Name: Elektroforetische scheiding van eiwitten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-12T13:29:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Leer elektroforetische scheiding van eiwitten met polyacrylamide gelelektroforese (PAGE). Deze methode scheidt eiwitten op basis van lading en grootte voor biochemisch en proteomics onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De volledige tekst protocol voor deze experimentele aanpak is beschikbaar in <a href="http://www.mrw.interscience.wiley.com/emrw/9780471142720/cp/cpmb/article/mb1002a/current/abstract" target="_blank">Current Protocols in Molecular Biology</a> .

De auteurs hebben niets te melden.

elektroforetische scheiding van eiwitten

Electrophoretic Separation of Proteins

Elektroforese wordt gebruikt om complexe mengsels van eiwitten (bijvoorbeeld van cellen, subcellulaire fracties, kolom breuken of immunoprecipitaten) te scheiden, om subunit composities te onderzoeken en om de homogeniteit van eiwit monsters te controleren. Het kan ook dienen om eiwitten te zuiveren voor gebruik in verdere toepassingen. In polyacrylamidegelelektroforese, eiwitten migreren als reactie op een elektrisch veld door de poriën in een polyacrylamide gel matrix; poriegrootte afneemt met toenemende acrylamide concentratie. De combinatie van poriegrootte en eiwit lading, de grootte en de vorm bepaalt de migratie snelheid van het eiwit. In deze unit, is de standaard Laemmli methode beschreven voor discontinue gelelektroforese onder denaturerende omstandigheden, dat wil zeggen, in het bijzijn van natriumdodecylsulfaat (SDS).

In deze video tonen we een methode voor de elektroforetische scheiding van eiwitten met behulp van poly-acrylimide gelelektroforese (PAGE).

Elektroforetische scheiding van eiwitten

Elektroforese wordt gebruikt om complexe mengsels van eiwitten te scheiden (bijv. uit cellen, subcellulaire fracties, kolomfracties of immunoprecipitaten), om ...

Het scheiden van individuele eiwitten uit complexe eiwitmengsels kan worden bereikt via gelelektroforese in polyacrylamidegelelektroforese, ook wel bekend als PAGE. Eiwitten migreren onder invloed van een elektrisch veld door poriën in de gelmatrix. De combinatie van de poriegrootte van de gel en de lading, grootte en vorm van het eiwit bepaalt de migratiesnelheid van het eiwit. In deze video demonstreren we een methode voor de elektroforetische scheiding van eiwitten.Hallo, ik ben Dr. Bobul Chakravarti van het Proteomics Center van het Keck Graduate Institute of Applied Life Sciences. Vandaag ga ik u een procedure laten zien voor het uitvoeren van 1D-gelelektroforese. Laten we beginnen.Begin met het assembleren van de glazen plaatjes van het elektroforeseapparaat volgens de instructies van de fabrikant, met behulp van twee schone glasplaten en twee spacers van 1,5 millimeter. Zet vervolgens de glazen platen vast aan het gietstatief. Bereid daarna de scheidingsgellopossing voor zoals beschreven in de huidige protocollen.Voeg de gespecificeerde hoeveelheid 10% ammoniumper-sulfaat en TEMED toe aan de oplossing en roer voorzichtig om te mengen. Vanwege de hoge concentratie acrylamide is ontgassen niet nodig. Gebruik een wegwerpplastic pipet van 10 milliliter om de scheidingsgeloplossing onmiddellijk aan de sandwich toe te voegen langs de rand van een van de spacers, totdat de hoogte van de oplossing tussen de glasplaten ongeveer 11 centimeter bedraagt.Gebruik vervolgens een andere pipette om de bovenkant van de gel langzaam te bedekken met een laag waterverzadigde isobutylalcohol of gedestilleerd water van ongeveer één centimeter dikte. Doe dit door het water voorzichtig tegen de rand van de één en vervolgens de andere spacer aan te brengen; laat de gel vervolgens 30 tot 60 minuten polymeriseren. Bij kamertemperatuur zorgt de waterlaag ervoor dat de acrylamidegel in een rechte lijn polymeriseert.Zodra de gel gepolymeriseerd is, kunnen we de stapelgel gieten. Giet eerst de laag gedestilleerd water af en spoel vervolgens met één x tris CL in SDS bij een pH van 8.8. Bereid nu de stapelgeloplossing voor zoals aangegeven in de huidige protocollen.Laat vervolgens, met behulp van een plastic pipet, de stackinggel-oplossing langzaam in het midden van de sandwich druppelen langs de rand van een van de spacers, totdat de hoogte van de oplossing in de sandwich ongeveer één centimeter onder de bovenkant van de platen ligt. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de stackinggel terechtkomen. Zodra de gel is gegoten, plaatst u een 0,75 millimeter Teflon kam in de laag stackinggel-oplossing.Laat de stapelgeloplossing 30 tot 45 minuten polymeriseren bij kamertemperatuur; we kunnen nu de eiwitmonsters voorbereiden. Om te beginnen met de monstervoorbereiding van de eiwitten, wordt een deel van het te analyseren eiwitmonster in een verhouding van één-op-één verdund met twee XSDS-monsterbuffer.Gebruik voor verdunde eiwitoplossingen een mengsel van eiwit en 6× SDS-monsterbuffer in een verhouding van vijf op één. Als het monster een neergeslagen eiwitpellet is, los het eiwit dan op in 50 tot 100 µL 1× SDS-monsterbuffer. Verhit de monsters vervolgens gedurende drie tot vijf minuten bij 100 °C in een afgesloten microcentrifugebuis met schroefdop in een waterbad.Verwijder vervolgens voorzichtig de Teflon-kam zonder de randen van de polyacrylamide-wells te scheuren. Nadat de kam is verwijderd, worden de wells gespoeld met 1X SDS-elektroforesebuffer. Vul daarna de wells met een pipet met 1X SDS-elektroforesebuffer.Zodra de putjes zijn gespoeld en gevuld met buffer, bevestigt u de gel-sandwich aan de bovenste bufferkamer. Vul, volgens de instructies van de fabrikant, de onderste bufferkamer met de aanbevolen hoeveelheid één XSDS-elektroforesebuffer. Plaats vervolgens de sandwich, die aan de bovenste bufferkamer is bevestigd, in de onderste bufferkamer.Vul nu de bovenste bufferkamer volledig met XSDS-elektroforesebuffer, zodat de monsterputjes van de stapelgel met buffer zijn gevuld. De gel is nu klaar om te worden beladen met een automatische pipetteur van 25 of 100 microliter met gellaadtips; breng het eiwitmonster zorgvuldig aan als een dunne laag op de bodem van één of meer putjes. Belad de controleputjes met moleculaire gewichtsstandaarden.Voeg daarna een gelijk volume 1X SDS-monsterbuffer toe aan alle lege putjes om te voorkomen dat aangrenzende banen uitlopen. We zijn nu klaar om te beginnen met de gelelektroforese. Om de gel te laten lopen, sluit u de voeding aan op de cel en laat u deze lopen bij een constante stroomsterkte van 30 mA voor een slabgel van 1,5 mm dik.Zodra de mentholblauwe trackingkleurstof de onderkant van de scheidingsgel heeft bereikt, dient u de spanningsbron uit te schakelen. Nu de elektroforese is voltooid, gooit u de elektroforesebuffer weg en verwijdert u de bovenste bufferkamer samen met de bevestigde gelsandwich. Positioneer de gel zodanig dat de volgorde van de monsterputjes bekend is.Verwijder vervolgens de sandwich uit de bovenste bufferkamer en leg deze op een vel absorptiepapier of keukenpapier. Schuif daarna voorzichtig een van de spacers over de gehele lengte tot halverwege vanaf de rand van de sandwich. Gebruik de blootgestelde spacer als hefboom om de glasplaat open te wrikken, zodat de gel voorzichtig wordt blootgelegd.Verwijder de gel uit de onderste plaat. Snijd een klein driehoekje uit een hoek van de gel, zodat de oriëntatie van de banen niet verloren gaat tijdens het kleuren en drogen. De procedure voor gelelektroforese is nu voltooid.De gel kan nu worden verwerkt met behulp van diverse eiwitdetectieprocedures. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe eiwitten kunnen worden gescheiden met behulp van gelelektroforese. Dat is alles.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experiment.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video demonstrates a denaturing polyacrylamide-based separation technique for proteins. This technique helps in the preliminary identification of proteins based on their molecular weights.

Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis for Protein Analysis: A Technique to Separate and Visualize Proteins Based on Molecular Weight

This video describes multimeric PAGE for separating native protein complexes from tissue homogenates. The technique is a hybrid of blue native-PAGE and SDS-PAGE techniques. The separated complexes can be characterized and studied for their role in cell functioning.

Multimer-PAGE for Separating Native Protein Complexes: A Hybrid Separation Technique Consisting of Blue Native-PAGE and SDS-PAGE to Separate Intact Multimeric Proteins From Tissue Lysate

In this video, we demonstrate a two-dimensional gel electrophoresis method that separates individual proteins from a complex protein mixture obtained from tumor tissues of human nonfunctional pituitary adenoma (NFPA). The proteins are separated based on their electric charge in the first dimension and further separated based on molecular weights in the second dimension.

Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis: A Separation Technique for Analysis of Proteins in Complex Protein Mixture Based on Charge and Molecular Weight

Dit protocol beschrijft hoe je clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE) kunt voorbereiden en uitvoeren, een native scheidingstechniek voor niet-covalente biomoleculaire assemblages en eiwitten uit heterogene monsters die compatibel is met verschillende downstream-eiwitanalysetechnieken.

CN-GELFrEE - Clear Inheems Gel-uitgewassen vloeibare fractie Entrapment elektroforese

Na de scheiding door elektroforetische methoden, kunnen eiwitten in een gel worden gedetecteerd door verschillende kleuren methoden. Kleuring van eiwitten met Coomassie Blauw, Zilver kleuring, SYPRO Orange, SYPRO Ruby worden gedemonstreerd in deze video.

Kleuring Eiwitten in Gels

Microcontact afdrukken wordt op grote schaal gebruikt voor het patroon eiwitten en andere moleculen op materiaal oppervlakken. Tonen we de basisstappen van dit proces, stempelen patronen van fibronectine op glas.

Microcontact afdrukken van eiwitten voor Celbiologie

Paring en tetrade scheiding nodig zijn voor genetische analyse...

Paring en Viertal Scheiding van Chlamydomonas reinhardtii Voor Genetische analyse

Rat MSC's werden geïsoleerd uit dijbeen en dij-en vervolgens verrijkt door magnetische celsortering. Gesorteerde cellen werden bevestigd voor de expressie van de oppervlakte markers door flowcytometrie. Deze cellen werden ook gekweekt in klonale dichtheid aan enkele kolonies vormen en vervolgens deze kolonies werden van elkaar gescheiden door het klonen van cilinders.

Isolatie en Verrijking van Rat mesenchymale stamcellen (MSC&#39;s) en de scheiding van Single-kolonie Derived MSC&#39;s

De protocollen beschrijven de essentiële stappen voor het verkrijgen van diffractie kwaliteit kristallen van een membraaneiwit vanaf reconstructie van het eiwit in een lipidische kubieke fase (LCP), het vinden van de eerste voorwaarden met LCP-FRAP pre-kristallisatie assays, het opzetten van LCP kristallisatie onderzoeken en oogsten kristallen .

Kristallisatie van membraaneiwitten in lipide mesofasen

Calmoduline (CAM) pull-down test is een effectieve manier om de interactie van CaM te onderzoeken met verschillende eiwitten. Deze methode maakt gebruik van CAM-sepharose kralen voor een efficiënte en specifieke analyse van de CAM-bindende eiwitten. Dit levert een belangrijk instrument om CaM signalering verkennen in cellulaire functie.

Pull-down van calmoduline-bindende eiwitten

Leer elektroforetische scheiding van eiwitten met polyacrylamide gelelektroforese (PAGE). Deze methode scheidt eiwitten op basis van lading en grootte voor biochemisch en proteomics onderzoek.

Elektroforetische scheiding van eiwitten

Meer video's verkennen