ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol>
	<li>Alberti S. Phase separation in biology. Curr Biol. 2017;27(20):R1097-102.</li>
	<li>Rabouille C, Alberti S. Cell adaptation upon stress: the emerging role of membrane-less compartments. Curr Opin Cell Biol. 2017;47:34-42.</li>
	<li>Boeynaems S, et al. Protein phase separation: a new phase in cell biology. Trends Cell Biol. 2018;28(6):420-35.</li>
	<li>Hyman AA, Weber CA, J&#252;licher F. Liquid-liquid phase separation in biology. Annu Rev Cell Dev Biol. 2014;30:39-58.</li>
	<li>Banani SF, Lee HO, Hyman AA, Rosen MK. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nat Rev Mol Cell Biol. 2017;18(5):285-98.</li>
	<li>Patel A, et al. A liquid-to-solid phase transition of the ALS protein FUS accelerated by disease mutation. Cell. 2015;162(5):1066-77.</li>
	<li>Shen Y, et al. The liquid-to-solid transition of FUS is promoted by the condensate surface. Proc Natl Acad Sci U S A. 2023;120(33):e2301366120.</li>
	<li>Brocca S, Grandori R, Longhi S, Uversky V. Liquid-liquid phase separation by intrinsically disordered protein regions of viruses: roles in viral life cycle and control of virus-host interactions. Int J Mol Sci. 2020;21(23):9045.</li>
	<li>Scoca V, Di Nunzio F. Membraneless organelles restructured and built by pandemic viruses: HIV-1 and SARS-CoV-2. J Mol Cell Biol. 2021;13(4):259-68.</li>
	<li>Su J, Wilson M, Samuel C, Ma D. Formation and function of liquid-like viral factories in negative-sense single-stranded RNA virus infections. Viruses. 2021;13(1):126.</li>
	<li>Etibor TA, Yamauchi Y, Amorim MJ. Liquid biomolecular condensates and viral lifecycles: review and perspectives. Viruses. 2021;13(3):366.</li>
	<li>Guseva S, et al. Measles virus nucleo- and phosphoproteins form liquid-like phase-separated compartments that promote nucleocapsid assembly. Sci Adv. 2020;6(14):eaaz7095.</li>
	<li>Emmanouilidis L, et al. NMR and EPR reveal a compaction of the RNA-binding protein FUS upon droplet formation. Nat Chem Biol. 2021;17(5):608-14.</li>
	<li>Kathe NC, Novakovic M, Allain FHT. Buffer choice and pH strongly influence phase separation of SARS-CoV-2 nucleocapsid with RNA. Mol Biol Cell. 2024;35(5):ar73.</li>
	<li>Novakovic M, Schmoll J, Emmanouilidis L, Allain FHT. Using solution NMR to characterize biomolecular condensates under biphasic conditions. J Vis Exp. 2026;(230):e70530.</li>
	<li>Novakovic M, et al. LLPS REDIFINE allows the biophysical characterization of multicomponent condensates without tags or labels. Nat Commun. 2025;16(1):4628.</li>
	<li>Emmanouilidis L, et al. A solid beta-sheet structure is formed at the surface of FUS droplets during aging. Nat Chem Biol. 2024;20(8):1044-52.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1.5 mL tubes</td><td>elke merk is OK</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>18-well kamerschijven</td><td>ibidi</td><td>81816</td><td>voor STORM</td></tr><tr><td>agarose, lage geltemperatuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td>moleculaire biologie kwaliteit</td></tr><tr><td>agarose, ultra zuiver&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>kanaalschijven</td><td>ibidi</td><td>80606</td><td>voor microscopie</td></tr><tr><td>confocale microscoop</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cy5-kleurstof, NHS chemie</td><td>Jena Biosciences</td><td>FP-201-CY5</td><td>voor het labelen van eiwitten</td></tr><tr><td>D2O (deuteriumoxide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>easyFRAP</td><td>Koulouras et al. 2018</td><td>N/A</td><td>https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29901776/</td></tr><tr><td>Everspark 2.0 dSTORM buffer</td><td>idylle</td><td>KMO|ETE+</td><td></td></tr><tr><td>FUS NTD-eiwit</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>recombinant geëxpresseerd in ons lab, zoals beschreven in ref 13 (Emmanouilidis et al. Nat Chem Biol 2021)</td></tr><tr><td>verwarmingsblok of waterbad</td><td>elke merk is OK</td><td>N/A</td><td>elke fabrikant of model is voldoende</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>beeldanalysesoftware</td><td>Fiji</td><td>N/A</td><td>https://fiji.sc/</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NMR-spectrometer</td><td>Bruker</td><td>N/A</td><td>750 MHz, PATXI kamertemperatuur probe, zie ref 13 voor meer details (Emmanouilodis et al. Nat Chem Biol 2021)</td></tr><tr><td>NMR-buis</td><td>Bruker</td><td>N/A</td><td>3 mm, glas</td></tr><tr><td>P10, P20, P200 en P1000 pipetten</td><td>elke merk is OK</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pCp-Cy3-kleurstof&nbsp;</td><td>Jena Biosciences</td><td>NU-1706-CY3</td><td>voor het labelen van RNA</td></tr><tr><td>poly(A) RNA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>in ons lab in vitro getranscribeerd, lengte ca. 50 nucleotiden, zoals beschreven in Kathe et al. Mol Biol Cell 2024</td></tr><tr><td>s2m RNA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>in ons lab in vitro getranscribeerd, lengte 45 nucleotiden, sequentie: 5'-GGUUCACCGAGGCCACGCGGAGU ACGAUCGAGUGUACAGUGAACC-3', zoals beschreven in Kathe et al. Mol Biol Cell 2024</td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 nucleocapside-eiwit</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>recombinant geëxpresseerd in ons lab, zoals beschreven in Kathe et al. Mol Biol Cell 2024</td></tr><tr><td>software voor het plotten (bijv. R)</td><td>R-Project</td><td>Versie 4.2.1</td><td>https://www.r-project.org/</td></tr><tr><td>STORM-microscoop</td><td>Nikon N-STORM</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ThunderSTORM-plug-in</td><td>Ovesny et al. 2014</td><td>N/A</td><td>https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC4207427/</td></tr><tr><td>tips voor de gebruikte pipetten</td><td>elke merk is OK</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>TopSpin</td><td>Bruker</td><td>Versie 3.2 en 4.1</td><td></td></tr><tr><td>ureum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5128</td><td></td></tr></tbody></table>

stabiliserend eiwit en eiwit—rna condensaten in laagsmeltende agarosehydrogels voor kwantitatieve biofysische metingen

Stabilizing Protein and Protein&#8212;RNA Condensates in Low-Melting Agarose Hydrogels for Quantitative Biophysical Measurements

Stabiliserend eiwit en eiwit—RNA condensaten in laagsmeltende agarosehydrogels voor kwantitatieve biofysische metingen

Biomolecular condensates formed by liquid&#8211;liquid phase separation are increasingly recognized as fundamental organizational units of the cell, with ...

Ons onderzoek richtte zich op de ontwikkeling van een gestandaardiseerd agarose-inbeddingsprotocol om biomoleculaire condensaten in drie dimensies te immobiliseren, terwijl hun dynamische eigenschappen behouden blijven. Condensaten hebben de neiging om te bewegen, met elkaar te fuseren of aan oppervlakken te hechten, wat bepaalde metingen bemoeilijkt. Dit agarose-inbeddingsprotocol pakt deze beperkingen aan.Begin met het afwegen van de juiste hoeveelheid laagsmeltende of reguliere agarose en voeg dit toe aan een buisje van 1,5 milliliter met druppelbuffer. Verhit de agarose-voorraad tot 80 tot 90 °C in een heating block of waterbad en lossen de agarose volledig op door ongeveer 10 minuten te vortexen. Laat de agarose-voorraad in het heating block of waterbad equilibreren tot 37 °C voor laagsmeltende agarose, of tot 55 °C voor reguliere agarose.Verifieer dat de oplossing bij deze temperatuur helder en vloeibaar blijft. Controleer de temperatuur van de agarose-stockoplossing met een thermometer. Warm alle materialen die in direct contact komen met de agarose voor tot ongeveer 37 degrees Celsius door deze twee tot drie minuten op een warmteblok of in een incubator te plaatsen.Verzamel de benodigde reagentia om de druppelbuffer, de fase-scheidende componenten en aanvullende additieven voor de monsters voor te bereiden. Laat alle bereide oplossingen equilibreren tot kamertemperatuur. Bereken de benodigde volumes van de druppelbuffer, de agarose-stock, de fase-scheidende componenten en de aanvullende additieven voor het monster.Gebruik als startwaarden een uiteindelijke agaroseconcentratie van 0,3 tot 0,5% gewicht per volume voor standaard biofysische assays, en 0,8 tot 1,0% gewicht per volume voor experimenten voor stabilisatie op lange termijn. Voeg eerst de berekende volumes buffer en agarose toe, gevolgd door additieven en fase-scheidende componenten, in een voorverwarmde buis van 1,5 milliliter.Houd de buis in het warmteblok of waterbad en pipetteer het mengsel enkele keren op en neer, waarbij luchtbellen worden vermeden. Breng het monster met een pipet snel over op de microscopische objectglas. Laat het monster gedurende vijf tot 10 minuten bij kamertemperatuur geleren en meet het monster vervolgens volgens het standaard microscopieprotocol.Druppels gevormd met N-eiwit en poly-A in de aanwezigheid van 0,5% gewicht per volume laagsmeltende agarose waren na vijf minuten bij kamertemperatuur ongeveer dezelfde grootte als druppels gevormd zonder laagsmeltende agarose. 60 minuten na de monstervoorbereiding veranderden de in agarose ingebedde druppels niet van grootte, terwijl condensaten zonder laagsmeltende agarose een drastische toename in grootte vertoonden als gevolg van fusie en oppervlakbevochtiging. Het herstel na fotobleken (fluorescence recovery after photobleaching) en de schijnbare diffusie van de druppels waren zeer vergelijkbaar met en zonder laagsmeltende agarose.Dit protocol stelt onderzoekers in staat om druppels over grote tijdsintervallen te beelden en te kwantificeren, terwijl hun dynamische gedrag behouden blijft. De grootste uitdaging bij het uitvoeren van dit protocol is het correct krijgen van zowel de temperatuur van de agarose als de timing van het inkapselen. Eenmaal ingekapseld kunnen de condensaten worden bestudeerd met een breed scala aan microscopietechnieken of andere biofysische methoden, zoals NMR.

stabilizing-protein-proteinrna-condensates-low-melting-agarose

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

In deze video, tonen we de experimentele technieken die gebruikt worden om compliant, extracellulaire matrix (ECM) gecoate substraten geschikt voor celcultuur fabriceren, en die vatbaar zijn voor trekkracht microscopie en het observeren van de gevolgen van ECM stijfheid op cel gedrag.

Voorbereiding van de Klacht Matrices voor het kwantificeren van Cellular Contractie

This video demonstrates a denaturing polyacrylamide-based separation technique for proteins. This technique helps in the preliminary identification of proteins based on their molecular weights.

Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis for Protein Analysis: A Technique to Separate and Visualize Proteins Based on Molecular Weight

This video demonstrates the two-dimensional semi-denaturing detergent agarose gel electrophoresis-based separation of amyloid fibers. The technique separates the polymorphic amyloid aggregates based on their heterogeneous size.

Two-Dimensional Semi-Denaturing Agarose Gel Electrophoresis: A Technique to Separate Polymorphic Amyloids Fibers Based on Size Heterogeneity

In this video, we demonstrate a two-dimensional gel electrophoresis method that separates individual proteins from a complex protein mixture obtained from tumor tissues of human nonfunctional pituitary adenoma (NFPA). The proteins are separated based on their electric charge in the first dimension and further separated based on molecular weights in the second dimension.

Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis: A Separation Technique for Analysis of Proteins in Complex Protein Mixture Based on Charge and Molecular Weight

Traditionele technieken voor het vervaardigen polyacrylamide (PA) gels die fluorescente probes omvatten waartussen een gel tussen een hechtend oppervlak en een glasplaatje. Hier laten we zien dat deze dia bekleden met poly-D-lysine (PDL) en fluorescerende probes lokaliseert de probes binnen 1,6 urn uit het gel oppervlak.

Een nieuwe methode voor het lokaliseren van Reporter Fluorescent Beads Dichtbij de celkweek Surface voor Traction Force Microscopy

Een protocol wordt gepresenteerd voor de productie van tRNA (UUU) en de analyse van tRNA (UUU) in complex met het enzym TcdA door middel van agarose gel retardatie assays.

Proteïne-tRNA Agarose Gel Retardatie Assays voor de analyse van de<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -threonylcarbamoyladenosine TcdA-functie

Een nieuwe kracht-clamp reometrie techniek wordt gebruikt voor het onderzoeken van de mechanische eigenschappen van laag-volume op basis van eiwitten hydrogel monsters aangebonden tussen een spreekspoel motor en een kracht sensor. Een analoge evenredige-integraal-afgeleide (PID) systeem zorgt voor het 'klemmen' van de kracht ervaren om het gewenste protocol.

Kracht-Clamp reometrie voor het karakteriseren van de Hydrogels op basis van eiwitten

Een protocol is bedoeld om te snel testen van de thermische stabiliteit van eiwitten in een verscheidenheid van voorwaarden door middel van thermische shift testen en nano differentiële scanning van fluorimetrie. Buffer systemen, zouten en additieven, samen zijn bestaande uit drie unieke stabiliteit schermen, vehiculumcontrolegroep met eiwitten om te identificeren van geschikte buffers voor functionele en structurele studies.

Hoe te stabiliseren van eiwit: stabiliteit schermen voor thermische verschuiven Assays en Nano Differential Scanning fluorimetrie in het Virus-X-Project

Van veel intrinsiek ongeordende eiwitten is aangetoond dat ze deelnemen aan de vorming van zeer dynamische biomoleculaire condensaten, een gedrag dat belangrijk is voor tal van cellulaire processen. Hier presenteren we een op beeldvorming gebaseerde methode met één molecuul voor het kwantificeren van de dynamiek waarmee eiwitten met elkaar interageren in biomoleculaire condensaten in levende cellen.

Meting van de dynamiek van eiwitinteracties in biomoleculaire condensaten

Hier presenteren we protocollen voor NMR-methodologieën, REstricted DIFfusion of INvisible speciEs (REDIFINE) en CONdensate DEtectioN door SEmi-solid Magnetization Transfer (CONDENSE-MT), die labelvrije, kwantitatieve karakterisering van biomoleculaire condensaten onder biphasische omstandigheden mogelijk maken, waarmee moleculaire verdeling, uitwisselingsdynamiek, condensaathydratatie en druppelstructuur zonder sedimentatie of labeling aan het licht komen.

Gebruik van oplossings-NMR om biomoleculaire condensaten onder bifasische omstandigheden te karakteriseren

Hoewel de stijfheid van de extracellulaire matrix (ECM) een belangrijke regulator is van cellulair gedrag, blijven de onderliggende sensor- en transductiemechanismen onduidelijk. Om dit aan te pakken, bieden we protocollen aan voor het creëren van polyacrylamide- en siliconengebaseerde substraten met afstembare stijfheid, om ons begrip van cel-ECM-overklank te vergroten.

Generatie van polyacrylamide en siliconen extracellulaire matrixsubstraten met gedefinieerde stijfheid voor toepassingen in de celbiologie

ETH Zürich.  Hier presenteren we een robuuste methode om vloeistof-vloeistof fasegescheiden condensaten fysiek te immobiliseren binnen een poreuze, laagsmeltende agarosehydrogelmatrix zonder hun interne vloeistofdynamica te verstoren. De aanpak minimaliseert druppelsedimentatie, coalescentie en oppervlaktebevochtigde artefacten, waardoor reproduceerbare beeldvorming en kwantitatieve biofysische analyse over uren mogelijk zijn.

Stabiliserend eiwit en eiwit—RNA condensaten in laagsmeltende agarosehydrogels voor kwantitatieve biofysische metingen

Meer video's verkennen