Name: Het meten van het herstel van dubbelstrengs DNA-breuken met behulp van de DR-white-assay in Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-14T15:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Leer de DR-white-assay voor DNA-herstel in Drosophila melanogaster. Deze methode onderscheidt homologe recombinatie, NHEJ en SSA om reparatiemechanismen in meercellige organismen te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Deze methode is ontwikkeld terwijl J.R.L. een ontvanger was van een AFAR Research Grant van de American Federation for Aging Research.&#160;Dit werk werd ook ondersteund door het National Institute of General Medical Sciences (1R15GM110454 en 1R15GM129628) aan J.R.L. De figuren zijn ontwikkeld met behulp van BioRender (https://BioRender.com/b8sbcjp) 2026.

1. DR-white assay
<ol>
	<li>Genetische kruisingen (Figuur 3A) 
	OPMERKING: Raadpleeg voor standaardprotocollen voor de kweek en genetica van Drosophila &#34;Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics&#34; door Ralph J. Greenspan17. Informatie over het genotype van de stammen wordt verstrekt in de Table of Materials.
	<ol>
		<li>Houd de vliegen bij 25 °C met licht-/donkercycli van 12 u op standaard Drosophila-voedsel, bestrooid met actieve gist.</li>
		<li>Stel vijf heat shock-vials op door 8–10 DR-white maagdelijke vrouwtjes te kruisen met 3–5 mannetjes die een I-SceI-transgen dragen (Kruising 1, Figuur 3A) per vial. 
		OPMERKING: Afhankelijk van de toepassing kunnen verschillende I-SceI-transgenen worden gebruikt. In dit protocol werd het hsp70-I-SceI-transgen gebruikt voor heat shock-inductie11. Om lekke I-SceI-expressie in eerdere generaties te voorkomen, is het belangrijk om ervoor te zorgen dat DR-white en I-SceI-transgenen alleen in deze generatie in dezelfde vlieg worden gecombineerd.</li>
		<li>Stel op dezelfde dag expansieflesjes op van een y w-stam. Dit zullen de testervliegen zijn. Drie expansieflesjes zijn voldoende voor ongeveer 60–80 testerkruisingen.</li>
		<li>Kweek de heat shock-vials en y w-expansieflesjes 3 dagen lang bij 25 °C.</li>
		<li>Verplaats op de derde dag de heat shock-vials en y w-expansieflesjes naar vers voedsel om als reserveset te dienen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Heat shock/DSB-inductie 
	OPMERKING: Indien er geen gebruik wordt gemaakt van een heat-shock-induceerbaar I-SceI-transgen, ga dan direct naar stap 1.2.5, wat gewoonlijk 3 dagen na stap 1.1.5 gebeurt.
	<ol>
		<li>Laat de heat shock-vials 3 u rijpen bij 25 °C om ervoor te zorgen dat alle nakomelingen de materno-zygotische transitie hebben doorlopen.</li>
		<li>Voer de heat shock uit op de oorspronkelijke vials in een waterbad van 38 °C gedurende 1 u. Zorg ervoor dat het waterniveau ten minste gelijk is aan de onderkant van het wattenpropje, zodat larven niet boven de waterlijn kruipen.</li>
		<li>Controleer elke 15 min de temperatuur van het waterbad en houd deze binnen 38 ± 0,5 °C, omdat de inductie- en herstelresultaten afhankelijk zijn van de duur en temperatuur van de heat shock.</li>
		<li>Plaats de vials terug bij 25 °C.</li>
		<li>Voeg de volgende dag 1/3 van een gevouwen laboratoriumdoekje toe aan het voedsel om overtollig vocht te absorberen. Als het voedsel droog is, voeg dan ongeveer 100 µL water toe aan het laboratoriumdoekje. Voeg een wattenpropje toe aan de y w-expansieflesjes.</li>
		<li>Kweek de heat-shocked vials nog 6 dagen bij 25 °C, of tot de vliegen beginnen uit te komen (eclosie).</li>
		<li>Maak de reservevials en expansieflesjes 3 dagen na het verplaatsen leeg. Voeg ongeveer 4 dagen na het leegmaken een wattenpropje toe aan de reserve y w-expansieflesjes. 
		OPMERKING: Indien nodig kunnen reservevials worden onderworpen aan een heat shock zoals in stappen 1.2.1 tot en met 1.2.6 en worden verwerkt zoals hieronder beschreven.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Testerkruisingen
	<ol>
		<li>Verzamel de heat-shocked vliegen die de DR-white en I-SceI-transgenen dragen gedurende 4–5 dagen nadat de eclosie is begonnen, om bias door ontwikkelingsstadia te verminderen. 
		OPMERKING: Succesvol heat-shocked vliegen die het DR-white en I-SceI-transgen dragen, vertonen mozaïekogen als gevolg van embryonale en larvale herstelevenissen die zich hebben ontwikkeld tot volwassen weefsels. De mate van mozaïekvorming correleert niet altijd met herstelevenissen in de kiemlijn en mag daarom geen bepalende factor zijn bij het selecteren van experimentele vliegen voor testerkruisingen (stap 1.3.3).</li>
		<li>Verzamel gedurende 5 dagen maagdelijke y w-vrouwtjes. Verzamel 5 maagdelijke vrouwtjes per verwacht aantal monsters. Verzamel uit de reserve-expansieflesjes zodra ze beginnen uit te komen.</li>
		<li>Stel testervials op door één heat-shocked mannetje te kruisen met 4–5 maagdelijke y w-vrouwtjes (Kruising 2; Figuur 3A). Selecteer de mannetjes willekeurig uit de gezamenlijke collectie van stap 1.3.1 om bias door ontwikkelingsstadia te verminderen. Kweek de testerkruisingen bij 25 °C. 
		OPMERKING: Om overkruising van DR-white en I-SceI te voorkomen, worden meestal de mannelijke kiemlijnen geanalyseerd; vrouwelijke nakomelingen kunnen echter ook worden geanalyseerd. Bij analyse van vrouwelijke nakomelingen worden de Kruising 2 testervials opgesteld met een verhouding van 2:5 vrouwtje:y w mannetje en 5–6 dagen gekweekt (volgende stap) om de productiviteit te waarborgen.</li>
		<li>Controleer de productiviteit 4 dagen na het opstellen van de testervials om te bepalen wanneer ze leeggemaakt moeten worden. 
		OPMERKING: Bevestig dat er voldoende eieren zijn gelegd om ten minste 20 scorebare nakomelingen te garanderen, maar laat de culturen niet overgroeien, anders kunnen de vliegen vast komen te zitten in het voedsel.</li>
		<li>Wanneer de testervials klaar zijn (tot 4–5 dagen nadat de testerkruisingen zijn opgezet), verwijder dan de vliegen en voeg 1/3 van een gevouwen laboratoriumdoekje toe aan het voedsel om overtollig vocht te absorberen. 
		OPMERKING: Mannetjes kunnen op dit punt worden verzameld als verdere analyses (bijv. moleculaire genotypering) vereist zijn.</li>
		<li>Kweek de testervials nog 5–6 dagen bij 25 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Scoring 
	OPMERKING: Voor elk genetisch experiment (bijv. homozygote mutanten en heterozygote controles) worden ongeveer 25 testervials per conditie opgezet. Elk genetisch experiment wordt 2–3 keer herhaald en de gegevens van individuele vials worden samengevoegd.
	<ol>
		<li>Score de nakomelingen van Kruising 2 (Figuur 3A) gedurende ongeveer 9 dagen nadat de eerste vliegen zijn uitgekomen.</li>
		<li>Anestheseer de vliegen met CO2 of door de vliegen over te brengen naar een lege vial zonder voedsel en te bevriezen bij -20 °C gedurende ten minste 30 min. 
		OPMERKING: Indien vliegen worden ingevroren, kunnen ze tot enkele dagen later worden gescoord.</li>
		<li>Plaats de vliegen op een vliegmatje en score op de juiste fenotypes (Figuur 3A). Neem alleen vials met ten minste 20 gescorede vliegen op in de dataset.
		<ol>
			<li>Sorteer voor de scoring eerst de vliegen die de DR-white-cassette dragen (met gebruik van rood fluorescent eiwit-positieve [RFP+] fluorescentie als marker), en score vervolgens de oog- en lichaamskleur.</li>
			<li>Het y+-transgen gekoppeld aan de DR-white-cassette resulteert in een tussenliggende bruine lichaamskleur die niet volledig wild-type is. Om onderscheid te maken tussen No DSB/NHEJ (bruin lichaam;&#160;y+&#160;w-) en SSA (geel lichaam;&#160;y-&#160;w-), vergelijk de vliegen met y w-nakomelingen die het DR-white-chromosoom niet hebben (RFP-). SSA-gebeurtenissen zullen dezelfde gele kleur hebben als deze vliegen. Score vliegen die donkerder (bruiner) zijn dan deze als No DSB/NHEJ. 
			OPMERKING: Afwijkingen van de fenotypes beschreven in Figuur 3A&#160; kunnen wijzen op contaminatie, en de vial moet dan niet worden gescoord. Hoewel intacte dode vliegen gescoord kunnen worden, moeten beschadigde vliegen worden weggegooid als de fenotypes niet kunnen worden vastgesteld.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. TIDE-analyse (Figuur 4)
<ol>
	<li>Extractie van genomisch DNA (gDNA)18
	<ol>
		<li>Verzamel hittestok-behandelde vliegen (of larven) die zowel het DR-white- als het I-SceI-transgeen dragen, zoals bij de nakomelingen van Kruising 1 (Figuur 3A).</li>
		<li>Plaats individuele vliegen in een microcentrifugebuis van 1,5 mL en vries deze direct in (bijv. in een bad van droogijs/ethanol of vloeibare stikstof). 
		WAARSCHUWING: Hanteer droogijs, vloeibare stikstof, ethanol, isopropanol en andere chemicaliën met gebruik van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen en institutionele veiligheidsprocedures. 
		PAUSEERPUNT:&#160; Monsters kunnen bij -80 °C worden bewaard en indien nodig later worden verwerkt. Gebruik bij de analyse van vliegen of larven één (1) vlieg of larve per monster. Pool bij de analyse van kleinere weefsels (bijv. hersenen, imaginale schijven) de monsters om de DNA-opbrengst te verhogen.</li>
		<li>Homogeniseer elk monster in 50 µL Buffer A (100 mM Tris-Cl, pH 7,5; 100 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur [EDTA]; 100 mM natriumchloride; 0,5% natriumdodecylsulfaat [SDS]) met een elektrische homogenisator.</li>
		<li>Incubeer de monsters in een waterbad bij 65 °C gedurende 30 min.</li>
		<li>Voeg 100 µL Buffer B (1,4 M kaliumacetaat, 4,3 M lithiumchloride) toe aan elk monster en meng kort door de buisjes om te keren. 
		OPMERKING: Bij het gebruik van hele vliegen kunnen hogere volumes nodig zijn om de monsters volledig te homogeniseren. Indien dit het geval is, moet een volumetrische verhouding van 1:2 Buffer A:Buffer B worden aangehouden.</li>
		<li>Incubeer de monsters op ijs gedurende ten minste 30 min.</li>
		<li>Centrifugeer de monsters bij ongeveer 16.000 x g gedurende 15 min bij 4 °C.</li>
		<li>Breng 125 µL van de heldere supernatant over in nieuwe microcentrifugebuisjes van 1,5 mL. Vermijd elk neerslag.</li>
		<li>Voeg per 125 µL supernatant 100 µL 100% isopropanol op kamertemperatuur toe en meng kort door de buisjes om te keren.</li>
		<li>Centrifugeer de monsters bij ongeveer 16.000 x g gedurende 10 min bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Aspireer de supernatant, waarbij u voorzichtig bent om het DNA-pellet niet te verstoren. 
		OPMERKING: Het DNA-pellet is in dit stadium mogelijk niet zichtbaar. Noteer de oriëntatie van de buisjes bij het laden in de microcentrifuge en aspireer aan de tegenovergestelde zijde van waar het pellet wordt verwacht.</li>
		<li>Was de pellets met 250 µL ijskoud 70% ethanol en meng vervolgens kort door de buisjes voorzichtig om te keren.</li>
		<li>Centrifugeer de monsters bij ongeveer 16.000 x g gedurende 5 min bij 4 °C.</li>
		<li>Aspireer de supernatant, waarbij u voorzichtig bent om het pellet niet te verstoren. 
		OPMERKING: Het pellet kan na de ethanolwas beter zichtbaar zijn. Indien niet, zie de Opmerking bij Stap 2.1.11.</li>
		<li>Laat de buisjes openstaan bij kamertemperatuur om het resterende ethanol te laten verdampen. Vermijd overdroging van het pellet, anders is volledige resuspensie mogelijk niet mogelijk.</li>
		<li>Voeg 20 µL nucleasevrij water toe en laat de pellets overnight resuspenderen bij 4 °C. 
		PAUSEERPUNT: Als het DNA-pellet niet volledig is opgelost, kan er extra water worden toegevoegd.</li>
		<li>Keer de volgende dag de buisjes voorzichtig om en meet de DNA-concentratie. Bewaar monsters bij -20 °C als ze niet onmiddellijk worden verwerkt. 
		OPMERKING: Voor extractie uit een enkele vlieg is de opbrengst doorgaans ongeveer 100 ng/µL. Monsters van hoge kwaliteit zijn belangrijk. Een A260/A280-absorbentie moet tussen 1,7 en 2,0 liggen. Waarden buiten dit bereik wijzen op contaminanten zoals eiwitten. A260/A230 moet tussen 2,0 en 2,2 liggen. Waarden buiten dit bereik wijzen op contaminanten zoals ethanol en buffersouten. Monsters met een lagere opbrengst en slechte kwaliteit kunnen leiden tot een gebrekkige PCR-amplificatie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Polymerasekettingreactie (PCR)
	<ol>
		<li>Amplificeer over Sce.white via PCR met gebruik van 100 ng gDNA en de primers DR-white_8f (5’-GTGGATCAGGTGATCCAGG) en DR-white_8a (5’-CTTAAGCCATCGTCAGTTGC) volgens de instructies van de fabrikant. Voeg een controlemonster van een DR-white-vlieg toe (d.w.z. DR-white-ouderstok, zonder aanwezig I-SceI-transgeen). Gebruik de volgende cycluscondities: 94 °C gedurende 3 min; {94 °C gedurende 30 s; touchdown op 66 °C (-0,5 °C / cyclus) gedurende 30 s; 72 °C gedurende 30 s} x 16 cycli; {94 °C gedurende 30 s; 58 °C gedurende 30 s; 72 °C gedurende 30 s} x 20 cycli; 72 °C gedurende 5 min; vastgehouden op 12 °C. 
		OPMERKING: Bij gebruik van een ander reagens moeten de cycluscondities mogelijk worden aangepast.</li>
		<li>Laad ongeveer 2 µL PCR-product op een diagnostische 1% tris-acetaat-EDTA (TAE)-agarosegel om de amplificatie van Sce.white te bevestigen. De verwachte amplicongrootte is ongeveer 1,7 kb.</li>
		<li>Zuiver de Sce.white-amplicons via PCR-zuivering en meet de DNA-concentratie.</li>
		<li>Sequence het gezuiverde PCR-product met behulp van primer DR-white_9f (5’-GAGCCCACCTCCGGACTGGAC). 
		OPMERKING: Wij sequencen doorgaans 40 ng gezuiverd PCR-product, maar dit kan verschillen afhankelijk van de instructies van de sequencingdienst.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>TIDE-analyse 
	OPMERKING: De meeste fouten als gevolg van het gebruik van het TIDE R-script zijn terug te voeren op een onjuiste code-opmaak.
	<ol>
		<li>Download de vereiste R-pakketten (d.w.z. sangerseqR en Biostrings) van Bioconductor.org. Gebruik de zoekbalk om de nieuwste versie van elk pakket te vinden.</li>
		<li>Analyseer de sequence-chromatogrammen om te controleren of ze van goede kwaliteit zijn. Analyseer alleen chromatogrammen met weinig tot geen achtergrondruis voorafgaand aan de breekplaats.</li>
		<li>Download de sequence-tracebestanden (met .ab1-bestandsextensie) en plaats alle tracebestanden in één computermap. Vereenvoudig de namen van de sequence-bestanden zoveel mogelijk (bijv. F1, Het2, Hom3) om scriptaanpassingen in de volgende stappen te vergemakkelijken.</li>
		<li>Open het TIDE R-script (Supplement Bestand 1) in de RStudio integrated development environment (IDE; zie de Materialenlijst). Zoek in het Source-venster de regel die begint met Control &#60;- (Supplement Bestand 2A) en voer de bestandsnaam van de controlesequens exact in zoals deze is opgeslagen, inclusief de .ab1-extensie, tussen aanhalingstekens. 
		OPMERKING: De "controlesequens" is de sequens van de PCR uit de ouderlijke DR-white-stok zonder I-SceI-transgeen of inductie.</li>
		<li>Zoek de regel die begint met samplename &#60;- c( en voer elke bestandsnaam van de monstersequens in tussen de haakjes (Supplement Bestand 2A). Voeg de .ab1-extensie toe, plaats elke bestandsnaam tussen afzonderlijke aanhalingstekens en scheid de bestandsnamen met komma's.</li>
		<li>Sla het bewerkte TIDE R-scriptbestand op in dezelfde map als de sequenses die geanalyseerd moeten worden. Houd de bestandsnaam eenvoudig om fouten in de volgende stappen te voorkomen.</li>
		<li>Navigeer in de IDE naar de TIDE-map met behulp van het Files-tabblad in het Output-venster (Supplement Bestand 2B).</li>
		<li>Klik op het More-uitklapmenu en selecteer Open New Terminal Here (Supplement Bestand 2C). Er wordt een nieuwe terminal geopend in het Console-venster (linksonder).</li>
		<li>Typ in de nieuw geopende Terminal “R” en druk op Enter (Supplement Bestand 2D).</li>
		<li>Zodra R in de terminal draait, voert u het TIDE R-script uit door source(&#34;TIDE_analysis.R&#34;) te typen en op Enter te drukken (Supplement Bestand 2E). De terminal voert het script uit en produceert een grafische weergave (Supplement Bestand 2F) en een .csv-bestand met de ruwe gegevens voor elk monster (Supplement Bestand 2G en Supplement Bestand 3). De outputbestanden worden opgeslagen in dezelfde map als het R-script en de sequence-bestanden. 
		OPMERKING: Als hetzelfde R-script opnieuw wordt uitgevoerd, worden eventuele nieuwe .csv-bestanden over de oudere bestanden heen geschreven. Maak een kopie van de map als u meerdere analyses op dezelfde bestanden uitvoert.</li>
		<li>Analyseer de gegevens door elk .csv-bestand te openen.
		<ol>
			<li>Interpreteer de ruwe gegevens als proporties indels in de monstersequens. Homologe recombinatie genconversie van de I-SceI-herkenningssequens naar de wild-type SacI-sequens produceert de canonieke deletie van 23 bp; het script rapporteert deze HR-waarde in een afzonderlijke rij onderaan de output (Supplement Bestand 2G). De 0-indel-waarde staat voor geen DSB of NHEJ zonder indels. Som alle andere indel-waarden op om NHEJ met processing te verkrijgen. De som van NHEJ met processing en HR is het totale aantal detecteerbare DSB-reparatiegebeurtenissen.</li>
			<li>Bereken de proporties van de reparatiepaden tussen de detecteerbare DSB-reparatiegebeurtenissen met behulp van de volgende vergelijkingen: 
			Proportie NHEJ met processing = (NHEJ met processing) / (NHEJ met processing + HR) 
			Proportie HR = (HR) / (NHEJ met processing + HR) 
			OPMERKING: Voor elke conditie worden ongeveer 10–15 monsters gebruikt voor elk genetisch experiment (bijv. homozygote mutanten en heterozygote controles). Elk genetisch experiment wordt 2–3 keer herhaald en de individuele gegevens worden gepoold.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Khanna KK, Jackson SP. DNA double-strand breaks: signaling, repair and the cancer connection. Nat Genet. 2001;27(3):247-54.</li>
	<li>Cejka P, Symington LS. DNA end resection: mechanism and control. Annu Rev Genet. 2021;55:285-307.</li>
	<li>Oh J, Myung K. Crosstalk between different DNA repair pathways for DNA double strand break repairs. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 2022;873:503438.</li>
	<li>Figueroa-Gonz&#225;lez G, P&#233;rez-Plasencia C. Strategies for the evaluation of DNA damage and repair mechanisms in cancer. Oncol Lett. 2017;13(6):3982-8.</li>
	<li>Picksley SM, Attfield PV, Lloyd RG. Repair of DNA double-strand breaks in Escherichia coli K12 requires a functional recN product. Mol Gen Genet. 1984;195(1-2):267-74.</li>
	<li>Motamedi MR, Szigety SK, Rosenberg SM. Double-strand-break repair recombination in Escherichia coli: physical evidence for a DNA replication mechanism in vivo. Genes Dev. 1999;13(21):2889-903.</li>
	<li>Malkova A, Ivanov EL, Haber JE. Double-strand break repair in the absence of RAD51 in yeast: a possible role for break-induced DNA replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996;93(14):7131-6.</li>
	<li>Frankenberg-Schwager M, Frankenberg D. DNA double-strand breaks: their repair and relationship to cell killing in yeast. Int J Radiat Biol. 1990;58(4):569-75.</li>
	<li>Allalunis-Turner MJ et al. Radiation-induced DNA damage and repair in cells of a radiosensitive human malignant glioma cell line. Radiat Res. 1995;144(3):288-93.</li>
	<li>Pierce AJ, Johnson RD, Thompson LH, Jasin M. XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells. Genes Dev. 1999;13(20):2633-8.</li>
	<li>Rong YS, Golic KG. Gene targeting by homologous recombination in Drosophila. Science. 2000;288(5473):2013-8.</li>
	<li>Adams MD, McVey M, Sekelsky J. Drosophila Blm in double-strand break repair by synthesis-dependent strand annealing. Science. 2003;299(5604):265-7.</li>
	<li>Rong YS, Golic KG. The homologous chromosome is an effective template for the repair of mitotic DNA double-strand breaks in Drosophila. Genetics. 2003;165(4):1831-42.</li>
	<li>Do AT, Brooks JT, Le Neveu MK, LaRocque JR. Double-strand break repair assays determine pathway choice and structure of gene conversion events in Drosophila melanogaster. G3 (Bethesda). 2014;4(3):425-32.</li>
	<li>Fernandez J, Bloomer H, Kellam N, LaRocque JR. Chromosome preference during homologous recombination repair of DNA double-strand breaks in Drosophila melanogaster. G3 (Bethesda). 2019;9(11):3773-80.</li>
	<li>Thomas MS et al. The epistatic relationship of Drosophila melanogaster CtIP and Rif1 in homology-directed repair of DNA double-strand breaks. G3 (Bethesda). 2024;14(11):jkae210.</li>
	<li>Greenspan RJ. Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NY; 2004. 191 p.</li>
	<li>Sullivan W, Ashburner M, Hawley RS, editors. Drosophila protocols. Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NY; 2000. 697 p.</li>
	<li>McIlwraith MJ et al. Human DNA polymerase eta promotes DNA synthesis from strand invasion intermediates of homologous recombination. Mol Cell. 2005;20(5):783-92.</li>
	<li>Sartori AA et al. Human CtIP promotes DNA end resection. Nature. 2007;450(7169):509-14.</li>
	<li>Bischof J et al. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(9):3312-7.</li>
	<li>Janssen A et al. A single double-strand break system reveals repair dynamics and mechanisms in heterochromatin and euchromatin. Genes Dev. 2016;30(14):1645-57.</li>
	<li>Preston CR, Flores CC, Engels WR. Differential usage of alternative pathways of double-strand break repair in Drosophila. Genetics. 2006;172(2):1055-68.</li>
	<li>Chen H et al. An enhanced gene targeting toolkit for Drosophila: Golic+. Genetics. 2015;199(3):683-94.</li>
	<li>Delabaere L et al. Aging impairs double-strand break repair by homologous recombination in Drosophila germ cells. Aging Cell. 2017;16(2):320-8.</li>
	<li>Graham EL et al. The impact of developmental stage, tissue type, and sex on DNA double-strand break repair in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 2024;20(4):e1011250.</li>
	<li>Do AT, LaRocque JR. The role of Drosophila mismatch repair in suppressing recombination between diverged sequences. Sci Rep. 2015;5:17601.</li>
	<li>Ertl HA et al. The role of Blm helicase in homologous recombination, gene conversion tract length, and recombination between diverged sequences in Drosophila melanogaster. Genetics. 2017;207(3):923-33.</li>
	<li>Yannuzzi I, Butler MA, Fernandez J, LaRocque JR. The role of Drosophila CtIP in homology-directed repair of DNA double-strand breaks. Genes (Basel). 2021;12(9):1430.</li>
</ol>

De auteurs hebben geen financiële of niet-financiële belangenverstrengelingen te melden.

De veelzijdigheid van het DR-white-systeem is een cruciale factor die bijdraagt aan de huidige en toekomstige impact binnen het veld van DNA-reparatie. Ten eerste stelt de attB-integratiesequentie binnen het DR-white-reporterconstruct onderzoekers in staat om de reporter op talrijke locaties binnen het Drosophila-genoom te richten21, waarbij er reeds verschillende getargete lijnen beschikbaar zijn22. Ten tweede biedt de beschikbaarheid van verschillende I-SceI-transgenen, zoals hitte-shockexpressie via de hsp70-promotor (deze studie), constitutieve expressie via de ubiquitine-promotor23, en premeiotische kiemlijnexpressie via de Bam-promotor24, talrijke ontwikkeling- en weefselspecifieke contexten om DSB-reparatie te onderzoeken. Ongeacht het gebruikte &#160;I-SceI-transgeen moeten genetische kruisingen zorgvuldig worden gepland om te garanderen dat het I-SceI-transgeen pas in de laatste kruising wordt geïntroduceerd, zodat een correcte DSB-inductie gewaarborgd is. Het is belangrijk op te merken dat reparatiefrequenties aanzienlijk kunnen variëren afhankelijk van de genomische locatie van DR-white en/of het gebruikte I-SceI&#160;-transgeen. Toekomstige experimenten zouden genomische locaties en I-SceI-transgenen verder kunnen vergelijken om te bepalen of de genomische context of weefselspecificiteit de DSB-reparatie drijft.
Een specifiek voordeel van de DR-white assay en de derivaten daarvan is dat ze herstel van DSB's via homologe recombinatie, NHEJ met processing en, in de meeste gevallen, SSA kunnen identificeren. Hoewel het systeem is ontworpen om kiembaanherstelgebeurtenissen fenotypisch te detecteren, maakt het ook analyse van somatische weefsels mogelijk via TIDE-algoritmische analyse. Ondanks deze voordelen zijn er enkele beperkingen aan deze assay die in overweging moeten worden genomen. Opmerkelijk is dat de DR-white assay HR-frequenties kan onderschatten. Net als bij andere genetische reporterassays die gebruikmaken van nuclease-geïnduceerde DSB's, is herstel via HR vanuit een zustercromatide (intersister HR) niet te onderscheiden van een gebeurtenis zonder DSB of van NHEJ zonder processing. Hierdoor kan ten minste een deel van de No DSB/NHEJ-klasse bestaan uit HR-gebeurtenissen. Gezien deze beperking moeten resultaten die genetische factoren vergelijken (zoals mutante lijnen) met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd. Andere beperkingen van de assay omvatten het onvermogen om premeiotische gebeurtenissen te scoren die geen levensvatbare nakomelingen opleverden. Zo zullen DSB-gebeurtenissen die mogelijk niet zijn hersteld en tot celdood hebben geleid, niet worden gescoord in de nakomelingen. Hoewel de algehele fertiliteit een kwalitatieve maat voor celdood in de kiembaan kan zijn, kunnen celgebaseerde assays (zoals TUNEL) vereist zijn. Daarnaast biedt de TIDE R-scriptanalyse alleen de proportie detecteerbare gebeurtenissen in een celpopulatie. Om specifieke indel-sequentie-uitkomsten te bepalen, is sequenering van individuele herstelgebeurtenissen via multiplex DNA-sequenering nodig.
De DR-white assay heeft al een aanzienlijke impact gehad op het onderzoek naar DSB-reparatie. De toepassing ervan heeft factoren geïdentificeerd die bijdragen aan DSB-reparatie in meercellige organismen, waaronder leeftijd25, geslacht26, de locatie van de DSB22,26, de locatie van de donorsequentie15, de celcyclus en het weefseltype26. Daarnaast hebben we de assay gebruikt om verschillende eiwitten te identificeren die ook de keuze van het reparatiepad en/of de reparatie van gedivergeerde sequenties in Drosophila aansturen, waaronder Msh627, Blm28, Rif116 en CtIP16,29. De gevestigde toepassing van Drosophila als genetisch modelorganisme met geconserveerde DNA-reparatie-eiwitten biedt een eenvoudig, meercellig systeem voor het onderzoeken van de genetische, cellulaire en organismische factoren die bijdragen aan DSB-reparatie in complexe biologische contexten.

De genomische integriteit wordt vaak bedreigd door DNA-laesies, waaronder dubbelstrengse breuken (DSB's) bijzonder toxisch zijn. Indien deze breuken niet worden hersteld, kunnen ze leiden tot genetisch verlies, chromosomale herschikkingen en celdood1. Cellen hebben daarom meerdere paden ontwikkeld om DSB's te herstellen. Nonhomologe eindverbinding (NHEJ) ligatureert de twee uiteinden van de DSB direct, waarbij potentieel indels op de breukplaats worden geïntroduceerd; single-strand&#160;annealing (SSA) maakt gebruik van complementaire sequenties die de breukplaats flankeren voor herstel, wat resulteert in deleties op de breukplaats; terwijl homologe recombinatie (HR) een homologe sequentie als template voor herstel gebruikt2,3.
Historisch gezien waren studies naar DSB-herstel beperkt tot biochemische assays4 of enkelcel-systemen, zoals bacteriën5,6, gist7,8 en zoogdiercelculturen9,10. Hoewel deze modellen instrumenteel zijn geweest bij het identificeren van kernherstelproteïnen en hun mechanismen, missen ze de biologische complexiteit van een meercellig organisme. Drosophila melanogaster is een populair meercellig modelsysteem geworden voor het bestuderen van DNA-herstel. Veel huidige assays zijn echter toegesneden op specifieke herstelpaden11; maken gebruik van grote chromosomale aberraties, zoals P-element-excisie12; of vereisen tijdrovende moleculaire analyses13. De DR-white-assay pakt deze uitdagingen aan door een eenvoudige, genetische reporter van DNA-herstel in Drosophila te bieden14. Deze studie biedt een volledige, praktische en gedetailleerde stapsgewijze workflow voor het uitvoeren van genetische en moleculaire assays om DNA DSB-herstel te meten met behulp van de gevestigde DR-white-assay.
De assay maakt gebruik van twee directe herhalingen van het Drosophila white (w) gen, dat de wild-type rode oogkleur veroorzaakt (Figuur 1). Beide kopieën zijn niet-functioneel: de eerste, Sce.white, bevat een insertie met de herkenningssequentie voor het I-SceI meganuclease op een wild-type SacI-site en introduceert een prematuur stopcodon; de tweede, iwhite, is aan zowel het 5’- als het 3’-uiteinde getrunceerd en dient als template voor HR-herstel. Een Drosophila yellow transgeen (y+), dat de wild-type bruine lichaamskleur veroorzaakt, bevindt zich tussen de twee white-herhalingen. Aangezien de DR-white-cassette is geïntegreerd in een y w mutant-achtergrond, zijn DR-white-vliegen fenotypisch wild-type bruin van lichaam en mutant wit van oog.
DSB's kunnen worden geïnduceerd bij Sce.white door DR-white vliegen te kruisen met vliegen die een I-SceI transgen dragen. Herstel van DSB's in de premeiotische kiemlijn kan worden gemeten door het scoren van het nageslacht van een testerkruising. Herstel via NHEJ resulteert in het ouderlijke fenotype met een bruin lichaam en witte ogen (Figuur 1A), terwijl herstel via HR de wild-type white sequentie herstelt en resulteert in nageslacht met een bruin lichaam en rode ogen (Figuur 1B). SSA-herstel van de DSB of een mitotische crossover resulteert in het verlies van het tussenliggende yellow transgen, wat leidt tot vliegen met een geel lichaam en witte ogen (Figuur 1C). Om hersteluitkomsten in somatische cellen te analyseren, hebben we het Tracking Indels by DEcomposition (TIDE) algoritme aangepast om specifiek NHEJ met processing en HR-herstel in de DR-white assay te detecteren15,16.
De DR-white assay biedt verschillende voordelen ten opzichte van eerder vastgestelde DNA-reparatieassays in Drosophila. Omdat breuken worden gegenereerd en gerepareerd in de kiemlijn, kunnen reparatie-uitkomsten eenvoudig worden gedetecteerd via fenotypische analyse. Tegelijkertijd is de assay uiterst veelzijdig. Hoewel de assay primair is ontworpen om HR-reparatie te meten, kan deze alle drie de reparatieroutes detecteren. We hebben daarnaast twee extra functionele reparatietemplates ontwikkeld (Figuur 2). Het iwhite.mu template bevat 28 stille enkelnucleotide-polymorfismen (SNP's) en produceert eveneens nakomelingen met rode ogen (Figuur 2A), wat studies naar de lengte van genconversietracten (GCT) en HR-reparatie tussen divergerende sequenties vergemakkelijkt14.&#160;Het iwhiteΔ9 template bevat een deletie van negen basenparen op de wild-type SacI-site en resulteert in nakomelingen met oranje ogen (Figuur 2B). Deze eigenschap stelt onderzoekers in staat om HR-reparatie vanuit verschillende templates te volgen, een kenmerk dat uniek is voor de DR-white assay15.

<table><tbody><tr><td>0,5 mL RNAse/DNAse-vrije stamper</td><td>Fisher Scientific</td><td>12141363</td><td>Voor homogenisatie van monsters voor gDNA-extractie</td></tr><tr><td>Wattenbollen</td><td>Genesee Scientific</td><td>51-101</td><td>voor standaard Drosophila-kweek</td></tr><tr><td>Drosophila Peltier Gekoelde Incubator</td><td>Shel Lab</td><td>SRI6PF</td><td>voor standaard Drosophila-kweek</td></tr><tr><td>Drosophila-stam: y[1] w[1]</td><td>Bloomington Drosophila&amp;nbsp; Stock Center</td><td>RRID:BDSC 1495</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila-stam: y[2] w[&amp;Delta;] cho[2] v[1] ; P{70I-SceI}2B Sco / CyO, P{GFP, w+}&amp;nbsp;</td><td>LaRocque Lab</td><td>N/A</td><td>gecreëerd door het LaRocque lab via standaard recombinatie van stam RRID:BDSC_6934 (y[1] w[*]; P{ry[+t7.2]=70FLP}11 P{v[+t1.8]=70I-SceI}2B sna[Sco]/CyO, S[2]) van het Bloomington Drosophila Stock Center; beschikbaar op aanvraag bij de corresponderende auteur</td></tr><tr><td>Drosophila-stam: y[2] w[&amp;Delta;] cho[2] v[1] ; DR-white (y+).3 51C,RFP+ / [CyO-GFP]</td><td>LaRocque Lab</td><td>N/A</td><td>DR-white assay geïntegreerd in stam RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP&amp;rsquo;}ZH-51C); beschikbaar op aanvraag bij de corresponderende auteur</td></tr><tr><td>Drosophila-stam: y[2] w[&amp;Delta;] cho[2] v[1] ; DR-white.mu (y+).3 51C,RFP+ / [CyO-GFP]</td><td>LaRocque Lab</td><td>N/A</td><td>DR-white.mu assay geïntegreerd in stam RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP&amp;rsquo;}ZH-51C); beschikbaar op aanvraag bij de corresponderende auteur</td></tr><tr><td>Drosophila-stam: y[1] w[*]; iwhite2 (y+).1 51C,RFP+ / [CyO]</td><td>LaRocque Lab</td><td>N/A</td><td>iwhite&amp;Delta;9 donor geïntegreerd in stam RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP&amp;rsquo;}ZH-51C); beschikbaar op aanvraag bij de corresponderende auteur</td></tr><tr><td>Flugs Drosophila-flESDopjes</td><td>Genesee Scientific</td><td>49-100</td><td>voor standaard Drosophila-kweek</td></tr><tr><td>Fluorescent stereomicroscoop (RFP)</td><td>TriTech Research</td><td>SMT1-FL</td><td>voor standaard Drosophila &quot;fly pushing&quot; en sortering op basis van fluorescentie</td></tr><tr><td>FlyStuff Drosophila Fly Pad</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-172</td><td>voor standaard Drosophila &quot;fly pushing&quot;</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clarke</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>MyBath 4 L Waterbad</td><td>Midwest Scientific</td><td>MB-2000-4</td><td>voor&amp;nbsp; hitte-shock</td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-400-518LY</td><td>voor DNA-kwantificatie</td></tr><tr><td>Nutri-fly Bloomington Formulatie Medium</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-121</td><td>voor standaard Drosophila-kweek</td></tr><tr><td>Pellet Pestle Draadloze Motor homogenisator</td><td>DWK Life Sciences</td><td>K749540-0000</td><td>Voor homogenisatie van monsters voor gDNA-extractie</td></tr><tr><td>Polypropyleen flessen</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-130</td><td>voor standaard Drosophila-kweek</td></tr><tr><td>Polystyreen vials</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-116</td><td>voor standaard Drosophila-kweek, inclusief hitte-shock</td></tr><tr><td>Primer/oligonucleotide DR-white_8f</td><td>N/A; elke oligonucleotidesyntheseservice is voldoende</td><td>N/A</td><td>5'GTGGATCAGGTGATCCAGG</td></tr><tr><td>Primer/oligonucleotide DR-white_8a</td><td>N/A; elke oligonucleotidesyntheseservice is voldoende</td><td>N/A</td><td>5&amp;rsquo;-CTTAAGCCATCGTCAGTTGC</td></tr><tr><td>Primer/oligonucleotide DR-white_9f</td><td>N/A; elke oligonucleotidesyntheseservice is voldoende</td><td>N/A</td><td>5&amp;rsquo;-GAGCCCACCTCCGGACTGGAC</td></tr><tr><td>R Studio</td><td>Posit</td><td>Versie 2023.06.1+524</td><td>Gratis downloadbare versie; elke versie van R Studio is acceptabel, hoewel de gepresenteerde gegevens zijn geanalyseerd met&amp;nbsp; versie 2023.06.1+524</td></tr><tr><td>R Studio pakketten: Biostrings</td><td>Bioconductor.org (Versie 3.24)</td><td>Versie 2.76.0</td><td>R Script zal de gebruiker vragen dit pakket te installeren</td></tr><tr><td>R Studio pakketten: sangerseqR</td><td>Bioconductor.org (Versie 3.24)</td><td>Versie 1.44.0</td><td>R Script zal de gebruiker vragen dit pakket te installeren</td></tr><tr><td>SapphireAMP Fast PCR</td><td>Takara</td><td>RR350B</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscoop</td><td>Leica</td><td>M60</td><td>voor standaard Drosophila &quot;fly pushing&quot;</td></tr><tr><td>Wizard SV Gel and PCR Clean up&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr></tbody></table>

het meten van het herstel van dubbelstrengs dna-breuken met behulp van de dr-white-assay in drosophila melanogaster

Measuring DNA Double-Strand Break Repair Using the DR-white Assay in Drosophila melanogaster

Traditionele studies naar het herstel van DNA-dubbelstrengsbreuken (DSB) zijn vaak beperkt tot biochemische onderzoeken of unicellulaire systemen (bijv. cellen, gist). Om studies naar DSB-herstel in een meercellig organisme te faciliteren, maken wij gebruik van de DR-white assay in Drosophila melanogaster. De DR-white assay is een eenvoudige maar veelzijdige reporterassay voor DSB-herstel die een enkele I-SceI-herkenningssequentie bevat, die kan worden gekliefd door expressie van het I-SceI meganuclease. Expressie van I-SceI kan constitutief worden geïnduceerd, via hittestress of onder andere promotoren, wat onderzoek naar weefsel- of ontwikkelingsspecifiek herstel mogelijk maakt. Een belangrijk voordeel van de assay is dat deze hersteluitkomsten kan onderscheiden die betrekking hebben op homologe recombinatie (HR), non-homologe eindverbinding (NHEJ) en single-strand annealing (SSA). Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol voor de gevestigde DR-white assay, inclusief een stapsgewijze workflow voor het induceren van DSB's in de premeiotische kiemlijn en het fenotypisch analyseren van herstelgebeurtenissen door het scoren van nakomelingen. Daarnaast wordt de moleculaire analyse van herstelgebeurtenissen beschreven middels polymerasekettingreactie (PCR), sequencing en het Tracking of Indels by DEcomposition (TIDE) R-script. Dit protocol biedt een nuttig instrument voor het onderzoeken van de genetische en moleculaire mechanismen van DNA-herstel in een organismisch model.

Drosophila Rad51-vereiste voor herstel door homologe recombinatie
Succesvolle kiembaanexperimenten leveren de verwachte fenotypische klassen op zoals getoond in Figuur 3A en ten minste 20 scorebare nakomelingen per buisje. Onverwachte fenotypes of minder dan 20 scorebare nakomelingen duiden op contaminatie of onvoldoende productiviteit en moeten worden uitgesloten zoals gespecificeerd in stap 1.4.3. Voor TIDE-analyse produceren succesvolle monsters een amplicon van ongeveer 1,7 kb en chromatogrammen met weinig achtergrondruis vóór de breekplaats; DNA met een lage opbrengst of contaminatie en ruisige chromatogrammen zijn suboptimaal en mogen niet worden geanalyseerd.
Bij gebruik van de DR-white-assay met een hitte-schok induceerbare I-SceI-bron is de frequentie van HR-herstel in wildtype vliegen 38,5 ± 1,2% (gemiddelde ± SEM), terwijl SSA voorkomt in ongeveer 3,2 ± 0,35% (Figuur 3B&#160;en Aanvullend Bestand 4). Rad51 (gecodeerd door het homologe gen spnA in Drosophila) is vereist voor de stap van strenginvasie bij homologe recombinatie14,19. Daarom zou het verlies van Rad51 moeten leiden tot inefficiënte HR. Inderdaad, in een DmRad51-/- achtergrond wordt HR-herstel verminderd tot 1,3 ± 0,4%, met een gelijktijdige toename van SSA-herstel (34,5 ± 1,8%; Figuur 3B&#160;en Aanvullend Bestand 4)14. Dit is zeer waarschijnlijk te wijten aan herstelevenementen die waren bestemd voor homologe recombinatie, maar alternatief werden hersteld door single-strand annealing van de white herhalingssequenties.
Drosophila CtIP-bijdrage aan efficiënte HR-reparatie in somatische weefsels
Het TIDE-algoritme maakt het mogelijk om de keuze van het herstelpad in somatische cellen te meten. In een niet-gemuteerde achtergrond vindt NHEJ met processing plaats in 59,0% van de detecteerbare herstelgebeurtenissen, en HR vindt plaats in 41,0% (Figuur 4B&#160;en Aanvullend Bestand 4). CtIP speelt een belangrijke rol bij de initiatie van HR-herstel door DNA-uiteinde-resectie te bevorderen20. Bijgevolg is de keuze voor het HR-pad in een DmCtIP-/- achtergrond duidelijk verminderd in somatische cellen, van 41,0% in heterozygote controles naar 10,9% in homozygote mutanten (Figuur 4B en Aanvullend Bestand 4)16. Dit suggereert dat CtIP in Drosophila bijdraagt aan HR-herstel, maar er niet essentieel voor is.
<img alt="Figuur 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72635/72635fig1.jpg" /> 
Figuur 1DR-wwit DSB-reporterassay en reparatieuitkomsten. De directe herhaling van wit de assay bevat twee niet-functionele kopieën van de wit gen: Sce.white (met een insertie van 23 bp die de I-SceI-herkenningsplaats bevat en een voortijdig stopcodon introduceert) en iwhite (5&#8242;- en 3&#8242;-getrunceerde donorsequentie). Kruisen van vliegen die DR- bevattenwit en een I-SceI transgeen produceert een site-specifieke DSB die fenotypisch of moleculair geanalyseerd kan worden. De resulterende fenotypes zijn (A) witogige nakomelingen (y+ w−), wat duidt op de afwezigheid van DSB, intersister HR of NHEJ; (B) roodogige nakomelingen (y+ w+), wat wijst op intrachromosomale HR die het wildtype herstelt SacI sequentie van de iwhite donor; en (C) nakomelingen met een geel lichaam en witte ogen (y− w−), wat duidt op SSA of mitotische CO. Figuur aangepast naar Do et al.14Afkortingen: CO = crossover; DR-wit = Direct Repeat van wit; DSB = dubbelstrengs breuk; HR = homologe recombinatie; NHEJ = non-homologe eindaanhechting; SSA = enkelstrengs annealing. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/72635fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figuur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72635/72635fig2.jpg" /> 
Figuur 2: Afgeleiden van de DR-white assay. (A) De DR-white.mu assay bevat 28 stille SNP's in de iwhite.mu donorsequentie, wat resulteert in een sequentiedivergentie van 1,4% tussen de directe herhalingen. Genconversie van individuele polymorfismen varieert tussen HR-gebeurtenissen en kan worden bepaald door sequencing. (B) DR-white met de iwhiteΔ9 donor maakt onderscheid tussen interhomologe en intrachromosomale recombinatie. HR vanuit de intrachromosomale iwhite donor herstelt de wild-type SacI sequentie en produceert nakomelingen met rode ogen. HR vanuit de interhomologe iwhiteΔ9 donor produceert nakomelingen met oranje ogen, omdat de deletie van 9 bp de white expressie vermindert. De figuur is aangepast van Do et al.14 en Fernandez et al.15. Afkortingen: DSB = double-strand break; HR = homologe recombinatie; SNP = single-nucleotide polymorphism. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/72635fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figuur 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72635/72635fig3.jpg" /> 
Figuur 3: Experimentele workflow voor het detecteren van DSB-reparatie-uitkomsten in de premeiotische kiemlijn. (A) Kruising 1 combineert de DR-white reporter (of een derivaat daarvan) met een I-SceI transgen (in dit voorbeeld op het tweede chromosoom). Nakomelingen die zowel de DR-white assay als het I-SceI transgen bevatten, behouden reparatiegebeurtenissen in hun kiemlijn en somatische weefsels. Om individuele reparatiegebeurtenissen in de premeiotische kiemlijn te analyseren, worden nakomelingen die beide transgenen dragen gekruist met y w tester-vliegen (Kruising 2), en worden de nakomelingen gescoord zoals beschreven in Figuur 1. (B) Individuele DSB-reparatiegebeurtenissen in de kiemlijn van wild-type vliegen (n = 106 kiemlijnen) en DmRad51 homozygote mutanten (n = 46 kiemlijnen). **P &#60; 0,01; ****P &#60; 0,0001 via twee-weg ANOVA gevolgd door de multiple-comparisons test van Sidak. Staven representeren gemiddelden; foutenbalken representeren SEM. Gegevens zijn heranalyseerd uit Do et al.14. Afkortingen: ANOVA = variantieanalyse; CO = crossover; DSB = double-strand break; HR = homologe recombinatie; NHEJ = non-homologous end joining; SEM = standaardfout van het gemiddelde; SSA = single-strand annealing. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/72635fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figuur 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72635/72635fig4v2.jpg" /> 
Figuur 4: Experimentele workflow voor het detecteren van DSB-reparatie-uitkomsten met behulp van Tracking of Indels by DEcomposition. (A) Vliegen met DR-white en een geïnduceerd I-SceI-transgen worden geanalyseerd via gDNA-extractie, PCR-amplificatie over de DSB-site, Sanger-sequencing en TIDE-analyse met het R-script. (B) Representatieve gegevens van DmCtIP-/-&#160;mutanten (n = 23) en DmCtIP+/-&#160;heterozygote controles (n = 31). Detecteerbare reparatiegebeurtenissen zijn berekend als HR plus NHEJ met processing, exclusief geen DSB/NHEJ zonder indels. ****P &#60; 0.0001 via twee-weg ANOVA gevolgd door de multiple-comparisons test van Sidak. Staven representeren gemiddelden; foutbalken representeren SEM. Gegevens zijn hergeanalyseerd uit Thomas et al.16. Afkortingen: ANOVA = analyse of variance; DSB = double-strand break; gDNA = genomisch DNA; HR = homologe recombinatie; NHEJ = non-homologous end joining; PCR = polymerasekettingreactie; SEM = standaardfout van het gemiddelde; TIDE = Tracking of Indels by DEcomposition. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/72635fig4largev2.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullend bestand 1: TIDE R-script voor het identificeren van inserties en deleties in sequentiechromatogrammen ten opzichte van een controle zonder DSB. De door de gebruiker bewerkbare bestandsnaam van de controle, de bestandsnamen van de monsters en de I-SceI-doelsequentie zijn aan het einde van het script aangegeven. De vereiste inputs, outputbestanden en de interpretatie worden beschreven in sectie 2.3. De pakketten sangerseqR en Biostrings zijn vereist.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/Supplemental File 1.R" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 2: Stapsgewijze screenshot-handleiding voor de TIDE R-script workflow. De panelen illustreren de softwareacties die beschreven worden in sectie 2.3.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/Supplemental File 2 (1).pdf" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 3: Voorbeeld van TIDE-output en berekeningen van herstelgebeurtenissen. De 0-indel waarde vertegenwoordigt geen DSB of NHEJ zonder indels; de aparte HR-rij vertegenwoordigt het canonieke deletieproduct van 23-bp; en alle overige indel-percentages worden opgeteld als NHEJ met processing. Het totale detecteerbare herstel wordt berekend als HR plus NHEJ met processing.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/Supplemental File 3.xlsx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 4: Ruwe gegevens ten grondslag aan Figuur 3B en Figuur 4B, georganiseerd in afzonderlijke bewerkbare werkbladen. Deze gegevens werden opnieuw geanalyseerd op basis van de eerder gepubliceerde studies die worden geciteerd in de bijbehorende figuurbijschriften.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/Supplemental File S4_R1_v2.pdf" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

De DR-white assay is een veelzijdige genetische reporter-assay voor het detecteren van de resultaten van het herstel van DNA-dubbelstrengsbreuken in het meercellige organisme Drosophila melanogaster.

Het meten van het herstel van dubbelstrengs DNA-breuken met behulp van de DR-white-assay in Drosophila melanogaster

Traditionele studies naar het herstel van dubbelstrengsbreuken (DSB) in DNA zijn vaak beperkt tot biochemische onderzoeken of unicellulaire systemen (bijv. cellen, ...

Ons laboratorium is geïnteresseerd in het vakgebied van genoomintegriteit, met een focus op hoe cellen DNA-dubbelstrengsbreuken herstellen. In tegenstelling tot andere DNA-reparatieassays meet de Drosophila DR-white assay de herstel van dubbelstrengsbreuken in multicellulare contexten, waaronder somatische cellen en kiemcellen.Laat het nageslacht van de testkruising uitkomen nadat de genetische kruisingen en de inductie van dubbelstrengsbreuken zijn voltooid. Begin met het scoren van het nageslacht zodra de eerste vliegen verschijnen, gedurende ongeveer negen dagen. Anestheseer de vliegen met koolstofdioxide, of breng de vliegen over naar een leeg flacon zonder voedsel en vries ze gedurende ten minste 30 minuten in bij -20 °C. Plaats de vliegen op een vliegenpad. Identificeer voor de scoring de vliegen die de directe herhaling van de white- of DR-white-cassette dragen met behulp van RFP-fluorescentie. Score de oog- en lichaamskleuren. Het y-plus transgen dat gekoppeld is aan de DR-white-cassette produceert een tussenliggende bruine lichaamskleur die niet volledig wild-type is. Vergelijk deze vliegen met RFP-negatieve geel-witte nakomelingen zonder het DR-white-chromosoom om het uitblijven van een dubbelstrengsbreuk of non-homologous end joining te onderscheiden van single-strand annealing. Classificeer vliegen met donkerdere, bruinere lichamen als geen dubbelstrengsbreuk of non-homologous end joining. Neem alleen de flacons met ten minste 20 gescorede vliegen op in de dataset.Voor de moleculaire analyse van herstelgebeurtenissen worden de hittestress-behandelde vliegen verzameld die zowel de DR- white als de I-SceI transgenen dragen, zoals in het nageslacht van Kruising 1. Plaats individuele vliegen in microcentrifugebuisjes van 1,5 ml en vries de monsters snel in in een bad van droogijs en ethanol. Homogeniseer elk monster in 50 µL buffer A met behulp van een elektrische homogenisator. Incubeer de monsters vervolgens 30 minuten in een waterbad bij 65 °C. Voeg 100 µL buffer B toe aan elk monster en meng kort door de buisjes om te keren. Incubeer de monsters gedurende ten minste 30 minuten op ijs en centrifugeer ze vervolgens ongeveer 15 minuten bij 16.000 g bij 4 °C. Breng 125 µL van de geklaarde supernatant over naar een nieuw microcentrifugebuisje van 1,5 ml, waarbij elk neerslag wordt vermeden. Voeg 100 µL isopropanol toe en meng kort door de buis om te keren. Centrifugeer de monsters ongeveer 10 minuten bij 16.000 g bij kamertemperatuur. Aspireer de supernatant, waarbij zorgvuldig wordt voorkomen dat het DNA-precipitaat wordt verstoord. Was het precipitaat met 250 µL ijskoude 70% ethanol en meng voorzichtig door de buis om te keren. Centrifugeer de monsters ongeveer vijf minuten bij 16.000 g bij 4 °C en aspireer de supernatant opnieuw. Laat de buis ongeopend bij kamertemperatuur om het resterende ethanol te laten verdampen zonder het precipitaat te overdrogen. Voeg vervolgens 20 µL nucleasevrij water toe en laat het precipitaat overnacht bij 4 °C rehydrateren. Tik de volgende dag voorzichtig tegen de buis om te mengen en meet de DNA-concentratie.Amplificeer de Sce.white-regio via PCR met gebruik van 100 nanograms genomisch DNA en de DR- white forward- en reversprimers. Voeg genomisch DNA toe van een DR- white-controlevlieg die het I-SceI-transgen mist, en voer vervolgens de reactie uit onder geschikte cycluseringscondities. Breng ongeveer 2 microliters van het PCR-product aan op een 1% Tris-acetaat-EDTA-gel om de amplificatie van Sce.white te bevestigen. Controleer of het amplicon ongeveer 1,7 kilobases is en zuiver vervolgens de Sce.white-amplicons. Meet de DNA-concentratie en sequenceer het gezuiverde PCR-product met behulp van de DR- white sequencingprimer.Nadat de vereiste R-pakketten zijn gedownload, moeten de sequentiechromatogrammen worden gecontroleerd; selecteer alleen die chromatogrammen met weinig tot geen achtergrondruis voorafgaand aan de breekplaats voor analyse. Download de sequentie-tracebestanden met de .ab1-extensie. Plaats al deze bestanden in één computermap en vereenvoudig de bestandsnamen van de sequenties zoveel mogelijk. Open het TIED (Tracking of Indels by DEcomposition) R-script in de geïntegreerde ontwikkelomgeving van RStudio. Zoek in het bronvenster de regel die begint met "control" en voer de bestandsnaam van de controlesequentie exact in zoals deze is opgeslagen, inclusief de extensie tussen aanhalingstekens. Zoek de regel die begint met "sample name" en voer elke bestandsnaam van de monstersequenties in tussen de haakjes, waarbij elke bestandsnaam tussen afzonderlijke aanhalingstekens wordt geplaatst en gescheiden door komma's. Sla vervolgens het bewerkte TIED R-script op in dezelfde map als de sequenties die geanalyseerd moeten worden. Navigeer in de geïntegreerde ontwikkelomgeving naar de TIED-map via het tabblad "Files" in het uitvoervenster. Klik op het dropdownmenu "More" en selecteer "Open New Terminal Here". Typ in de nieuw geopende terminal "R" en druk op Enter. Zodra R is opgestart, kan het TIED R-script worden uitgevoerd door het "source"-commando met de bestandsnaam van het script te typen en op Enter te drukken. Het script genereert een grafische weergave en een CSV-bestand (comma-separated values) met de ruwe gegevens voor elk monster. Open elk CSV-bestand en interpreteer de ruwe gegevens als de proporties indels in de monstersequentie. Identificeer tot slot de canonieke deletie van 23 baseparen, die apart onderaan de output wordt vermeld, als de waarde voor homologe recombinatie. Interpreteer de waarde "0 indel" als geen dubbelstrengse breuk of non-homologe end-joining zonder indels, en sommeer de overige indel-waarden om de non-homologe end-joining met processing te bepalen.Succesvolle kiembaanexperimenten leverden de verwachte fenotypische klassen en ten minste 20 telbare nakomelingen per flesje op. In wild-type vliegen die hitte-induceerbaar I-SceI tot expressie brachten, vond homologe recombinatie plaats in ongeveer 38,5% van de nakomelingen, vergeleken met 3,2% voor single-strand annealing. In een DmRad51 homozygote mutante achtergrond werd homologe recombinatiereparatie gereduceerd tot ongeveer 1,3%, met een gelijktijdige toename in single-strand annealing-reparatie tot rond de 34,5%. In somatische cellen van een niet-mutante achtergrond was non-homologous end joining met processing verantwoordelijk voor ongeveer 59% van de detecteerbare reparatiegebeurtenissen, en homologe recombinatie voor 41%. In een DmCtIP homozygote mutante achtergrond werd de keuze voor het homologe recombinatiepad gereduceerd tot 10,9%.Dit protocol kan worden toegepast op diverse weefsels, ontwikkelingsstadia en genomische locaties om factoren te bepalen die de reparatie beïnvloeden. Bovendien is deze assay aangepast om reparatieresultaten te meten, zoals de lengtes van genconversiesporen en de voorkeur voor het reparatietemplate. Deze DNA-reparatie-assay kan worden gebruikt om diverse factoren bepalen die betrokken zijn bij reparatie met behulp van genetische mutanten in Drosophila.

measuring-dna-double-strand-break-repair-using-dr-white-assay

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Analyse van DNA dubbelstrengs breuken (DSB) Reparatie in zoogdiercellen

In this video, we describe the immunofluorescence microscopy technique to detect specific DNA damage response proteins localized at the sites of DNA double-strand breaks in human mononuclear cells. The proteins are recognized by specific primary antibodies, which in turn bind to fluorophore-tagged secondary antibodies that fluoresce during microscopic visualization, enabling visualization of the proteins as distinct fluorescent foci within the cell nuclei.

Immunofluorescence Microscopy for the Analysis of DNA Double-Strand Breaks

De embryonale epidermis zeer laat stadium Drosophila embryo's verschaft een in vivo systeem voor snelle steekwond respons-analyse en kunnen worden gecombineerd met genetische manipulatie of chemische behandelingen microinjectie studies gaan in wondgenezing voor de vertaling in zoogdierlijke modellen.

Micro-injectie wondproef en<em&gt; In vivo</em&gt; Lokalisatie van epidermale Wound Response Verslaggevers in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo&#39;s.

Reparatie van dubbele streng DNA pauzes is een dynamisch proces, waarbij niet alleen de vorming van reparatie complexen in de pauzes, maar ook hun resolutie na de laesie is gericht. Hier, gebruiken we immunofluorescentie microscopie voor voorbijgaande en langdurige double-stranded pauzes als een instrument om te ontleden dit genoom onderhoud mechanisme.

Karakterisering van de DNA-herstelsynthese op Transiënten- en Long-lasting Double-streng DNA-einden door immunofluorescentie microscopie

We presenteren een protocol met een voorwaartse genetische benadering van het scherm voor mutanten die neurodegeneratie in Drosophila melanogastertentoonstellen. Het bevat een klim test, histologie analyse, genmapping en DNA-sequencing om uiteindelijk nieuwe genen te identificeren die verband houden met het neuroprotectie proces.

In vivo genetisch scherm naar voren om nieuwe neuroprotectieve genen in Drosophila melanogaster te identificeren

Dit protocol is ontworpen om de levensvatbaarheid van Drosophila in elke ontwikkelingsfase, van embryo tot volwassene, te beoordelen. De methode kan worden gebruikt om de levensvatbaarheid van verschillende genotypen of groeiomstandigheden te bepalen en te vergelijken.

Een directe en eenvoudige methode om de levensvatbaarheid van Drosophila melanogasterte beoordelen van embryo tot volwassene

Integriteit van de bloed-hersen barrière is essentieel voor de functie van het zenuwstelsel. In Drosophila melanogasterwordt de bloed-hersen barrière gevormd door gliacellen tijdens de late embryogenese. Dit protocol beschrijft methoden voor het testen van de vorming en het onderhoud van de bloed-hersen barrière in D. melanogaster -embryo's en derde instar larven.

Test voor de integriteit van de bloed-hersen barrière in Drosophila melanogaster

In dit protocol laten we zien hoe dna dubbelstrengs eindresectie tijdens de S/G2-fase van de celcyclus kan worden gevisualiseerd met behulp van een op immunofluorescentie gebaseerde methode.

Beoordeling van wereldwijde DNA double-strand eindresectie met behulp van BrdU-DNA-labeling in combinatie met cell cycle discrimination imaging

Dit protocol beschrijft een extrachromosomale niet-homologe eindverbindingstest (NHEJ) en een homologe recombinatietest (HR) om de efficiëntie van NHEJ en HR in HEK-293T-cellen te kwantificeren.

Analyse van niet-homologe eindverbindingen en homologe recombinatie-efficiëntie in HEK-293T-cellen met behulp van op GFP gebaseerde reportersystemen

We presenteren protocollen voor de beoordeling van de vaardigheid van de dubbelstrengsbreukherstelroute in cellen met behulp van een reeks op luminescentie gebaseerde extrachromosomale reportersubstraten.

Beoordeling van de reparatieactiviteit van DNA-dubbelstrengsbreuken met behulp van high-throughput en kwantitatieve luminescentie-gebaseerde reporter-assays

Leer de DR-white-assay voor DNA-herstel in Drosophila melanogaster. Deze methode onderscheidt homologe recombinatie, NHEJ en SSA om reparatiemechanismen in meercellige organismen te bestuderen.

Het meten van het herstel van dubbelstrengs DNA-breuken met behulp van de DR-white-assay in Drosophila melanogaster

Meer video's verkennen