Elektroforetische scheiding van eiwitten

Het scheiden van individuele eiwitten uit complexe eiwitmengsels kan worden bereikt via gelelektroforese in polyacrylamidegelelektroforese, ook wel bekend als PAGE. Eiwitten migreren onder invloed van een elektrisch veld door poriën in de gelmatrix. De combinatie van de poriegrootte van de gel en de lading, grootte en vorm van het eiwit bepaalt de migratiesnelheid van het eiwit. In deze video demonstreren we een methode voor de elektroforetische scheiding van eiwitten.

Hallo, ik ben Dr. Bobul Chakravarti van het Proteomics Center van het Keck Graduate Institute of Applied Life Sciences. Vandaag ga ik u een procedure laten zien voor het uitvoeren van 1D-gelelektroforese. Laten we beginnen.

Begin met het assembleren van de glazen plaatjes van het elektroforeseapparaat volgens de instructies van de fabrikant, met behulp van twee schone glasplaten en twee spacers van 1,5 millimeter. Zet vervolgens de glazen platen vast aan het gietstatief. Bereid daarna de scheidingsgellopossing voor zoals beschreven in de huidige protocollen.

Voeg de gespecificeerde hoeveelheid 10% ammoniumper-sulfaat en TEMED toe aan de oplossing en roer voorzichtig om te mengen. Vanwege de hoge concentratie acrylamide is ontgassen niet nodig. Gebruik een wegwerpplastic pipet van 10 milliliter om de scheidingsgeloplossing onmiddellijk aan de sandwich toe te voegen langs de rand van een van de spacers, totdat de hoogte van de oplossing tussen de glasplaten ongeveer 11 centimeter bedraagt.

Gebruik vervolgens een andere pipette om de bovenkant van de gel langzaam te bedekken met een laag waterverzadigde isobutylalcohol of gedestilleerd water van ongeveer één centimeter dikte. Doe dit door het water voorzichtig tegen de rand van de één en vervolgens de andere spacer aan te brengen; laat de gel vervolgens 30 tot 60 minuten polymeriseren. Bij kamertemperatuur zorgt de waterlaag ervoor dat de acrylamidegel in een rechte lijn polymeriseert.

Zodra de gel gepolymeriseerd is, kunnen we de stapelgel gieten. Giet eerst de laag gedestilleerd water af en spoel vervolgens met één x tris CL in SDS bij een pH van 8.8. Bereid nu de stapelgeloplossing voor zoals aangegeven in de huidige protocollen.

Laat vervolgens, met behulp van een plastic pipet, de stackinggel-oplossing langzaam in het midden van de sandwich druppelen langs de rand van een van de spacers, totdat de hoogte van de oplossing in de sandwich ongeveer één centimeter onder de bovenkant van de platen ligt. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de stackinggel terechtkomen. Zodra de gel is gegoten, plaatst u een 0,75 millimeter Teflon kam in de laag stackinggel-oplossing.

Laat de stapelgeloplossing 30 tot 45 minuten polymeriseren bij kamertemperatuur; we kunnen nu de eiwitmonsters voorbereiden. Om te beginnen met de monstervoorbereiding van de eiwitten, wordt een deel van het te analyseren eiwitmonster in een verhouding van één-op-één verdund met twee XSDS-monsterbuffer.

Gebruik voor verdunde eiwitoplossingen een mengsel van eiwit en 6× SDS-monsterbuffer in een verhouding van vijf op één. Als het monster een neergeslagen eiwitpellet is, los het eiwit dan op in 50 tot 100 µL 1× SDS-monsterbuffer. Verhit de monsters vervolgens gedurende drie tot vijf minuten bij 100 °C in een afgesloten microcentrifugebuis met schroefdop in een waterbad.

Verwijder vervolgens voorzichtig de Teflon-kam zonder de randen van de polyacrylamide-wells te scheuren. Nadat de kam is verwijderd, worden de wells gespoeld met 1X SDS-elektroforesebuffer. Vul daarna de wells met een pipet met 1X SDS-elektroforesebuffer.

Zodra de putjes zijn gespoeld en gevuld met buffer, bevestigt u de gel-sandwich aan de bovenste bufferkamer. Vul, volgens de instructies van de fabrikant, de onderste bufferkamer met de aanbevolen hoeveelheid één XSDS-elektroforesebuffer. Plaats vervolgens de sandwich, die aan de bovenste bufferkamer is bevestigd, in de onderste bufferkamer.

Vul nu de bovenste bufferkamer volledig met XSDS-elektroforesebuffer, zodat de monsterputjes van de stapelgel met buffer zijn gevuld. De gel is nu klaar om te worden beladen met een automatische pipetteur van 25 of 100 microliter met gellaadtips; breng het eiwitmonster zorgvuldig aan als een dunne laag op de bodem van één of meer putjes. Belad de controleputjes met moleculaire gewichtsstandaarden.

Voeg daarna een gelijk volume 1X SDS-monsterbuffer toe aan alle lege putjes om te voorkomen dat aangrenzende banen uitlopen. We zijn nu klaar om te beginnen met de gelelektroforese. Om de gel te laten lopen, sluit u de voeding aan op de cel en laat u deze lopen bij een constante stroomsterkte van 30 mA voor een slabgel van 1,5 mm dik.

Zodra de mentholblauwe trackingkleurstof de onderkant van de scheidingsgel heeft bereikt, dient u de spanningsbron uit te schakelen. Nu de elektroforese is voltooid, gooit u de elektroforesebuffer weg en verwijdert u de bovenste bufferkamer samen met de bevestigde gelsandwich. Positioneer de gel zodanig dat de volgorde van de monsterputjes bekend is.

Verwijder vervolgens de sandwich uit de bovenste bufferkamer en leg deze op een vel absorptiepapier of keukenpapier. Schuif daarna voorzichtig een van de spacers over de gehele lengte tot halverwege vanaf de rand van de sandwich. Gebruik de blootgestelde spacer als hefboom om de glasplaat open te wrikken, zodat de gel voorzichtig wordt blootgelegd.

Verwijder de gel uit de onderste plaat. Snijd een klein driehoekje uit een hoek van de gel, zodat de oriëntatie van de banen niet verloren gaat tijdens het kleuren en drogen. De procedure voor gelelektroforese is nu voltooid.

De gel kan nu worden verwerkt met behulp van diverse eiwitdetectieprocedures. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe eiwitten kunnen worden gescheiden met behulp van gelelektroforese. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experiment.