor de isolatie van de hersenen. Verplaats één foetus naar een petrischaal van 6 cm met ijskoud PBS.&#160;</li>
		<li>Voor postnatale stadia tot P7: euthanaseer de pup in overeenstemming met de richtlijnen van de Institutionele Commissie voor Dierethiek. Ga vervolgens verder vanaf stap 2.1.6.</li>
		<li>Scheid de kop van het lichaam met een chirurgische schaar, zodanig dat de rhombencephalon in de kop is opgenomen om de telencephalon te beschermen tegen onbedoelde beschadiging.</li>
		<li>Was de kop met koud PBS om het bloed te verwijderen. Verplaats deze naar een schone petrischaal van 6 cm met ijskoud 1× PBS. Houd de kop ondergedompeld in het PBS zodat bloed en debris tijdens de daaropvolgende dissectiestappen worden weggespoeld.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Dissectieprocedure om de hersenen met een intacte pijnappelklier te isoleren
OPMERKING: Alle onderstaande stappen moeten worden uitgevoerd met een dissectiemicroscoop. Stel de vergroting in op ten minste 2× (of naar behoefte) om de hersenen en de omliggende structuren gedurende de gehele dissectie duidelijk te kunnen visualiseren. Het volledige dissectieproces moet worden uitgevoerd in ijskoud PBS om degradatie van RNA en eiwitten te minimaliseren. Gebruik bij stappen 3.1–3.10 de niet-dominante hand om de kop stevig vast te houden en te stabiliseren gedurende de procedure, conform de instructies in stap 3.1. Stappen 3.2–3.9 worden uitgevoerd terwijl de niet-dominante hand de kop stabiliseert en de dominante hand wordt gebruikt voor de fijne motoriek, beginnend met een #5 pincet en vervolgens overschakelend naar een #55 pincet of microdissectieschaar zoals gespecificeerd per stap.&#160;
<ol>
	<li>Gebruik een #5 pincet in de niet-dominante hand. Voeg de twee pootjes in de oogkassen door middel van een krachtige neerwaartse beweging. Handhaaf de neerwaartse druk om de hersenen tegen de bodem van de petrischaal te fixeren totdat stap 3.9 is voltooid.&#160; 
	OPMERKING: De hersenen bevinden zich boven de oogkassen en worden niet beïnvloed door het inbrengen van de pincetten in de oogkassen. Het handhaven van een constante neerwaartse druk stabiliseert de hersenen gedurende de gehele dissectie.&#160;</li>
	<li>Knijp met de dominante hand de huid die de kop bedekt af en verwijder deze met een #5 pincet.&#160; 
	OPMERKING: In dit stadium is te zien dat het gladde chondrocranium de hersenen bedekt.</li>
	<li>Verwijder het deel van het chondrocranium dat boven het midden- en achterbrein ligt als volgt:
	<ol>
		<li>Gebruik de pincet #5 om twee penetrerende incisies in het chondrocranium te maken aan weerszijden van het middenhersenen, precies op de plek waar deze aansluiten op het telencephalon.</li>
		<li>Schuif één tak van de #5 pincet tangentieel onder het chondrocranium langs de denkbeeldige tangentiale lijn die het telencephalon van het middenbrein scheidt. Grijp stevig vast en scheur het chondrocranium open.</li>
		<li>Verwijder het chondrocranium verder totdat de middenhersenen en de achterhersenen zijn blootgelegd.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Schakel over naar #55 pincetten. Steek één punt net onder de rand van de caudale marge van het chondrocranium dat over het telencephalon ligt. Scheid het chondrocranium voorzichtig door alle verbindingen met vasculaire en meningeale weefsels los te maken.</li>
	<li>Snij met een microdissectieschaar langs de dorsale telencefalische middenlijn in de richting van de bulbus olfactorius. Verwijder met een gesloten #55 pincet voorzichtig alle aanhechtingen van het chondrocranium aan de hersenen. Scheid de twee helften van het chondrocranium die de telencefalische hemisferen bedekken met behulp van de #5 pincet. 
	OPMERKING: In dit stadium is de SSS zichtbaar als een donkerrode ader langs de superieure rand van het chondrocranium in de hersenen, en is de TS loodrecht op de SSS zichtbaar.</li>
	<li>De pijnappelklier bevindt zich direct onder de SSS. Maak met een microdissectieschaar een inkeping aan het rostrale uiteinde van de SSS.&#160;</li>
	<li>Verwijder met een #55 pincet het dorsale deel van het chondrocranium aan beide zijden volledig om de pijnappelklier, de SSS en de TS beter bloot te leggen.</li>
	<li>Maak met een microdissectieschaar twee sneden in de TS aan weerszijden van de pijnappelklier. Ontkoppel met een #55 pincet de laterale aanhechtingen van de TS.&#160;</li>
	<li>Verplaats voorzichtig het rostrale gedeelte van de hersenen uit het ventrale schedeldak met een gesloten #5 pincet. Schuif het gesloten pincet onder de ventrale zijde van de hersenen om deze volledig los te maken.&#160;</li>
	<li>Bewaar de hersenen met de epifyse intact, zoals geschikt voor verdere downstream-toepassingen.</li>
</ol>
4. Kritische stappen in het protocol
OPMERKING: Het succes van dit dissectieprotocol hangt af van een zorgvuldige behandeling van de vasculaire aanhechtingen rondom de pijnappelklier. De volgende punten zijn cruciaal om de pijnappelklier tijdens de gehele dissectieprocedure intact te houden:
<ol>
	<li>Stabiliseer de kop door de tanden van een #5 pincet in beide oogkassen te plaatsen en houd gedurende stappen 3.1–3.9 een stevige neerwaartse druk vast. Dit biedt een stabiele ondersteuning terwijl directe druk op de hersenen wordt vermeden.</li>
	<li>Vermijd bij het verwijderen van het chondrocranium (stap 3.3) overmatig trekken of pellen, aangezien dit kan leiden tot het losraken van de pijnappelklier van het dorsale diencephalon.</li>
	<li>Gebruik bij het vrijmaken van de meningeale en vasculaire aanhechtingen (stap 3.4) en bij het openen van het dorsale telencefalische chondrocranium (stap 3.5) uitsluitend de punten van het #55 pincet. Diepe penetratie van het pincet kan de pijnappelklier beschadigen, die zich direct onder het caudale telencefalische dak bevindt.</li>
	<li>Voltooi de doorsnijding van de sinus sagittalis superior (stap 3.6) en de bilaterale doorsnijding van de sinus transversus (stap 3.8) voordat de hersenen worden verwijderd. Deze incisies verminderen de spanning in het dorsale veneuze netwerk en voorkomen afscheuring van de pijnappelklier tijdens het verwijderen van de hersenen.</li>
	<li>Verplaats in stap 3.9 de hersenen voorzichtig met een gesloten pincet, zonder de dorsale middellijn te verstoren. De hersenen moeten vrij loskomen van het schedeldak zodra alle meningeale en vasculaire aanhechtingen zijn losgelaten.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nakahara D, Nakamura M, Iigo M, Okamura H. Bimodal circadian secretion of melatonin from the pineal gland in a living CBA mouse. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003;100(16):9584-9.</li>
	<li>Christ E, Pfeffer M, Korf HW, von Gall C. Pineal melatonin synthesis is altered in Period1-deficient mice. Neuroscience. 2010;171(2):398-406.</li>
	<li>Rath MF. Homeobox gene-encoded transcription factors in development and mature circadian function of the rodent pineal gland. J Pineal Res. 2024;76(3):e12950.</li>
	<li>Rath MF, Rohde K, Klein DC, M&#248;ller M. Homeobox genes in the rodent pineal gland: roles in development and phenotype maintenance. Neurochem Res. 2013;38(6):1100-12.</li>
	<li>Estivill-Torr&#250;s G, Vitalis T, Fern&#225;ndez-Llebrez P, Price DJ. The transcription factor Pax6 is required for development of the diencephalic dorsal midline secretory radial glia that form the subcommissural organ. Eur J Neurosci. 2001;14(6):1011-22.</li>
	<li>Dias M, et al. Transection of the superior sagittal sinus enables bilateral access to the rodent midline brain structures. eNeuro. 2021;8(4):ENEURO.0146-21.2021.</li>
	<li>Matsunaga MM, et al. Morphologic analysis of mice&#39;s pineal gland. J Morphol Sci. 2011;28(3):157-60.</li>
	<li>Boeckmann D. Morphological investigation of the deep pineal of the rat. Cell Tissue Res. 1980;210(2):283-94.</li>
	<li>Parichha A, et al. Constitutive activation of canonical Wnt signaling disrupts choroid plexus epithelial fate. Nat Commun. 2022;13:633.</li>
	<li>Parichha A, et al. Dentate gyrus morphogenesis is regulated by &#946;-catenin function in hem-derived fimbrial glia. Development. 2022;149(21):dev200953.</li>
	<li>Sparks DL, Coyne CM, Sparks LM, Hunsaker JC 3rd. Recommended technique for brain removal to retain anatomic integrity of the pineal gland in order to determine its size in sudden infant death syndrome. J Forensic Sci. 1997;42(1):100-2.</li>
	<li>Bowyer JF, et al. A visual description of the dissection of the cerebral surface vasculature and associated meninges and the choroid plexus from rat brain. J Vis Exp. 2012;69:e4285.</li>
	<li>Calvo J, Boya J. Embryonic development of the rat pineal gland. Anat Rec. 1981;200(4):491-500.</li>
</ol>

Alle auteurs verklaren dat er geen concurrerende belangen zijn.

Gestandaardiseerde methoden voor de dissectie van de pijnappelklier zijn ontwikkeld voor het menselijke foetale/infante brein, wat forensisch pathologen helpt bij het begrijpen van de oorzaak van het plotselinge infantedoodsyndroom11. Eerdere protocollen toonden de verwijdering van de pijnappelklier samen met oppervlakkige vasculatuur, hersenvliezen en de plexus choroidea aan12; er zijn echter geen methoden beschreven om betrouwbaar een intacte pijnappelklier te behouden die vastzit aan het dak van het diencefalon tijdens de vroege ontwikkelingsstadia bij muizen of andere knaagdieren.
Een groot deel van de klassieke anatomische en methodologische literatuur over pinealectomie en analyse is ontwikkeld met behulp van ratmodellen13, waarbij de klier groter is en gemakkelijker te identificeren. In contrast hiermee is de pijnappelklier van de muis aanzienlijk kleiner en fragieler, waardoor deze bijzonder gevoelig is voor verlies of beschadiging tijdens routinematige procedures voor hersenextractie. Sommige studies hebben geprobeerd deze uitdaging aan te pakken door de hersenen binnen de gehele kop te fixeren. Dit introduceert echter aanvullende technische beperkingen tijdens de preparatie van het weefsel voor doorsneden. Tijdens cryoprotectie in 30% sucrose na fixatie in 4% paraformaldehyde kan het schedeldak bijvoorbeeld druk uitoefenen op het onderliggende hersenweefsel, wat leidt tot compressie of vervorming van dorsale structuren in de voorhersenen. Dergelijke artefacten kunnen de hersenmorfologie aantasten en analyses bemoeilijken die afhankelijk zijn van een nauwkeurige anatomische organisatie. Bovendien is het fixeren van het weefsel mogelijk niet geschikt voor alle toepassingen. Daarom zijn methoden nodig die de pijnappelklier behouden en de verbinding met het dak van het diencephalon intact houden zonder de algehele integriteit van de hersenen in gevaar te brengen, om ontwikkelingskundige en moleculaire studies van de pijnappelklier bij de muis te faciliteren.
Betrouwbare preservatie van de pijnappelklier in intacte hersenpreparaten is belangrijk voor diverse experimentele toepassingen. Histologische en moleculaire benaderingen, zoals immunohistochemie en in situ hybridisatie, vereisen behoud van de weefselarchitectuur om genexpressie en cellulaire organisatie binnen de klier te bestuderen. Recentelijk zijn er opkomende technologieën, zoals ruimtelijke transcriptomica en andere ruimtelijk opgeloste moleculaire profileringsmethoden, die eveneens afhankelijk zijn van intacte weefselmorfologie om genexpressie binnen specifieke anatomische contexten in kaart te brengen. Tot op heden is er geen ruimtelijke transcriptomische kaart van de embryonale muizenpijnappelklier gerapporteerd. Dit kan mede een weerspiegeling zijn van de technische moeilijkheid om de intacte pijnappelklier te behouden tijdens conventionele hersendissectie. Daarom zullen methoden die de integriteit van de pijnappelklier betrouwbaar behouden, waarschijnlijk de toepassing van opkomende ruimtelijke transcriptomische benaderingen in de biologie van de pijnappelklier vergemakkelijken. Daarnaast, aangezien de pijnappelklier een zeer klein fractie van het totale hersenweefsel vertegenwoordigt, maakt het isoleren van de hersenen met een intacte pijnappelklier een daaropvolgende extra stap mogelijk om specifiek de pijnappelklier te oogsten; het poolen van dergelijke oogsten zou de verrijking van de pijnappelklier-specifieke representatie in bulkanalyses in transcriptomische en proteomische studies aanzienlijk verbeteren.
Het is noodzakelijk om het hoofd goed te stabiliseren met een #5 pincet in de niet-dominante hand. Dit moet gedurende het gehele dissectieproces worden gehandhaafd; daarom moet de dominante hand de wisseling van instrumenten naar behoefte beheren. Pas de verlichting aan om de aanhechtingen van de pijnappelklier aan het overliggende vasculo-meningeale weefsel, dat verwijderd moet worden, beter te kunnen zien.

De pijnappelklier is een kleine neuroendocriene structuur gelegen in de dorsale middellijn van de hersenen van gewervelden en speelt een centrale rol bij het reguleren van de circadiane fysiologie via de ritmische secretie van melatonine1,2. Tijdens de embryogenese van zoogdieren ontstaat de pijnappelklier uit de dorsale middellijn van de zich ontwikkelende voorhersenen. Bij muizen begint de ontwikkeling van de pijnappelklier wanneer een gespecialiseerd gebied van het dorsale diencefalische neuroepithelium de pineale aanleg/recessus pinealis vormt, die vervolgens uitstulpt om het diverticulum pineale te vormen op embryonale dag (E) 14,53,4,5. Dit diverticulum is bevestigd aan het dak van het diencefalon en is zichtbaar tussen de gepaarde telencefalische blaasjes. Naarmate de ontwikkeling vordert, raakt dit diverticulum nauw verbonden met bovenliggende structuren in de dorsale middellijn van de hersenen, in het bijzonder de sinus sagittalis superior (SSS) en de sinus transversus (TS), veneuze kanalen die langs het dorsale oppervlak van de voorhersenen lopen6. De zich ontwikkelende pijnappelklier ligt direct onder het kruispunt van de SSS en de TS, en de fragiele verbinding met het dorsale diencefalon is bijzonder kwetsbaar wanneer de bovenliggende vasculo-meningeale structuren worden verwijderd om de hersenen uit de schedelholte te halen7. Dit maakt de pijnappelklier bijzonder vatbaar voor beschadiging, aangezien deze kan worden afgescheurd wanneer de schedelholte wordt geopend voor de extractie van de hersenen. Als gevolg hiervan gaat de pijnappelklier vaak verloren tijdens routinematige dissecties, wat de analyse van de structuur en moleculaire samenstelling in intacte preparaten beperkt.
Hier beschrijven we een stapsgewijs protocol voor het dissekeren van de muizenhersenen, waarbij de pijnappelklier en de aanhechting ervan aan het dak van het diencefalon behouden blijven. De methode is toepasbaar op embryonale stadia van E16.5 tot vroege postnatale stadia (P7), en is geschikt voor studies naar de ontwikkeling van de pijnappelklier met behulp van in situ hybridisatie, immunohistochemie en ruimtelijke transcriptomica. Ter demonstratie van downstream-toepassingen worden in situ hybridisatie en immunohistochemie voor de pijnappelklier-verrijkte marker CRX gepresenteerd.
De belangrijkste innovatie van deze methode is dat de spanning op de middenlijnstructuren wordt geminimaliseerd door zorgvuldig de fysieke aanhechtingen te verwijderen die anders de pijnappelklier zouden afscheuren wanneer de hersenen uit het schedelgewelf worden verwijderd. Dit is een verbetering ten opzichte van de standaardprocedure.
Deze dissectiemethode is beperkt tot stadia tot P7, omdat de progressieve ossificatie van het schedeldak tijdens de vroege postnatale ontwikkeling de stijfheid van de schedel vergroot en de verbinding met meningeale en vasculaire structuren versterkt. Hoewel verschillende studies dissectieprocedures voor de pijnappelklier bij volwassen knaagdieren hebben beschreven8, hebben zeer weinig zich gericht op het behoud van de pijnappelklier tijdens embryonale en vroege postnatale stadia, wanneer de klier bijzonder fragiel is en vatbaar voor beschadiging tijdens de isolatie van de hersenen.

<table><tbody><tr><td>Brightfield microscoop</td><td>Olympus</td><td>IX73</td><td>Elke brightfield microscoop met een kleurencamera is geschikt.</td></tr><tr><td>Confocale microscoop</td><td>Olympus</td><td>FV3000</td><td>Afhankelijk van de vereiste resolutie is elke confocale microscoop of epifluorescentiemicroscoop geschikt</td></tr><tr><td>CRX antilichaam</td><td>Invitrogen</td><td>PA5-32182</td><td>Immunokleuringsprotocol beschreven in Parichha et al.&lt;sup&gt;9&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>CRX probe</td><td>Custom made</td><td>Custom made</td><td>In situ hybridisatieprotocol Parichha et al.&lt;sup&gt;10&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>Fijne pincet&amp;nbsp;# 5</td><td>F.S.T</td><td>11251-23</td><td>Kan worden vervangen door vergelijkbare instrumenten van elke fabrikant.</td></tr><tr><td>Fijne pincet&amp;nbsp;# 55</td><td>F.S.T</td><td>11255-20</td><td>Kan worden vervangen door vergelijkbare instrumenten van elke fabrikant.</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>Kan worden vervangen door vergelijkbare producten van elke fabrikant.</td></tr><tr><td>Petrischaal</td><td>Corning</td><td>CLS351029</td><td>Kan worden vervangen door vergelijkbare producten van elke fabrikant.</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Invitrogen</td><td>AM9782</td><td>RNaseZap RNase Decontaminatie Oplossing is een oppervlakte-decontaminatie-oplossing die RNases bij contact vernietigt&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Veerschaar (microdissectieschaar)</td><td>F.S.T</td><td>15020-15</td><td>Kan worden vervangen door vergelijkbare instrumenten van elke fabrikant.</td></tr><tr><td>Stereozoommicroscoop</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>Elke dissectiemicroscoop is geschikt</td></tr></tbody></table>

het behouden van de pijnappelklier in perinatale preparaten van de muizenhersenen

Preserving the Pineal Gland in Perinatal Mouse Brain Preparations

De pijnappelklier, een neuroendocriene structuur die melatonine uitscheidt, ontstaat uit een aanleg op de dorsale middellijn in de embryonale voorhersenen. Op embryonale dag (E) 14.5 bij de muis is een pineale divertikel zichtbaar die uitstulpt uit het dak van het diencephalon tussen de gepaarde telencefale blaasjes. Deze divertikel is in nauw contact met het overliggende kraakbeen-, meningeale en vasculaire weefsel. De structuur gaat gemakkelijk verloren wanneer de schedelkap wordt geopend om de hersenen te extraheren in late embryonale of vroege postnatale stadia. Ondanks de belangrijke neuroendocriene rol blijft de vroege ontwikkeling van de pijnappelklier en de signaleringsmechanismen die dit proces reguleren onvoldoende begrepen, mede door de moeilijkheid om deze structuur intact te behouden tijdens de embryonale stadia van de ontwikkeling van de muizenhersenen.
Dit artikel presenteert een innovatieve dissectieprocedure die de pijnappelklier behoudt, terwijl de structurele integriteit en de aanhechting aan het dak van het diencefalon bewaard blijven tijdens de isolatie van de hersenen van embryonale stadia tot postnatale dag (P) 7. De procedure wordt gedemonstreerd met een E18.5 muizenbrein en is daarom geschikt voor downstream-toepassingen die behoud van de weefselarchitectuur vereisen, waaronder in situ hybridisatie, immunohistochemie en ruimtelijke transcriptomics. Het protocol kan ook worden gebruikt om de in ontwikkeling zijnde pijnappelklier te isoleren, waardoor de specifieke representatie van de pijnappelklier in transcriptomische en proteomische analyses wordt verbeterd, wat anders uitdagend is vanwege de geringe omvang.

Dit dissectieprotocol maakt een consistente isolatie mogelijk van embryonale en vroeg postnatale muizenhersenen van E16.5–P7, waarbij de pijnappelklier in zijn natuurlijke anatomische positie behouden blijft (Figuur 1).
Stapsgewijze verwijdering van het chondrocranium, gecombineerd met zorgvuldige verwijdering van meningeale en vasculaire aanhechtingen, voorkomt onbedoelde schuifspanning op de pijnappelklier. Bovendien zorgt gecontroleerde doorsnijding van de sinus sagittalis superior (SSS) aan het rostrale uiteinde, samen met bilaterale incisies in de sinus transversus (TS), voor een effectieve ontspanning van het dorsale vasculaire netwerk. Dit beschermt de pijnappelklier tegen afscheuring tijdens de daaropvolgende extractie van de hersenen. Hierdoor blijft de pijnappelklier intact en verbonden met de diencephalische middenlijn na isolatie van de hersenen uit de schedelholte (Figuur 2A).
Om de integriteit van de geconserveerde pijnappelklier en de geschiktheid voor downstream-toepassingen te testen, werden in situ hybridisatie voor de pijnappelkliermarker Crx en immunohistochemie voor het CRX-eiwit uitgevoerd9,10(Figuur 2B–D). Dit bevestigde de identiteit en structurele integriteit van de pijnappelklier.
Het dissectieprotocol is gevalideerd over meerdere ontwikkelingsstadia, waarbij de pijnappelklier in de grote meerderheid van de pogingen intact bleef: E16.5 (N = 10), E18.5 (N = 15), P0 (N = 10) en P7 (N = 6). Dit demonstreert dat de methode robuust en zeer reproduceerbaar is voor het behoud van de pijnappelklier tijdens de isolatie van de embryonale en vroege postnatale hersenen (Figuur 2E).
<img alt="Diagram van de microdissectietechniek: proces van verwijdering van het chondrocranium met gebruik van pincetten en scharen." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71934/71934fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1789444946000" data-alt="Figuur 1"> 
Figuur 1: Stillbeelden uit de video die de stapsgewijze procedure tonen voor de isolatie van een E18.5 muizenbrein, waarbij de pijnappelklier intact blijft. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71934/71934fig1largev2.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Anatomie van het brein van een muis op E18.5; aanhechting van de pijnappelklier, diagram van een coronale sectie, Crx-expressie, DAPI/CRX." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71934/71934fig2.jpg" data-altupdatedat="1789444946000" data-alt="Figuur 2"> 
Figuur 2: Representatieve resultaten. (A) Representatieve voorbeelden van twee muizenbreinen op E18.5 waarbij de pijnappelklier is losgekoppeld tijdens de standaard dissectieprocedure (links), vergeleken met een brein waarbij de pijnappelklier intact is gebleven met behulp van de beschreven methode (rechts). (B) Schematische weergave van een coronale sectie op E18.5 waarin de pijnappelklier in roze is weergegeven. (C) In situ hybridisatie voor Crx op E16.5 en E18.5, die pijnappelklier-specifieke expressie aantoont. (D) Immunokleuring voor CRX op E18.5. (E) Staafdiagram dat de succespercentages (brein geïsoleerd met intacte pijnappelklier) en faalpercentages (pijnappelklier beschadigd of verloren) van het protocol toont bij embryonale (E16.5 en E18.5) en postnatale (P0 en P7) ontwikkelingsstadia. Schaalbalken: 100 µm. N = 6 biologische replica's voor A, C en D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71934/71934fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Hier presenteren we een dissectieprotocol dat de pijnappelklier behoudt, die vaak verloren gaat wanneer de hersenen uit de schedelholte worden verwijderd. Dit protocol waarborgt het behoud van de pijnappelklier in embryonale en vroege postnatale muizenhersenenpreparaten voor downstream-toepassingen, waaronder immunohistochemie, in situ hybridisatie en ruimtelijke transcriptomica.

Het behouden van de pijnappelklier in perinatale preparaten van de muizenhersenen

De pijnappelklier, een neuroendocriene structuur die melatonine afscheidt, vormt zich uit een aanleg op de dorsale middenlijn in de embryonale voorhersenen. Bij embryonale...

preserving-the-pineal-gland-in-perinatal-mouse-brain-preparations

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Ondanks de functionele en medische belang van de...

Genetische Manipulatie van de muis Ontwikkelen Hypothalamus via<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporatie

Dopaminerge neuronen spelen een essentiële regulerende rol in de hersenen. Hun verlies wordt geassocieerd met de ziekte van Parkinson. In deze video laten we zien hoe je primaire culturen van centrale dopaminerge neuronen kunt genereren vanuit embryonaal muizen mesencephalon. Dergelijke culturen zijn nuttig om de extreme kwetsbaarheid van deze neuronen voor verschillende stressfactoren te bestuderen.

Primaire Cultuur van de Muis dopaminerge neuronen

Een protocol om een co-cultuursysteem te genereren dat bestaat uit neuronen afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's), primaire corticale neuronen en astrocyten wordt beschreven. Dit co-cultuursysteem maakt detectie mogelijk van de vorming van synaptische contacten en circuits tussen nieuwe, iPSC-afgeleide neuronen en reeds bestaande corticale neuronen die channelrhodopsine-2 tot expressie brengen.

Een optogenetische Aanpak voor het beoordelen van de vorming van neuronale verbindingen in een co-cultuur systeem

Hypoxisch-ischemische encefalopathie na perinatale asfyxie kan worden bestudeerd met behulp van diermodellen. We tonen de procedures die nodig zijn voor het opzetten van een biggenmodel van neonatale hypoxisch-ischemische encefalopathie.

Een Knorretje Model van Neonatale hypoxisch-ischemische encefalopathie

Dit protocol beschrijft in detail hoe specifiek te transfecteren verschillende regio's in het centrale zenuwstelsel van C57BL/6 via in utero elektroporatie. Inbegrepen in dit protocol zijn gedetailleerde instructies voor transfecties van regio's die zich ontwikkelen tot de cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, laterale septumkern en striatum.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Laterale Septal Nucleus- en Striatum-specifieke<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporatie in de C57BL / 6 muis

We presenteren een protocol om te ontleden slijmachtige klieren en bereiden van hypofyse coronale secties van het ontwikkelen van muizen.

Dissectie en coronale segment voorbereiding van de ontwikkeling van de hypofyse muis

Dit artikel demonstreert hoe de muis embryonale hindbrain kan worden gebruikt als een model voor het bestuderen van ontwikkelingsstoornissen neurogenese in zowel hele organen en weefsel sectie preparaten.

De muis Hindbrain als een Model voor het bestuderen van embryonale neurogenese

De combinatie van transmissie-elektronenmicroscopie en in de baarmoeder transductie is een krachtige aanpak voor het bestuderen van morfologische veranderingen in de fijne ultrastructuur van het zenuwstelsel in ontwikkeling. Deze gecombineerde methode kunt diep inzicht in veranderingen in structurele bijzonderheden Neuroplasticiteit met betrekking tot hun topografische vertegenwoordiging.

Beoordeling van ultrastructurele Neuroplasticiteit Parameters na In Utero transductie van de ontwikkelingslanden muis hersenen en ruggenmerg

Hier presenteren we een protocol, ontworpen om gebruik te maken van chemogenetische hulpmiddelen om de activiteit van corticale Interneuron voorlopercellen getransplanteerd in de cortex van vroege postnatale muizen te manipuleren.

Transplantatie van Chemogenetisch gemanipuleerde corticale Interneuron progenitors in vroege postnatale Muizenhersenen

Een protocol voor het uitvoeren van lijntracering en functionele genetische analyse van kandidaat-genen op een celniveau met behulp van mozaïekanalyse met dubbele markers (MADM) wordt gepresenteerd. MADM kloonanalyse biedt een kwantitatief kader om het proliferative gedrag, cellulaire output en afstammingsrelatie van individuele voorlopers en hun dochtercellen te meten.

Lineage Tracing en klonnale analyse in het ontwikkelen van cerebrale cortex met behulp van Mozaïek Analyse met dubbele markers (MADM)

Dit protocol beschrijft methoden voor het doorsnijden, kleuren en afbeelden van vrij zwevende weefselsecties van de muizenhersenen, gevolgd door een gedetailleerde beschrijving van de analyse van het astrocytengebiedvolume en astrocytengebied overlap of tegels.

Analyse van astrocytengebiedvolume en tegels in dikke vrij zwevende weefselsecties

Dit protocol beschrijft methoden voor het uitvoeren van magnetische resonantie beeldvorming, clearing en immunolabeling van intacte muizenhersenen met behulp van iDISCO +, gevolgd door een gedetailleerde beschrijving van beeldvorming met behulp van light-sheet microscopie en downstream analyses met behulp van NuMorph.

Whole-Brain Single-Cell Imaging en Analyse van Intacte Neonatale Muizenhersenen Met behulp van MRI, Tissue Clearing en Light-Sheet Microscopie

Tata Institute of Fundamental Research.  Here we present a dissection protocol that preserves the pineal gland, which is often lost when the brain is removed from the cranial vault. This protocol ensures retention of the pineal gland in embryonic and early postnatal mouse brain preparations for downstream applications, including immunohistochemistry, in situ hybridization, and spatial transcriptomics.

Het behouden van de pijnappelklier in perinatale preparaten van de muizenhersenen

Meer video's verkennen