Name: Elektroporatie van mycobacteriën (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-05-23T14:35:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Leer elektroporatie van mycobacteriën voor genetische manipulatie met Mycobacterium smegmatis. Dit protocol optimaliseert transformatie-efficiëntie en omvat essentiële veiligheidsmaatregelen voor pathogene stammen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs hebben niets te melden.

elektroporatie van mycobacteriën

Electroporation of Mycobacteria

Hoge efficiëntie transformatie is een grote beperking in de studie van mycobacteriën. Het geslacht Mycobacterium kan moeilijk zijn om te transformeren, dit wordt voornamelijk veroorzaakt door de dikke en de wasachtige celwand, maar wordt verergerd door het feit dat de meeste moleculaire technieken zijn ontwikkeld voor de verte-verwante soorten, zoals Escherichia coli en Bacillus subtilis. Ondanks deze obstakels, hebben mycobacteriële plasmiden zijn geïdentificeerd en DNA-transformatie van een groot aantal mycobacteriële soorten zijn inmiddels beschreven. De meest succesvolle methode voor het introduceren van DNA in mycobacteriën is elektroporatie. Veel parameters bij te dragen tot een succesvolle transformatie, deze omvatten de soort / stam, de aard van het transformerende DNA, de gebruikte selecteerbare merker, het groeimedium, en de voorwaarden voor de elektroporatie pols. Geoptimaliseerde methoden voor de transformatie van zowel langzaam-en snel-groeier zijn hier beschreven. Transformatie efficiëntie voor verschillende mycobacteriële species en met verschillende selecteerbare merkers worden gerapporteerd.

Mycobacteriële pathogene strategieën blijven slecht begrepen. De langzame groei van de meeste soorten, de ondoordringbare karakter van de cel-wand, en de gevaren van het werken met pathogenen maken mycobacteriën moeilijk om te studeren en zijn grotendeels verantwoordelijk voor onze slechte begrip van deze organismen. In deze video laten we zien de techniek van elektroporatie, die onderwerpen cellen gaat om een ​​korte hoge elektrische impuls om de toegang van het DNA. Het is de meest gebruikte methode voor het introduceren van DNA in mycobacteriële cellen.

Elektroporatie van mycobacteriën

Hoogefficiënte transformatie is een belangrijke beperking bij de studie naar mycobacteriën. Het genus Mycobacterium kan moeilijk te transformeren zijn; dit komt hoofdzakelijk ...

Mycobacteriële pathogene strategieën worden nog onvoldoende begrepen vanwege de trage groeisnelheid van de meeste soorten. De ondoordringbare aard van de celwand en de risico's die verbonden zijn aan het werken met pathogenen maken mycobacteriën moeilijk te bestuderen, wat grotendeels verantwoordelijk is voor ons beperkte begrip van deze organismen. In deze video demonstreren we de techniek van electroporatie, waarbij cellen worden blootgesteld aan een korte en krachtige elektrische impuls, waardoor DNA de cel kan binnendringen.Het is de meest gebruikte methode om DNA in mycobacteriële cellen te introduceren. Hallo, ik ben Ron Good van het laboratorium van Tanya Parish van het Center of Infectious Disease aan Barts and the London School of Medicine and Dentistry. Vandaag laten we u een procedure zien voor het electroporeren van mycobacteriën.In ons laboratorium bestuderen we microbacterium tuberculosis, maar omdat dit zeer pathogeen is en een C3-containmentfaciliteit vereist, zullen we u deze techniek demonstreren met het niet-pathogene microbacterium m Mcma. Laten we nu enkele bacteriën elektroporeren. Om mycobacteriën te elektroporeren, moeten we competente cellen maken.Het is belangrijk om te onthouden dat pathogene mycobacteriën een aanzienlijk biologisch risico vormen. Daarom moeten alle kweek- en genetische manipulaties worden uitgevoerd in een geschikte inperkingsfaciliteit, zoals een veiligheidskabinet klasse I. Een risicoanalyse moet de eerste stap vormen van elk experiment met pathogene mycobacteriën.Om deze te maken, beginnen we met de cultuur die in het laboratorium is onderhouden op vaste media zoals lemko, auger inoculate, vijf mils Lemko met tween-bouillon, waarbij een lus vol mycobacteriën wordt geïnoculeerd. Aangezien veel mycobacteriën relatief traag groeiende organismen zijn, is het uiterst belangrijk om een goede aseptische techniek te hanteren om contaminatie van deze culturen met bacteriën of schimmels te voorkomen, die de mycobacteriën snel kunnen overgroeien. Het is vaak verstandig om dubbele culturen aan te leggen voor het geval één ervan gecontamineerd raakt.Mycobacteriecellen hebben de neiging om in kweek te klonteren vanwege hun dikke wasachtige wand. Vortexen en de toevoeging van een niet-ionisch detergent, zoals tween 82 medium, vermindert deze klontering en zorgt voor een homogenere suspensie van cellen. Incubeer de kweek na inoculatie gedurende één nacht bij 37 °C met schudden op 100 RPM.Nadat de startcultuur is gegroeid, inoculeert u een cultuur op grotere schaal van ongeveer 100 ml lemko tw in een conische kolf van 250 ml met een 1:100 verdunning van de overnight-cultuur. Ga verder met incuberen bij 37 °C onder schudding gedurende ongeveer 16 tot 24 uur, waarna de optische dichtheid met de spectrofotometer kan worden gecontroleerd. Als de waarde tussen 0,8 en 1 ligt, bevinden de cellen zich in hun optimale logaritmische groeifase.Incubeer de cellen vervolgens 1,5 uur op ijs voordat u ze oogst; dit helpt om de transformatie-efficiëntie met een factor vier te verhogen. Langere incubaties op ijs leiden tot een verminderde efficiëntie. Oogst daarna de cellen door de culturen in grote centrifugebuizen te gieten.Centrifugeer 10 minuten bij 300 Gs. Was de cellen na de centrifugatie drie keer in ijskoud 10% glycerol en verminder telkens het volume; voor een cultuurvolume van 100 mL wordt 20 mL gebruikt voor de eerste wasbeurt, daarna 10 mL en tot slot 5 mL voor de laatste wasbeurt. Resuspendeer de cellen na de wasbeurten in 1/10 tot 1/100 van het oorspronkelijke volume ijskoud 10% glycerol. In dit stadium kunnen de cellen in aliquoten worden verdeeld, worden ingevroren en bij -70 °C worden bewaard voor toekomstig gebruik.De transformatie-efficiëntie neemt vaak toe na het invriezen van de cellen. Voordat deze competente cellen worden gebruikt, moeten ze ontdooid, geoogst door centrifugatie en resuspendeerd worden in vers, 10% glycerol voorafgaand aan gebruik. Om te electroporeren is een electroporator nodig, een apparaat dat een hoogspanningspuls van 2,5 kV kan afgeven.Er worden kilovolts gebruikt. Bacteriën en DNA worden in electroporatie-cuvetten geplaatst. Hoewel de tussenruimte of padlengte in verschillende cuvetten gelijk kan zijn, variëren ze wat betreft het volume dat ze kunnen bevatten.We gebruiken routinematig 200 µL cellen in een 0,2 cm qve om de cellen te behandelen. Bereid eerst de DNA-monsters voor zodat deze vrij zijn van zouten en andere verontreinigingen. Dit is belangrijk om de kans op overslag tijdens de elektroporatie te minimaliseren.Zorg ervoor dat uw DNA-monsters van hoge zuiverheid zijn voordat u overgaat tot de poratie van bacteriën. De ratio van absorptie bij 260 nm ten opzichte van 280 nm moet dicht bij 1,8 liggen. Voeg 0,5 tot 5 µg zoutvrij DNA in een volume van maximaal 5 µL toe aan 200 µL microbacteriële suspensie. Er kan een controle-elektroporatie zonder DNA worden uitgevoerd om de frequentie van antibiotica-resistente mutanten te controleren.Laat het mengsel vervolgens 10 minuten op ijs staan. Dit vermindert de aanwezigheid van levende cellen in het monster en zouten in de DNA-oplossing, wat overslag na de incubatie op ijs minimaliseert; verdeel de cellen voor de hoogspanningspuls grondig met een pipet of vortex om de cellen opnieuw te suspenderen en een goede menging van het DNA te waarborgen. Elke klontering van de cellen zal leiden tot overslag en de transformatie-efficiëntie verminderen.Breng het mengsel vervolgens over naar een vooraf gekoelde 0,2 centimeter elektrodekubette. Let hierbij opnieuw op dat er geen luchtbellen in het mengsel terechtkomen. Dit is tevens om overslag te verminderen.Zorg ervoor dat de buitenkant van de qve volledig droog is voordat deze in de pulskamer wordt geplaatst. Nadat de qve grondig is gedroogd en de weerstand van de pulscontroller op duizend ohm is ingesteld, plaatst u de qve in de elektroporatiekamer. Stel vervolgens de spanning in op 2,5 kilovolt en dient u de puls toe totdat er een pieptoon klinkt, wat aangeeft dat de condensator in de QVE is ontladen.Een tijdconstante van meer dan 10 wijst op een succesvolle elektroporatie. Een mislukte elektroporatie wordt meestal aangegeven door overslag, wat een vonk veroorzaakt en vaak voorkomen kan worden. Pas de weerstand op de pulscontroller aan en plaats de Q vet gedurende 10 minuten terug op ijs.Breng na incubatie de celsuspensie over naar een steriel universeel flesje met 5 ml lemko TW-bouillon. Het is belangrijk om de cellen direct na de puls minstens tienvoudig te verdunnen om de cellen te helpen herstellen en de overleving van de transformanten te verhogen. Incubeer de cellen vervolgens twee tot drie uur bij 37 °C, waarna ze klaar zijn om te worden uitgeplaat. Oogst na de incubatie de cellen door middel van centrifugatie bij 3000 ×g gedurende 10 minuten.Maak na centrifugatie een geschikte verdunning van de suspensie in lemko-bouillon, zodanig dat elke plaat 30 tot 300 kolonies zal bevatten. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat resistente kolonies uit een enkele cel zijn ontstaan, dus zorg ervoor dat de cellen grondig zijn geresuspendeerd vóór het uitplaten. Als de cellen niet worden verdund, kan het zeer moeilijk zijn om werkelijk resistente kolonies te visualiseren tegen een achtergrond van een gazon van gevoelige cellen; plaat de cellen nu uit op lemko-agar met het geschikte antibioticum.De platen worden geïncubeerd bij 37 °C totdat de kolonies zichtbaar worden. Dit duurt drie tot vijf dagen nadat de kolonies zijn gegroeid. Tel de transformanten.Om de transformatie-efficiëntie te berekenen. Verschillende factoren beïnvloeden de efficiëntie van de transformatie. Hiertoe behoren de groeifase van de cellen bij het oogsten, de electroporatiemedia en de veldsterkte en tijdconstante van de afgegeven puls.De efficiëntie van de elektroporatietechniek hangt ook af van de keuze van het DNA voor transformatie, en soms van de keuze van de selecteerbare marker. We bereiken routinematig efficiënties van 10⁵ tot 10⁶ kolonies per µg DNA, gebruikmakend van hygromycine- of streptomycine-resistentie in ems magma. Om de transformanten nu uit te laten groeien, worden de geëlektroporeerde mycobacteriën uitgeplaatst op vast medium met selectie.Broed de antibiotica bij 37 °C gedurende twee tot drie dagen. Na deze incubatieperiode van twee tot drie dagen kunnen de transformanten worden geanalyseerd; voor de meeste toepassingen moeten drie transformanten worden uitgeplaatst en geanalyseerd. Het is belangrijk om de identiteit van het extracromosomale plasmide na transformatie te controleren.Aangezien deleties en herschikkingen gebruikelijk zijn, heb ik zojuist gedemonstreerd hoe u Mycobacterium smegmatis elektroporeert. Als u deze procedure uitvoert met pathogene mycobacteriën, denk er dan aan om passende veiligheidsmaatregelen te nemen. Dat is alles.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Source: Stefan, A., et al., The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the procedure for transforming Escherichia coli with a plasmid carrying an antibiotic resistance gene, including cell preparation, electroporation, recovery, and selection of transformants.

Preparation and Transformation of Bacteria Using High-Voltage Electroporation

Elektroporatie is een algemeen gebruikte werkwijze voor het introduceren van DNA in bacteriën in een proces dat transformatie. Traditionele protocollen voor de bereiding van elektrocompetente cellen tijdrovend en arbeidsintensief. Dit artikel beschrijft een alternatieve, snelle en efficiënte werkwijze voor de bereiding van elektrocompetente cellen thans werkzaam sommige laboratoria.

Rapid protocol voor de bereiding van Elektrocompetente<em&gt; Escherichia coli</em&gt; En<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporatie werd gebruikt om gezuiverde bacteriële virulentie-effectoreiwitten direct in levende eukaryote cellen te insereeren. De lokalisatie van eiwitten werd bewaakt door confocale immunofluorescentiemicroscopie. Deze methode maakt studies mogelijk over transport, functie en eiwit-eiwit-interacties met behulp van actieve exogene eiwitten, waardoor de noodzaak voor heterologe expressie in eukaryote cellen wordt vermeden.

Elektroporatie van functionele bacteriële effectoren in zoogdiercellen

Dit protocol beschrijft de microfabricagetechnieken die nodig zijn om een lab-on-a-chip, microfluïdisch elektroporatieapparaat te bouwen. De experimentele opstelling voert gecontroleerde transfecties op één celniveau uit in een continue stroom en kan worden uitgebreid naar hogere doorvoersnelheden met populatiegebaseerde controle. Er wordt een analyse verstrekt die de mogelijkheid toont om de mate van celmembraanpermeabilisatie in realtime elektrisch te bewaken.

De fabricage en werking van een continu flow, micro-elektroporatiesysteem met permeabilisatiedetectie

Dit protocol beschrijft grootte-uitsluitingschromatografie, een gemakkelijke en reproduceerbare techniek voor het verrijken van Mycobacterium tuberculosis extracellulaire blaasjes uit kweeksupernatanten.

Mycobacterium tuberculose Extracellulaire vesikelverrijking door grootte-uitsluitingschromatografie

Elektroporatie van plasmide-DNA in skeletspieren is een haalbare methode om genexpressie te moduleren zonder de spiercontractiliteit bij muizen in gevaar te brengen.

Elektroporatie van plasmide-DNA in de skeletspieren van de muis

Dit protocol beschrijft de verrijking van inheemse mycobacteriële extracellulaire vesikels (mEV's) uit axenische culturen van Mycobacterium smegmatis (Msm) en hoe mCherry (een rode fluorescerende reporter)-bevattende recombinante MsmEV's kunnen worden ontworpen en verrijkt. Ten slotte verifieert het de nieuwe aanpak met de verrijking van MsmEV's die het EsxA-eiwit van Mycobacterium tuberculosis bevatten.

Verrijking van inheemse en recombinante extracellulaire blaasjes van mycobacteriën

We beschrijven een eenvoudige procedure voor de single-copy chromosomale complementatie van een effluxpompgen met behulp van een mini-Tn7-gebaseerd expressiesysteem in een gemanipuleerde efflux-deficiënte stam van Acinetobacter baumannii. Dit nauwkeurige genetische hulpmiddel maakt gecontroleerde genexpressie mogelijk, wat essentieel is voor de karakterisering van effluxpompen in multiresistente pathogenen.

Karakterisering van multidrug effluxsystemen in Acinetobacter baumannii met behulp van een efflux-deficiënte bacteriestam en een single-copy genexpressiesysteem

Dit protocol beschrijft de CTAB-methode om hoogwaardige DNA uit mycobacteriën te extraheren, waarbij de uitdagingen van hun harde, mycolinezuurrijke celwanden worden overwonnen. Het proces omvat enzymatische vertering, cellysie met CTAB en DNA-zuivering door organische extractie en ethanolprecipitatie. Deze methode produceert DNA dat geschikt is voor moleculaire studies en is betrouwbaar voor mycobacterieel onderzoek.

Extractie van het volledige genoom van deoxyribonucleïnezuur uit Mycobacterium-soorten via de Cetyltrimethylammoniumbromide-techniek

Hier presenteren we een protocol voor intravitale beeldvorming van een verzwakte, door BSL-2 goedgekeurde Mycobacterium tuberculosis. Spanning in de muislong met behulp van een permanent longvenster. Deze benadering maakt longitudinale, enkelcelresolutie-analyse mogelijk van vroege interacties tussen gastheer en pathogeen, waaronder bacillaire lokalisatie, vasculaire dynamiek en opname van macrofagen binnen dezelfde longmicroomgeving.

Intravitale beeldvorming van verzwakte auxotrofe mycobacterium tuberculosis in muislong tijdens vroege intravasculaire infectie

Leer elektroporatie van mycobacteriën voor genetische manipulatie met Mycobacterium smegmatis. Dit protocol optimaliseert transformatie-efficiëntie en omvat essentiële veiligheidsmaatregelen voor pathogene stammen.

Elektroporatie van mycobacteriën

Meer video's verkennen