Kleuring Eiwitten in Gels

In een eerder video-item getiteld Elektroforetische Scheiding van Eiwitten, toonden we hoe een complexe mix van eiwitten gescheiden kon worden met behulp van gelelektroforese. In deze video laten we je vier verschillende gelkleuringsmethoden zien voor het visualiseren van de locatie van de eiwitten in de gel. Hallo, ik ben Sean Gallagher van UVP, werkzaam bij het Proteomics Center hier bij het KEG Graduate Institute.

Vandaag laat ik je een aantal technieken zien om eiwitten te visualiseren na scheiding door middel van elektroforese. Dit omvat Kamasi blauw zilverkleuring, cyro oranje en cyro robijn. Dus laten we beginnen met Kamasi blauw eerst.

De detectie van eiwitbanden in een gel door Kamasi blauwkleuring is gebaseerd op niet-specifieke binding van een kleurstof. In dit geval Kamasi briljantblauw G twee 50. Bij deze methode worden eiwitten gescheiden in een polyacrylamidegel gewassen met water van hoge zuiverheid.

De locatie van de eiwitten wordt vervolgens gedetecteerd met behulp van een op water gebaseerde kamasi blauwe vlek. De detectielimiet is 0,3 tot één microgram per eiwitband. Om te beginnen, begin met een polyacrylamidegel waarin eiwitten gescheiden zijn door elektroforese.

Tijdens het schudden plaats je de polyacrylamidegel langzaam in een plastic container gevuld met 300 milliliter water van hoge zuiverheid. Laat het vijf minuten staan. Gooi het weg en herhaal nog twee keer na de derde wasbeurt.

Giet het water weg en bedek de gel met Kamasi blauwe kleuringsoplossing gedurende één uur terwijl je langzaam schudt. Na één uur kleuren giet je de kleuringsoplossing weg. Spoel de gel kort door hem in ongeveer 200 milliliter water te plaatsen gedurende 30 minuten. Op dit punt kan de gel in water worden bewaard voor toekomstige beeldvorming.

De gel kan ook in dit stadium worden gedroogd om een permanent gelrecord te behouden. Om dit te doen, plaats je de gel op twee vellen Watman drie mm filterpapier en bedek je de bovenkant met plasticfolie. Droog vervolgens in een conventionele geldroger gedurende één tot twee uur bij ongeveer 80 graden Celsius.

Een andere eiwitkleuringsmethode is door middel van zilverkleuring, wat we nu zullen demonstreren. Hoewel de Kamasi blauwe kleuringsmethode eenvoudiger en sneller is, is zilverkleuring aanzienlijk gevoeliger met een detectielimiet van 0,3 nanogram BSA. De detectie van eiwitbanden in een gel door middel van zilverkleuring is gebaseerd op de binding van zilver aan verschillende chemische groepen in het eiwit.

Het volgende protocol is gebaseerd op de Silver Quest zilverkleuringskit van in Vitrogen. Het protocol is afgeleid van het snelle kleuringsprotocol, ongeveer 30 minuten en vertegenwoordigt een van de vele kit-gebaseerde chemische processen die worden gebruikt voor zilverkleuring die compatibel is met massaspectrometrie. In dit geval zullen we een in vitrogen voorgegoten mini-gel gebruiken voordat we beginnen met zilverkleuring.

Zorg ervoor dat je altijd handschoenen draagt om verontreiniging door vingerafdrukken te voorkomen. Plaats de gel in een magnetronveilige bak met 100 milliliter reagentiakwaliteit water. Spoel kort en giet dan het water weg.

Voeg vervolgens 100 milliliter fixeermiddel toe, bestaande uit 40%ethanol, 10%azijnzuur in water van hoge zuiverheid en magnetron gedurende 30 seconden. Het magnetronproces verkort de noodzakelijke incubatiestappen door de binding en kleuring te versnellen. Plaats op dit punt de gel op een shaker en schud langzaam gedurende vijf minuten.

Na vijf minuten giet je het fixeermiddel weg, voeg 100 milliliter 30%ethanol toe om de gel te wassen, magnetron gedurende 30 seconden en plaats vervolgens de gel op een shaker gedurende vijf minuten. Na vijf minuten giet je de ethanol weg. Voeg nu 100 milliliter gevoeligmakend reagens toe, magnetron gedurende 30 seconden en plaats vervolgens op een shaker gedurende twee minuten.

Na de twee minuten giet je het gevoeligmakende reagens weg. Voeg 100 milliliter reagentiakwaliteit water toe, magnetron gedurende 30 seconden en plaats op een shaker gedurende twee minuten. Giet weg en herhaal voor een totaal van twee wascycli.

Voeg nu 100 milliliter kleuringsoplossing toe, magnetron gedurende 30 seconden en schud gedurende vijf minuten. Na de vijf minuten giet je de kleuringsoplossing weg. Voeg 100 milliliter reagentiakwaliteit water toe, sla de magnetron over en plaats direct gedurende 20 tot 60 seconden op een shaker.

Gooi het water weg en voeg onmiddellijk 100 milliliter van de ontwikkelingsoplossing toe en ontwikkel tot de eiwitbanden zichtbaar worden. Met een heldere achtergrond zal dit ongeveer vijf tot tien minuten duren. Voeg op dit punt 10 milliliter stopoplossing toe aan de ontwikkelaar om de ontwikkeling te stoppen voor de beste resultaten.

Fotografieer de gel zo snel mogelijk, omdat er lichte veranderingen in kleurintensiteit en toenames in niet-specifieke achtergrondelementen kunnen optreden. Na verloop van tijd bevat de gel die je ziet resteiwitten. Na elektroblotting droog je de gel om een permanent record te behouden of bewaar je hem in een afsluitbare plastic zak. Vervolgens demonstreren we een methode voor fluorescerende gelkleuring.

Fluorescente kleurstoffen hebben een aantal voordelen boven traditionele eiwitkleuringen. Cipro oranje eiwitgelkleuringen, die we hier zullen beschrijven, kunnen één tot twee nanogram eiwit per band detecteren. Dit is gevoeliger dan kamasi briljantblauwe kleuring en even gevoelig als veel zilverkleuringstechnieken.

Fluorescente kleuring is eenvoudig met minder hands-on tijd dan typische zilverkleuringsprotocollen en is klaar in minder dan een uur. Gekleurde eiwitten kunnen worden gevisualiseerd met behulp van een standaard 300 nanometer UV-transluminator of een laserscanner. In dit geval zullen we weer een in vitrogen voorgegoten mini-gel gebruiken om eiwitten voor te bereiden en te scheiden met behulp van SDS-pagina.

Maar gebruik 0,05%SDS in de loopbuffer in plaats van de gebruikelijke 0,1%SDS om de achtergrondfluorescentie te verminderen. Om de kleuringsprocedure te beginnen, giet je cipro o