Immunoblot analyse
20 juni 2008
Immunoblotting (western blotting) is een snelle en gevoelige test voor de detectie en karakterisering van eiwitten die werkt door het benutten van de specificiteit die inherent zijn aan antigeen-antilichaam erkenning. Deze video bevat protocollen voor de scheiding van eiwitten, blotting eiwitten op membranen, immunoprobing, en visualisatie met behulp van chromogene of chemiluminescent substraten.
Immuno blotting, vaak aangeduid als Western blotting, wordt gebruikt om specifieke antigenen te identificeren die binnen een eiwitmonster worden herkend door polyklonale of monoklonale antilichamen. Deze procedure volgt doorgaans een of 2D gel-elektroforese en omvat de overdracht van gescheiden eiwitten naar nitrocellulosemembranen. Incubatie van deze membranen met primaire en secundaire antilichamen, direct of indirect geconjugeerd aan enzymen en visualisatie van eiwitagenten op deze membranen met behulp van gekleurde of fluorescente substraatreacties.
In deze video geven we een stapsgewijze demonstratie van een immunoblottingprocedure. Hallo, ik ben Sean Gallagher van UVPI in samenwerking met een proteomisch centrum hier aan het KE Graduate Institute. Vandaag ga ik je immunoblotanalyse laten zien.
Het omvat een aantal stappen, waaronder eiwitscheiding, blotting van de eiwitten op membranen, immunoprobing en visualisatie met chromogene en kim luminescentie substraten. Dus laten we beginnen. Voordat de immunoblotprocedure wordt gestart, moeten de eiwitmonsters eerst worden gescheiden door elektroforese met behulp van kleine of standaard formaat een- of tweedimensionale gels.
Bereid de antigene monsters voor en laad ze in de banen op de gel, inclusief voorgekleurde of biotinyleren eiwitten, moleculaire gewichtsstandaarden in een of meer van de gelbanen. Deze eiwitmarkeringen zullen naar het membraan overgaan en geven gemakkelijk de oriëntatie van het membraan en de grootte van eiwitten aan na immunokleuring. Zodra de elektroforese voltooid is, zijn we klaar om de immunoblot te assembleren.
Om de immunoblot te assembleren, moet eerst de gelsandwich worden gedemonteerd en het stackinggel worden verwijderd. Evenwichtig het gel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in overdrachtsbuffer. Deze evenwichting is vereist om een verandering in de grootte van het gel tijdens de overdracht te voorkomen terwijl het gel in evenwicht is. Begin met het samenstellen van de overdrachtssandwich in een lade die groot genoeg is om de plastic overdrachtscassette te vullen met overdrachtsbuffer zodat de cassette bedekt is. Plaats nu een Scotch Bright pad of spons op de onderste helft van de plastic overdrachtscassette.
Neem vervolgens een vel filterpapier dat op dezelfde grootte als de gel is gesneden. Bevochtig het vooraf met overdrachtsbuffer en plaats het bovenop de Scotch Bright pad. Zodra de 30 minuten gel-evenwichting is voltooid, plaatst u de gel bovenop het filterpapier.
Verwijder eventuele luchtbellen tussen het gel en het filterpapier door voorzichtig een testbuisje of glazen staaf over het oppervlak van het gel te rollen. Of je kunt de BioRad-roller gebruiken, die bij de BioRad-kit wordt geleverd. Denk eraan om handschoenen te dragen bij het hanteren van filterpapieren, gels en membranen.
Olie van je handen zal de overdracht blokkeren. Bereid vervolgens het overdrachtsmembraan voor. Knip het membraan op dezelfde grootte als het gel plus één tot twee millimeters aan elke rand.
Plaats het membraan vervolgens langzaam in gedistilleerd water met één rand onder een hoek van 45 graden, het water zal in het membraan trekken en uiteindelijk het hele oppervlak bevochtigen. Als het te snel in het water wordt ingebracht, komt lucht vast te zitten en zal het verschijnen als witte vlekken in het membraan. Het eiwit zal niet op deze gebieden worden overgebracht.
Zodra het membraan volledig nat is, evenwichtig het gedurende 10 tot 15 minuten en overdrachtsbuffer. Deze bevochtigingsprocedure werkt voor nitrocellulose en nylon membranen. Alleen PVDF-membranen zijn hydrofoob en worden niet gewoon nat door geplaatst te worden in gedistilleerd water of overdrachtsbuffer.
PVDF-membranen moeten eerst worden ondergedompeld in 100% methanol gedurende één tot twee seconden, vervolgens evenwichtig gedurende 10 tot 15 minuten. In overdrachtsbuffer. Laat het membraan op geen enkel moment drogen.
Als dit gebeurt, bevochtig het opnieuw met methanol en vervolgens met de overdrachtsbuffer. Zodra het membraan klaar is, plaatst u het voorgewekte membraan direct op de bovenkant van de gel. Vergeet niet om alle luchtbellen tussen het gel en het membraan te verwijderen door voorzichtig een testbuis, glazen staaf of BioRad-roller over het oppervlak van het membraan te rollen.
Bevochtig vervolgens een ander stuk watman drie mm filterpapier. Plaats het vervolgens op het membraan en verwijder opnieuw alle luchtbellen. Plaats vervolgens nog een Scotch Bright pad of spons bovenop dit filterpapier.
Voltooi de assemblage van de immunoblotsandwich door de bovenste helft van de overdrachtscassette op zijn plaats te vergrendelen. Nu de immunoblotsandwich is geassembleerd, zijn we klaar om de eiwitten van de gel naar het membraan over te brengen. Om de overdrachtsprocedure te starten, vult u de elektroblottingtank met overdrachtsbuffer en plaatst u de overdrachtscassette met de sandwich in het elektroblottingapparaat.
Het is belangrijk dat de sandwich zodanig is dat het membraan het anode of positief geladen deel van de tank toedraait. Verbind de leidingen van de voeding met de corresponderende anode en kathode kanten van het elektroblottingapparaat. Deze specifieke criterion blotter wordt geleverd met een koel-ijsblok.
Nu elektroforetische overdracht eiwitten van gel naar membraan gedurende 30 tot 60 minuten bij 50 volt met koeling of 's nachts bij 14 volt in een koude kamer. Wanneer de overdracht is voltooid, schakel de voeding uit en demonteer het apparaat. Verwijder vervolgens het membraan van het blottingapparaat en noteer de oriëntatie door een hoek af te snijden.
Op dit punt kunnen membranen worden gedroogd en in een hersluitbare plastic zak worden bewaard bij vier graden Celsius gedurende één jaar. Voorafgaand aan verdere verwerking, moeten gedroogde PVDF-membranen in een kleine hoeveelheid 100% methanol worden geplaatst om het membraan te bevochtigen. Vervolgens in gedistilleerd water om het methanol te verwijderen.
Zodra de oriëntatie is gemarkeerd, kleurt u de gel om de overdrachtsefficiëntie te verifiëren. Om overgedragen eiwitten te visualiseren, kunt u het membraan omkeerbaar met cipro ruby of onomkeerbaar met kamasi blue India inkt, naftol blue of colloïdaal goud kleuren. Deze onomkeerbare
Overzicht
Deze video demonstreert de immunoblotting-techniek (western blotting), een gevoelige assay voor de detectie en karakterisering van eiwitten. Het behandelt protocollen voor eiwitscheiding, overdracht op membranen, immunoprobing en visualisatie.
Belangrijkste Onderdelen van de Studie
Wetenschapsgebied
- Biochemie
- Proteomica
- Moleculaire biologie
Achtergrond
- Immunoblotting identificeert specifieke antigenen in eiwitmonsters.
- Het volgt doorgaans op gelelektroforese voor de scheiding van eiwitten.
- Eiwitten worden overgebracht naar membranen voor verdere analyse.
- Antilichamen worden gebruikt voor de detectie en kwantificering van eiwitten.
Doel van de studie
- Om een stapsgewijze demonstratie te geven van de immunoblotting-procedure.
- Om het belang van proteïneoverdracht en visualisatietechnieken te illustreren.
- Om het begrip van antigeen-antilichaaminteracties bij proteïneanalyse te vergroten.
Gebruikte methoden
- Elektroforese voor eiwitseparatie met behulp van 1D- of 2D-gels.
- Overdracht van eiwitten naar nitrocellulose- of nylonmembranen.
- Incubatie met primaire en secundaire antilichamen.
- Visualisatie met behulp van chromogene of chemiluminescente substraten.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle overdracht van eiwitten, aangegeven door moleculaire gewichtsstandaarden.
- Visualisatie van eiwitbanden via kleurtechnieken.
- Identificatie van specifieke antigenen met behulp van antilichamen.
- Kwantificering van eiwitniveaus op basis van antilichaambinding.
Conclusies
- Immunoblotting is een betrouwbare methode voor eiwitdetectie.
- Een correcte techniek waarborgt een nauwkeurige overdracht en visualisatie.
- Deze methode is essentieel voor het bestuderen van eiwitexpressie en -functie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Immunoblotting biedt een gevoelige en specifieke methode voor het detecteren van doeleiwitten in complexe biologische monsters, wat bijdraagt aan doelwitvalidatie in een vroeg stadium en het verminderen van mechanische risico's bij de ontdekking van geneesmiddelen. Door een kwantitatieve beoordeling van antigeen-antilichaaminteracties mogelijk te maken, wordt het voorspellend vertrouwen in padmodulatie en de relevantie van biomarkers vergroot. Deze assay wordt routinematig gebruikt om therapeutische hypothesen te screenen en leads te prioriteren op basis van functionele eiwitexpressiegegevens.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het onderzoeken van therapeutische hypothesen mogelijk door specifieke antigenen te detecteren die worden herkend door polyklonale of monoklonale antilichamen.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door directe visualisatie van target-interactie en modulatie van signaalpaden.
- Voorspellende waarde: Faciliteert portfolio-triage door functionele proteïne-expressiegegevens te leveren om de relevantie van het target en het werkingsmechanisme te beoordelen.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor de assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream-workflows door eiwitoverdracht en membraanintegriteit te bevestigen.
- Reproduceerbaarheid: Maakt gestandaardiseerde eiwitdetectie mogelijk via consistente elektroforetische scheidings- en transfercondities.
- Kwantitatieve output: Ondersteunt betrouwbare evaluatie van verbindingen via chemiluminescente of chromogene visualisatie van eiwitbanden.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Verbindt targetvalidatie in de ontdekkingsfase met preklinische modellen door middel van consistente antigeendetectie over verschillende systemen heen.
- Afstemming van biomarkers: Ondersteunt de identificatie van ziekterelateerde eiwitmodificaties of verschuivingen in expressie die gekoppeld zijn aan farmacologische interventie.
- Risicogebaseerde besluitvorming: Informeert de criteria voor verdere ontwikkeling door targetmodulatie te verifiëren in relevante biologische contexten.
Integratie van Pijplijn & Workflow
Immunoblotting fungeert als een essentiële assay in het ontdekkingscontinuüm, waarbij vroege hypothesetests voor targets worden gekoppeld aan de identificatie van lead-verbindingen en preklinische validatie door middel van betrouwbare proteïnedetectie en -kwantificering.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van pathways door specifieke antigenen in eiwitmonsters te identificeren na gelelektroforese.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk via gestandaardiseerde eiwitoverdracht naar nitrocellulose-, PVDF- of nylonmembranen met detecteerbare molecuulgewichtmarkers.
- Analytics: Biedt kwantitatieve uitlezingen via antilichaamgebaseerde detectie, waardoor vergelijking van eiwitniveaus over verschillende experimentele condities mogelijk is.
- Translationeel onderzoek: Verbindt discovery met preklinische continuïteit door de aanwezigheid en modulatie van targets in ziekterelevante systemen te verifiëren.
- Enterprise Reuse: Dient als een herbruikbaar platform voor eiwitdetectie in meerdere projecten, waardoor redundante assay-ontwikkeling wordt verminderd.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen in target-validatie door mechanische ambiguïteit te verminderen via directe antigeendetectie.
- Operationele waarde: Garandeert standaardisatie en reproduceerbaarheid door gedefinieerde protocollen voor transfer, blokkering en visualisatie.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door functionele proteïnegegevens te leveren die het biologische risico in een laat stadium verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk op basis van geverifieerde gegevens over target-engagement en pathway-modulatie.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in eiwitelektroforese, membraanbehandeling en antilichaamgebaseerde detectietechnieken.
- Afhankelijk van instrumentatie voor gelelektroforese, electro-blotting en beeldvormingssystemen voor chromogene of chemiluminescente detectie.
- Vereist standaardisatie tussen teams van blokkeringsbuffers, antilichaamverdunningsreeksen en wascondities om reproduceerbaarheid te waarborgen.
- Omvat aanpassingen voor verschillende membraantypes (nitrocellulose, PVDF, nylon) en hun respectievelijke voorbehandeling- en blokkeringsvereisten.
- Beperkt door de noodzaak van specifieke antilichamen van hoge kwaliteit en geoptimaliseerde blokkeringscondities om achtergrondsignalen te minimaliseren.
Veelgestelde vragen over biofarmaceutica
Chapters in this video
0:00
Title/ Prologue
0:56
Introduction
1:22
Separating Protein Samples by Gel Electrophoresis
2:06
Assembling the Immunoblot Sandwich
5:43
Transferring Proteins from Gel to Membrane
7:52
Immunoprobing Membrane with Directly Conjugated Secondary Antibody
10:45
Immunoprobing with Avidin-Biotin Coupling to Secondary Antibody
14:26
Visualization of Immunoblot with Chromogenic Substrates
15:32
Conclusion
