Immunoblot analyse
June 20th, 2008
Immunoblotting (western blotting) is een snelle en gevoelige test voor de detectie en karakterisering van eiwitten die werkt door het benutten van de specificiteit die inherent zijn aan antigeen-antilichaam erkenning. Deze video bevat protocollen voor de scheiding van eiwitten, blotting eiwitten op membranen, immunoprobing, en visualisatie met behulp van chromogene of chemiluminescent substraten.
Immuno blotting, vaak aangeduid als Western blotting, wordt gebruikt om specifieke antigenen te identificeren die binnen een eiwitmonster worden herkend door polyklonale of monoklonale antilichamen. Deze procedure volgt doorgaans een of 2D gel-elektroforese en omvat de overdracht van gescheiden eiwitten naar nitrocellulosemembranen. Incubatie van deze membranen met primaire en secundaire antilichamen, direct of indirect geconjugeerd aan enzymen en visualisatie van eiwitagenten op deze membranen met behulp van gekleurde of fluorescente substraatreacties.
In deze video geven we een stapsgewijze demonstratie van een immunoblottingprocedure. Hallo, ik ben Sean Gallagher van UVPI in samenwerking met een proteomisch centrum hier aan het KE Graduate Institute. Vandaag ga ik je immunoblotanalyse laten zien.
Het omvat een aantal stappen, waaronder eiwitscheiding, blotting van de eiwitten op membranen, immunoprobing en visualisatie met chromogene en kim luminescentie substraten. Dus laten we beginnen. Voordat de immunoblotprocedure wordt gestart, moeten de eiwitmonsters eerst worden gescheiden door elektroforese met behulp van kleine of standaard formaat een- of tweedimensionale gels.
Bereid de antigene monsters voor en laad ze in de banen op de gel, inclusief voorgekleurde of biotinyleren eiwitten, moleculaire gewichtsstandaarden in een of meer van de gelbanen. Deze eiwitmarkeringen zullen naar het membraan overgaan en geven gemakkelijk de oriëntatie van het membraan en de grootte van eiwitten aan na immunokleuring. Zodra de elektroforese voltooid is, zijn we klaar om de immunoblot te assembleren.
Om de immunoblot te assembleren, moet eerst de gelsandwich worden gedemonteerd en het stackinggel worden verwijderd. Evenwichtig het gel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in overdrachtsbuffer. Deze evenwichting is vereist om een verandering in de grootte van het gel tijdens de overdracht te voorkomen terwijl het gel in evenwicht is. Begin met het samenstellen van de overdrachtssandwich in een lade die groot genoeg is om de plastic overdrachtscassette te vullen met overdrachtsbuffer zodat de cassette bedekt is. Plaats nu een Scotch Bright pad of spons op de onderste helft van de plastic overdrachtscassette.
Neem vervolgens een vel filterpapier dat op dezelfde grootte als de gel is gesneden. Bevochtig het vooraf met overdrachtsbuffer en plaats het bovenop de Scotch Bright pad. Zodra de 30 minuten gel-evenwichting is voltooid, plaatst u de gel bovenop het filterpapier.
Verwijder eventuele luchtbellen tussen het gel en het filterpapier door voorzichtig een testbuisje of glazen staaf over het oppervlak van het gel te rollen. Of je kunt de BioRad-roller gebruiken, die bij de BioRad-kit wordt geleverd. Denk eraan om handschoenen te dragen bij het hanteren van filterpapieren, gels en membranen.
Olie van je handen zal de overdracht blokkeren. Bereid vervolgens het overdrachtsmembraan voor. Knip het membraan op dezelfde grootte als het gel plus één tot twee millimeters aan elke rand.
Plaats het membraan vervolgens langzaam in gedistilleerd water met één rand onder een hoek van 45 graden, het water zal in het membraan trekken en uiteindelijk het hele oppervlak bevochtigen. Als het te snel in het water wordt ingebracht, komt lucht vast te zitten en zal het verschijnen als witte vlekken in het membraan. Het eiwit zal niet op deze gebieden worden overgebracht.
Zodra het membraan volledig nat is, evenwichtig het gedurende 10 tot 15 minuten en overdrachtsbuffer. Deze bevochtigingsprocedure werkt voor nitrocellulose en nylon membranen. Alleen PVDF-membranen zijn hydrofoob en worden niet gewoon nat door geplaatst te worden in gedistilleerd water of overdrachtsbuffer.
PVDF-membranen moeten eerst worden ondergedompeld in 100% methanol gedurende één tot twee seconden, vervolgens evenwichtig gedurende 10 tot 15 minuten. In overdrachtsbuffer. Laat het membraan op geen enkel moment drogen.
Als dit gebeurt, bevochtig het opnieuw met methanol en vervolgens met de overdrachtsbuffer. Zodra het membraan klaar is, plaatst u het voorgewekte membraan direct op de bovenkant van de gel. Vergeet niet om alle luchtbellen tussen het gel en het membraan te verwijderen door voorzichtig een testbuis, glazen staaf of BioRad-roller over het oppervlak van het membraan te rollen.
Bevochtig vervolgens een ander stuk watman drie mm filterpapier. Plaats het vervolgens op het membraan en verwijder opnieuw alle luchtbellen. Plaats vervolgens nog een Scotch Bright pad of spons bovenop dit filterpapier.
Voltooi de assemblage van de immunoblotsandwich door de bovenste helft van de overdrachtscassette op zijn plaats te vergrendelen. Nu de immunoblotsandwich is geassembleerd, zijn we klaar om de eiwitten van de gel naar het membraan over te brengen. Om de overdrachtsprocedure te starten, vult u de elektroblottingtank met overdrachtsbuffer en plaatst u de overdrachtscassette met de sandwich in het elektroblottingapparaat.
Het is belangrijk dat de sandwich zodanig is dat het membraan het anode of positief geladen deel van de tank toedraait. Verbind de leidingen van de voeding met de corresponderende anode en kathode kanten van het elektroblottingapparaat. Deze specifieke criterion blotter wordt geleverd met een koel-ijsblok.
Nu elektroforetische overdracht eiwitten van gel naar membraan gedurende 30 tot 60 minuten bij 50 volt met koeling of 's nachts bij 14 volt in een koude kamer. Wanneer de overdracht is voltooid, schakel de voeding uit en demonteer het apparaat. Verwijder vervolgens het membraan van het blottingapparaat en noteer de oriëntatie door een hoek af te snijden.
Op dit punt kunnen membranen worden gedroogd en in een hersluitbare plastic zak worden bewaard bij vier graden Celsius gedurende één jaar. Voorafgaand aan verdere verwerking, moeten gedroogde PVDF-membranen in een kleine hoeveelheid 100% methanol worden geplaatst om het membraan te bevochtigen. Vervolgens in gedistilleerd water om het methanol te verwijderen.
Zodra de oriëntatie is gemarkeerd, kleurt u de gel om de overdrachtsefficiëntie te verifiëren. Om overgedragen eiwitten te visualiseren, kunt u het membraan omkeerbaar met cipro ruby of onomkeerbaar met kamasi blue India inkt, naftol blue of colloïdaal goud kleuren. Deze onomkeerbare
Overzicht
Deze video demonstreert de immunoblotting (western blotting) techniek, een gevoelige methode voor eiwitdetectie en karakterisering. Het behandelt protocollen voor eiwitscheiding, blotting op membranen, immunoprobering en visualisatie.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Biochemie
- Proteomics
- Moleculaire biologie
Achtergrond
- Immunoblotting identificeert specifieke antigenen in eiwitmonsters.
- Het volgt typisch gelelektroforese voor eiwitscheiding.
- Eiwitten worden overgebracht naar membranen voor verdere analyse.
- Antilichamen worden gebruikt voor detectie en kwantificering van eiwitten.
Doel van de studie
- Om een stapsgewijze demonstratie van de immunoblotting procedure te geven.
- Om de belangrijkheid van eiwitoverdracht en visualisatietechnieken te illustreren.
- Om het begrip van antigeen-antilichaam interacties in eiwitanalyse te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Elektroforese voor eiwitscheiding met behulp van 1D of 2D gels.
- Overdracht van eiwitten naar nitrocellulose of nylon membranen.
- Incubatie met primaire en secundaire antilichamen.
- Visualisatie met behulp van chromogene of chemiluminescente substraten.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle overdracht van eiwitten, aangegeven door moleculaire gewichtsstandaarden.
- Visualisatie van eiwitbanden door middel van kleuringstechnieken.
- Identificatie van specifieke antigenen met behulp van antilichamen.
- Kwantificering van eiwitniveaus op basis van antilichaambinding.
Conclusies
- Immunoblotting is een betrouwbare methode voor eiwitdetectie.
- Juiste techniek zorgt voor nauwkeurige overdracht en visualisatie.
- Deze methode is essentieel voor het bestuderen van eiwitexpressie en functie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Immunoblotting provides a sensitive and specific method for detecting target proteins in complex biological samples, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking in drug discovery. By enabling quantitative assessment of antigen-antibody interactions, it enhances predictive confidence in pathway modulation and biomarker relevance. This assay is routinely used to triage therapeutic hypotheses and prioritize leads based on functional protein expression data.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by detecting specific antigens recognized by polyclonal or monoclonal antibodies.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct visualization of target engagement and pathway modulation.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by providing functional protein expression data to assess target relevance and mechanism of action.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows by confirming protein transfer and membrane integrity.
- Reproducibility: Enables standardized protein detection through consistent electrophoretic separation and transfer conditions.
- Quantitative Output: Supports reliable compound evaluation via chemiluminescent or chromogenic visualization of protein bands.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase target validation to preclinical models through consistent antigen detection across systems.
- Biomarker Alignment: Supports identification of disease-relevant protein modifications or expression shifts linked to pharmacological intervention.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement criteria by verifying target modulation in relevant biological contexts.
Pipeline & Workflow Integration
Immunoblotting functions as a key assay in the discovery continuum, linking early target hypothesis testing to lead identification and preclinical validation through reliable protein detection and quantification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by identifying specific antigens in protein samples following gel electrophoresis.
- Screening: Enables assay readiness through standardized protein transfer to nitrocellulose, PVDF, or nylon membranes with detectable molecular weight markers.
- Analytics: Provides quantitative readouts via antibody-based detection, enabling comparison of protein levels across experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by verifying target presence and modulation in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Serves as a reusable platform for protein detection across multiple projects, reducing redundant assay development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct antigen detection.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined transfer, blocking, and visualization protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing functional protein data that reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on verified target engagement and pathway modulation data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein electrophoresis, membrane handling, and antibody-based detection techniques.
- Depends on instrumentation for gel electrophoresis, electro blotting, and imaging systems for chromogenic or chemiluminescent detection.
- Necessitates cross-team standardization of blocking buffers, antibody dilution ranges, and wash conditions to ensure reproducibility.
- Involves adaptation considerations for different membrane types (nitrocellulose, PVDF, nylon) and their respective pretreatment and blocking requirements.
- Limited by the need for high-quality, specific antibodies and optimized blocking conditions to minimize background signal.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title/ Prologue
0:56
Introduction
1:22
Separating Protein Samples by Gel Electrophoresis
2:06
Assembling the Immunoblot Sandwich
5:43
Transferring Proteins from Gel to Membrane
7:52
Immunoprobing Membrane with Directly Conjugated Secondary Antibody
10:45
Immunoprobing with Avidin-Biotin Coupling to Secondary Antibody
14:26
Visualization of Immunoblot with Chromogenic Substrates
15:32
Conclusion
