Name: Levende-cel beeldvorming en single-cel tracking om klonale dynamiek en lotsovergangen in menselijke en muisachtige intestinale organoïden te monitoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Leer levende-cel beeldvorming en single-cel tracking om klonale dynamiek en lotsovergangen in menselijke en muisachtige intestinale organoïden te monitoren. Deze methode ondersteunt onderzoek naar epitheelbiologie en ziekte.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<ol>
	<li>Barker N, et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 2007;449(7165):1003-7.</li>
	<li>Clevers H. Shifting paradigms in tissue stem cell biology: insights from the intestine. Cell. 2026;189(3):706-24.</li>
	<li>Betjes MA, Kok RNU, Tans SJ, van Zon JS. Cell tracking with accurate error prediction. Nat Methods. 2025;22(11):2400-10.</li>
	<li>Sato T, et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 2009;459(7244):262-5.</li>
	<li>Sato T, et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett&#39;s epithelium. Gastroenterology. 2011;141(5):1762-72.</li>
	<li>He GW, et al. Optimized human intestinal organoid model reveals interleukin-22-dependency of Paneth cell formation. Cell Stem Cell. 2022;29(9):1333-45.e6.</li>
	<li>Artegiani B, et al. Fast and efficient generation of knock-in human organoids using homology-independent CRISPR-Cas9 precision genome editing. Nat Cell Biol. 2020;22(3):321-31.</li>
	<li>Celotti M, et al. Protocol to create isogenic disease models from adult stem cell-derived organoids using next-generation CRISPR tools. STAR Protoc. 2024;5(3):103189.</li>
	<li>Krueger D, et al. Epithelial tension controls intestinal cell extrusion. Science. 2025;389(6764).</li>
	<li>Buissant des Amorie JR, et al. Intestinal tuft cell subtypes represent successive stages of maturation driven by crypt-villus signaling gradients. Nat Commun. 2025;16(1):6765.</li>
	<li>Huang L, et al. Tuft cells act as regenerative stem cells in the human intestine. Nature. 2024;634(8035):929-35.</li>
	<li>Wang D, et al. Interferon-responsive intestinal BEST4/CA7+ cells are targets of bacterial diarrheal toxins. Cell Stem Cell. 2025;32(4):598-612.e5.</li>
	<li>Jain A, et al. Morphodynamics of human early brain organoid development. Nature. 2025;644(8078):1010-9.</li>
	<li>Krotenberg Garcia A, van Rheenen J, Suijkerbuijk SJE. Generation of mixed murine organoids to model cellular interactions. STAR Protoc. 2021;2(4):100997.</li>
	<li>Krotenberg Garcia A, et al. Active elimination of intestinal cells drives oncogenic growth in organoids. Cell Rep. 2021;36(1):109307.</li>
	<li>Serra D, et al. Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development. Nature. 2019;569(7754):66-72.</li>
	<li>de Medeiros G, et al. Multiscale light-sheet organoid imaging framework. Nat Commun. 2022;13(1):4864.</li>
	<li>Huelsz-Prince G, et al. Mother cells control daughter cell proliferation in intestinal organoids to minimize proliferation fluctuations. eLife. 2022;11.</li>
	<li>Zheng X, et al. Organoid cell fate dynamics in space and time. Sci Adv. 2023;9(33).</li>
	<li>Okkelman IA, Foley T, Papkovsky DB, Dmitriev RI. Live cell imaging of mouse intestinal organoids reveals heterogeneity in their oxygenation. Biomaterials. 2017;146:86-96.</li>
	<li>Gros A, et al. A quantitative pipeline for whole-mount deep imaging and analysis of multi-layered organoids across scales. eLife. 2026;14.</li>
	<li>Nagarajan S, Naganathan SR. Pushing the limits of automated cell tracking. Nat Methods. 2025;22(11):2236-8.</li>
	<li>Kok RNU, et al. OrganoidTracker: efficient cell tracking using machine learning and manual error correction. PLoS One. 2020;15(10).</li>
	<li>Martinez-Silgado A, et al. Differentiation and CRISPR-Cas9-mediated genetic engineering of human intestinal organoids. STAR Protoc. 2022;3(3):101639.</li>
	<li>van der Linden FH, Okkelman IA, Ioannou M, Dmitriev RI. A turquoise fluorescence lifetime-based biosensor for quantitative imaging of intracellular calcium. Nat Commun. 2021;12(1):7159.</li>
	<li>Okkelman IA, Foley T, Papkovsky DB, Dmitriev RI. Extracellular Ca2+-sensing fluorescent protein biosensor based on a collagen-binding domain. ACS Appl Bio Mater. 2020;3(8):5310-21.</li>
	<li>Nguyen NTB, et al. Lactate controls cancer stemness and plasticity through epigenetic regulation. Cell Metab. 2025;37(4):903-19.e10.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>A83-01</td><td>Tocris&nbsp;</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Accutase Cell Detachment Solution</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104-500</td><td></td></tr><tr><td>Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12 (Advanced DMEM/F12)</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp;12634-010</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-bl-05</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer (40um)&nbsp;</td><td>Greiner Bio-one</td><td>542140</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004-base</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td>met klimaatregeling voor temperatuur en CO2</td></tr><tr><td>Cultrex Basement Membrane Extract (BME)</td><td>R&amp;D Systems, Bio-Techne</td><td>3533-001-02</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>open source</td><td></td><td>open source https://imagej.net/software/fiji/</td></tr><tr><td>Glass bottom plates</td><td>CellVis</td><td>P24-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylcysteine</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>NEPA electroporation system</td><td>NEPAGENE</td><td>NEPA21</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>NucSpot Live</td><td></td><td></td><td>ver-rood levende cel-nucleaire kleurstof</td></tr><tr><td>Noggin conditioned medium (U-Protein Express)</td><td>IPA Therapeutics</td><td>N002</td><td></td></tr><tr><td>OrganoidTracker</td><td>open source</td><td></td><td>open source https://organoidtracker.org/</td></tr><tr><td>p2T-CAG-mT2TP</td><td>zelfgemaakt</td><td></td><td>protocol om het plasmide te genereren DOI: 10.1126/science.adr8753</td></tr><tr><td>p2T-H2B-iRFP-IRES-PuroR</td><td>zelfgemaakt</td><td></td><td>protocol om het plasmide te genereren DOI: 10.1126/science.adr8753</td></tr><tr><td>p2T-H2B-mCherry-IRES-BlastR&nbsp;</td><td>zelfgemaakt</td><td></td><td>protocol om het plasmide te genereren DOI: 10.1126/science.adr8753</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11548876</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-05</td><td></td></tr><tr><td>Prostaglandin E2</td><td>Tocris&nbsp;</td><td>2296</td><td></td></tr><tr><td>puromycin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pr</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human IL-22</td><td>Peprotech</td><td>200-22</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human R-spondin 1</td><td>Thermo Fisher</td><td>120-38-5UG</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant murine EGF</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>315-09-500UG</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant murine Noggin</td><td>Thermo Fisher</td><td>250-38-100UG</td><td></td></tr><tr><td>R-spondin conditioned medium (U-Protein Express)</td><td>IPA Therapeutics</td><td>R001</td><td></td></tr><tr><td>SiR-DNA</td><td></td><td></td><td>ver-rood levende cel-DNA kleurstof</td></tr><tr><td>SB202190 (p38 inhibitor)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>S7076</td><td></td></tr><tr><td>Suspension plate for organoid culture</td><td>Greiner</td><td>665102</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Wnt surrogate</td><td>U-Protein Express</td><td>&nbsp;op bestelling</td><td></td></tr><tr><td>Wnt3A conditioned medium</td><td>zelfgemaakt</td><td></td><td>De productie van Wnt3A geconditioneerd medium vindt u hier:&nbsp; https://doi.org/10.1002/cpim.106</td></tr><tr><td>Y-27632 dihydrochloride</td><td>Abmole Bioscience</td><td>M1817</td><td></td></tr></tbody></table>

levende-cel beeldvorming en single-cel tracking om klonale dynamiek en lotsovergangen in menselijke en muisachtige intestinale organoïden te monitoren

Live-Cell Imaging and Single-Cell Tracking to Monitor Clonal Dynamics and Fate Transitions in Human and Murine Intestinal Organoids

Levende-cel beeldvorming en single-cel tracking om klonale dynamiek en lotsovergangen in menselijke en muisachtige intestinale organoïden te monitoren

The intestinal epithelium undergoes rapid self-renewal through stem cell division, cell differentiation, and migration. Understanding how individual cells ...

Ons onderzoek richt zich op de studie naar hoe individuele cellen hun lot beslissen en hun gedrag coördineren binnen het zelfvernieuwende darmepitheel. Lichtmicroscopie kan een alomtegenwoordige marker, zoals het membraancompartiment van een cel of het cytoskelet, niet onderscheiden en daardoor niet feitelijk toeschrijven aan één specifieke cel of aan de naburige cellen. Mozaïekorganoïden kunnen echter helpen om deze beperking te overwinnen.Begin met het verkrijgen van de benodigde reagentia en de gevalideerde muis- en humane fluorescerende reporter-intestinale organoïdlijnen. Passeer beide organoïdlijnen drie dagen vóór de generatie van mozaïekorganoïden in met Wnt geconditioneerd medium om de expansie van stamcellen te bevorderen en de celviabiliteit tijdens de dissociatie te maximaliseren. Bereid 5% BME in DMEM voor. Coat elke put van een 48-wells plaat met 20 µL van de bereide BME om een dunne adhesielaag voor celhechting te vormen, en incubeer vervolgens gedurende één uur bij 37 °C. Los daarna de BME op door ijskoud basismedium toe te voegen. Verzamel de organoïden van elke lijn afzonderlijk door centrifugatie bij 300 g gedurende vijf minuten bij 4 °C. Dissocieer de organoïden tot enkelvoudige cellen door ze vijf tot zeven minuten te incuberen in een enzymatische celdetachementoplossing in een waterbad bij 37 °C. Gebruik een P1000-pipet om de suspensie herhaaldelijk te pipetteren ter ondersteuning van de mechanische dissociatie. Controleer de dissociatie onder een lichtveldmicroscoop. Stop de reactie door een overmaat aan ijskoud basismedium toe te voegen wanneer hoofdzakelijk enkelvoudige cellen of kleine organoïdfragmenten van 2 tot 10 cellen zichtbaar zijn. Pellet vervolgens de cellen door centrifugatie bij 300 g gedurende vijf minuten bij 4 °C. Beoordeel de celviabiliteit en tel de levensvatbare cellen met behulp van trypaanblauw-exclusie. Combineer de twee celpopulaties in de gewenste ratio om een totaal van 300.000 cellen te verkrijgen in 500 µL Wnt-geconditioneerd medium, aangevuld met 10 µM Y-27632 dihydrochloride voor muis-mozaïekorganoïden, of humaan expansiemedium voor humane mozaïekorganoïdkweken. Meng grondig door voorzichtig te pipetteren. Verwijder vervolgens het coatingmedium uit de 48-wells platen en zaai de celsuspensie uit in de gecoate putten. Centrifugeer de plaat bij 200 g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur en incubeer bij 37 °C. Bereid een P200-pipetpunt voor door deze te buigen. Detacheer na 24 uur de cellaag mechanisch door te schrapen met de gebogen pipetpunt en spoel vervolgens grondig door met ijskoud basismedium. Verzamel de gedetacheerde aggregaten door centrifugatie bij 300 g gedurende drie minuten bij 4 °C, zonder extra mechanische afschuiving. Resuspendeer de aggregaten in BME en breng ze over naar imaging-compatibele monsterdragers. Cultiveer de uitgezaaide aggregaten in ENR-medium voor muis-mozaïekorganoïden en in humaan expansiemedium voor humane mozaïekorganoïden.Gebruik imagingkamers met een glazen bodem om optische compatibiliteit met confocale objectieven met een hoge numerieke apertuur te garanderen. Verdeel de organoïde-BME-suspensie als een dunne koepel nabij het centrum van de glazen bodem. Incubeer de plaat bij 4 °C gedurende 5 tot 10 minuten zodat de organoïden door zwaartekracht naar de glazen bodem zakken. Verplaats de plaat naar 37 °C en laat de BME 20 tot 30 minuten stollen. Voeg 500 µL voorverwarmd groeimedium toe aan elke put. Laat de organoïden minstens 24 uur herstellen en hun morfologie vestigen voordat de live-imaging wordt gestart. Neem long-term time-lapse-beelden op en voer single-cell tracking en lineage-reconstructie uit voor verdere analyse.Een succesvolle mozaïekvorming werd gekenmerkt door ofwel een "salt-and-pepper"-distributie of door gedefinieerde grenzen tussen de twee populaties, afhankelijk van de gebruikte graad van dissociatie. Grondige dissociatie van enkelvoudige cellen leidde tot salt-and-pepper-mozaïeken, terwijl een milde fragmentatie kleine clonale clusters behield. Wanneer niet-gelabelde naburige cellen een individuele cel omringen die een reporter van belang co-expressieert, kunnen de cytoskeletale dynamieken tijdens migratie, deling of extrusie eenduidig aan die specifieke cel worden toegeschreven. Nucleaire H2B-reporters vergemakkelijkten de identificatie van informatieve celconstellaties binnen het mozaïek, en per-cel metingen, zoals de levensduurdeling-rate en de dynamiek van de reporterintensiteit, werden uit de trackinggegevens geëxtraheerd. Bekercellen activeerden en behielden een hoge MUC2-mNeonGreen-expressie gedurende de gehele beeldvormingsperiode, terwijl Paneth-cellen een initiële MUC2-mNeonGreen-activatie vertoonden, gevolgd door een progressieve afname van het signaal en een daaropvolgende DEFA5-dsRed-activatie. Single-cell kwantificatie bevestigde deze sequentiële transitie op het niveau van individuele cellen. Gemiddelde intensiteitscurven over meerdere getrackte cellen bevestigden dat dit patroon consistent was op populatieniveau, waarbij Paneth-celprecursoren een karakteristieke inverse relatie vertoonden tussen MUC2-mNeonGreen- en DEFA5-dsRed-signalen.Dit protocol stelt onderzoekers in staat om te bestuderen hoe een individuele cel zijn cytoskelet remodelleert, bijvoorbeeld tijdens de deling, tijdens migratie, of bijvoorbeeld tijdens extrusie in een intact weefsel. Een belangrijk aandachtspunt is de keuze van de labelingsverhouding, aangezien schaarse reportercellen signalen van individuele cellen isoleren, terwijl schaarse, niet-gelabelde cellen de reacties van de omgeving onthullen. Toekomstige studies kunnen fate-reporters combineren met mozaïeklabeling in één organoïde om fate-beslissingen te koppelen aan de dynamiek van het cytoskelet op single-cell niveau.

live-cell-imaging-single-cell-tracking-to-monitor-clonal-dynamics

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Tracking Dynamica van Muscle innesteling in kleine dieren door In Vivo TL-Imaging

Een methode wordt beschreven om enkele cellen met een gekooide fluorescerend eiwit met behulp van twee-foton absorptie van een Ti photoactivate: Sapphire femtoseconde laser oscillator. Het lot kaart brengen van de gefotoactiveerd cel, wordt immunohistochemie gebruikt. Deze techniek kan worden toegepast op elk celtype.

Single Cell Fate Mapping in de zebravis

In dit videoprotocol geven we een stapsgewijze uitleg van lentivirale transductie in organoïden van primair darm epitheel en van verwerking en downstream analyse van deze culturen door kwantitatieve RT-PCR, RNA-microarray en immunohistologie.

Een protocol voor Lentiviral Transduction en Downstream Analyse van Intestinale Organoids

Protocollen voor de kweek van humane navelstrengveneuze endotheelcellen (HUVEC), tijdelijke transfectie van fluorescerend gelabelde markers van microtubulusgroei, beeldvorming van levende cellen en geautomatiseerde analyse van interfase-microtubulusgroeidynamiek worden gedetailleerd beschreven.

Hoge-resolutie time-lapse beeldvorming en geautomatiseerde analyse van de dynamiek van microtubuli in Living humane navelstreng endotheelcellen

Hier presenteren we live-celbeeldvorming die een niet-toxische microscopie methode is die onderzoekers in staat stelt om eiwit gedrag en nucleaire dynamiek in levende splijting gistcellen te bestuderen tijdens mitose en meiosis.

Onderzoek van de kern dynamiek van de mitotische en Meiotische splijtstof gist door fluorescentie-Live-cel microscopie

Hier presenteren we een protocol om de dynamiek van spindel vorming en mitotische progressie te beoordelen. Onze toepassing van time-lapse Imaging stelt de gebruiker in staat om cellen te identificeren in verschillende stadia van mitose, sporen en identificeren mitotische defecten, en analyseren spil dynamiek en mitotische cel lot bij blootstelling aan anti-mitotische drugs.

Live Cell Imaging om de dynamiek van de metafase timing en het lot van de cel na de mitotische spindel perturbations te beoordelen

De gehele 3D-structuur en cellulaire inhoud van organoïden, evenals hun fenotypische gelijkenis met het oorspronkelijke weefsel kan worden vastgelegd met behulp van de single-cell resolutie 3D imaging protocol hier beschreven. Dit protocol kan worden toegepast op een breed scala van organoïden variërend in oorsprong, grootte en vorm.

Single-Cell Resolutie driedimensionale beeldvorming van intacte organoïden

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor een fluorescentiebeeldvormingsbenadering, multiplex immunofluorescent cell-gebaseerde detection van DNA, RNA en protein (MICDDRP), een methode die in staat is tot gelijktijdige fluorescentie eencellige visualisatie van virale eiwitten en nucleïnezuren van verschillende type en gestrandheid. Deze aanpak kan worden toegepast op een breed scala aan systemen.

Eencellige multiplexed fluorescentie beeldvorming om virale nucleïnezuren en eiwitten te visualiseren en HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika-virus en influenza-infectie te controleren

We presenteren een methode voor het verkrijgen van fluorescentie reporter tijdcursussen van enkele cellen met behulp van micropatterned arrays. Het protocol beschrijft de voorbereiding van eencellige arrays, de installatie en werking van live-cell scanning time-lapse microscopie en een open-source beeldanalysetool voor geautomatiseerde voorselectie, visuele controle en tracking van celgeïntegreerde fluorescentietijdcursussen per adhesieplaats.

Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) - een veelzijdige techniek om cellulaire kinetiek te kwantificeren

Het huidige protocol beschrijft een methode om reactieve zuurstofsoorten (ROS) in de intestinale muriene organoïden te detecteren met behulp van kwalitatieve beeldvorming en kwantitatieve cytometrie-assays. Dit werk kan mogelijk worden uitgebreid naar andere fluorescerende sondes om het effect van geselecteerde verbindingen op ROS te testen.

Analyse van oxidatieve stress in murine intestinale organoïden met behulp van reactieve zuurstof soortgevoelige fluorogene sonde

Leer levende-cel beeldvorming en single-cel tracking om klonale dynamiek en lotsovergangen in menselijke en muisachtige intestinale organoïden te monitoren. Deze methode ondersteunt onderzoek naar epitheelbiologie en ziekte.

Levende-cel beeldvorming en single-cel tracking om klonale dynamiek en lotsovergangen in menselijke en muisachtige intestinale organoïden te monitoren (Video) | JoVE Journal

Levende-cel beeldvorming en single-cel tracking om klonale dynamiek en lotsovergangen in menselijke en muisachtige intestinale organoïden te monitoren

Meer video's verkennen