Moleculaire evolutie van de Tre recombinase

Mijn naam is Frank Alz. Ik ben groepsleider bij het Maxx Plunk Institute for Macular Cell Biology and Genetics in Dresden. Ik ga nu spreken over ons werk aan de ontwikkeling van locatie-specifieke recombinasen voor moleculaire chirurgie.

In essentie als een instrument om vooraf gedefinieerde sequenties uit het genoom te kunnen excideren, en meer specifiek om HIV-geïnfecteerde cellen van het virus te ontdoen. Dus in feite om het HIV-provirus uit het genoom van geïnfecteerde cellen te excideren. Een ander concept is dat we een reeds goed gevesteerd genetisch instrument aanpassen, namelijk de Cre-recombinase, om een vooraf gedefinieerde targetsite te binden, te herkennen en te gebruiken.

We stelden ons daarom de vraag of we een site-specifieke recombinase konden maken die bindt aan een site die van nature voorkomt in de LTR van een HIV-virus. Indien dat zou lukken, voorspelden we dat het mogelijk zou moeten zijn om het provirus uit het genoom uit te snijden. In essentie doorloopt de virale levenscyclus een fase waarin het virus integreert in de cellen en vervolgens via reverse transcriptie een DNA-template maakt, dat geflankeerd wordt door twee terminale repeats.

Deze worden lange terminale repeats of korte LTR's genoemd. Deze worden vervolgens naar de kern gebracht en integreren meer of minder willekeurig in het genoom van de gastheer. Je bevindt je nu in een situatie waarin er sprake is van een zogenaamd provirus, dat geïntegreerd is en geflankeerd wordt door twee lange terminale repeats, door twee LTR's.

Het concept was nu dat wanneer we een recombinase zouden kunnen maken die een sequentie herkent die in het LTR voorkomt, we het provirus als een cyclus uit het genoom van de gastheer zouden kunnen excideren en zo het virus uit de cellen kunnen uitroeien. Dat was het conceptuele idee. De recombinase is in feite een DNA-bindend eiwit en vindt een zeer specifieke site.

Het heeft dus een DNA-bindingsdomein dat een bepaalde sequentie binnen het DNA herkent. Pas wanneer het deze exacte sequentie vindt, is het enzym actief. Het is niet actief op enige andere sequenties.

De principes van moleculaire evolutie zijn in wezen bekend bij iedereen, omdat het in feite niets anders is dan kweken. Een principe van moleculaire evolutie is dat men mutaties introduceert, waarna er een selectieproces volgt waarbij een bepaalde eigenschap wordt geselecteerd. Dit is hetzelfde als bij plantenveredeling.

U weet dat u een bepaalde grootte of een bepaalde kleur wilt, en u selecteert vervolgens telkens weer nakomelingen voor de volgende generatie die over deze specifieke kenmerken beschikken, om ze vervolgens met elkaar te kruisen. Dat is exact hetzelfde als wat we doen met moleculen. In wezen is het hetzelfde principe, maar dan op kleine schaal.

We beginnen met een enzym dat een bepaalde activiteit bezit, in ons geval de CRE-recombinase, en vervolgens starten we met een wildtype-eiwit. We muteren daarna licht de site waar deze recombinase aan bindt, waardoor er nog een zeer, zeer geringe activiteit is. Vervolgens introduceren we willekeurige mutaties in het enzym, de recombinase, en selecteren we mutanten die nu in staat zijn om aan deze gemuteerde site te binden.

Zodra we dit hebben, kunnen we de verschillende mutanten vervolgens combineren om uiteindelijk tot het gewenste eindproduct te komen, zodat de recombinase de sequentie herkent die we in de LTR hebben gedefinieerd. Zoals ik al zei, beginnen we met een random mutagen library. Dit gebeurt doorgaans via error-prone PCR.

We maken gebruik van PCR-condities, waarbij bijvoorbeeld een Taq-polymerase veel fouten maakt. Op deze manier genereren we een willekeurige bibliotheek met mutaties verspreid over het geheel. We kunnen ook een mutator-stam gebruiken, een bacteriële mutator-stam, die veel mutaties introduceert in bepaalde transcripten.

En deze worden vervolgens als startmateriaal gebruikt. De andere technologie die we gebruiken, is dat we na verloop van tijd DNA-shuffling toepassen. Dat is in feite een techniek waarmee verschillende gunstige mutaties gecombineerd kunnen worden, omdat je niet precies weet welke van de mutaties gunstig is, maar je zult verschillende mutanten hebben met uiteenlopende mutaties.

Stel dat u één gen heeft met een mutatie op deze positie, die gunstig is. U heeft een tweede kloon met een mutatie op deze positie, en om deze twee samen te voegen, voert u nu een willekeurige fragmentatie van de verschillende stukken uit en brengt u dit vervolgens samen in een PCR-reactie om de producten opnieuw te assembleren. Nu zult u met een bepaalde frequentie een combinatie van de twee hebben, waarbij een deel van de recombinatie is opgebouwd uit deze mutant en een deel is opgebouwd uit deze mutant.

En vervolgens zal dit onderdeel een aanvullend effect hebben dat de selectie zal verbeteren, waardoor u veel sneller de kandidaten kunt selecteren die de gewenste eigenschappen bezitten. Ik zou de definitie vaststellen waarbij ik aangeef dat het wildtype-eiwit absoluut geen activiteit vertoont op een bepaalde site. Als we bijvoorbeeld de sequentie nemen die we hebben geselecteerd uit de LTR van het HIV-LTR en we proberen cre-recombinase op die sequentie, dan zal er absoluut geen activiteit zijn.

CRE-recombinase is niet in staat om de site te recombineren en je hebt per definitie een nieuwe recombinase wanneer je vervolgens een enzym hebt dat in staat is om deze sequentie te binden en te recombineren. We hadden vooraf niet bepaald hoeveel cycli we zouden uitvoeren, maar we voerden zoveel cycli uit als nodig waren totdat we een enzym hadden met de gewenste activiteit. We zijn dus begonnen met zeer geringe mutaties in de site en zijn vervolgens begonnen met het combineren van de verschillende mutaties.

Dit was een van de cruciale stappen waardoor dit proces werkte. We zijn door verschillende tussenproducten gegaan en moesten deze vele cycli doorlopen om een enzym te vinden dat actief genoeg is om door te gaan naar de volgende cyclus. Het lijkt sterk op elk kweekproces.

U stelt een bepaalde gewenste activiteit of een bepaalde gewenste eigenschap vast en begint vervolgens met het fokken. Totdat u het gewenste resultaat heeft bereikt, bent u er nog niet en moet u meer generaties doorlopen. Dat is in feite hoe het werkt.

Ik moet er ook bij vermelden dat de 120 evolutiecycli, of honderdvijfentwintig om precies te zijn, enkel dienden om een tussenstap te vinden waarbij we konden stellen dat we konden stoppen omdat er enige activiteit was. De recombinatie die we nu hebben is nog steeds minder actief dan de CRE-recombinase in de wildtype-vorm. Om een actievere recombinase te verkrijgen, zouden we meer evolutiecycli moeten doorlopen.

Dus het eindigt in principe niet waar we nu staan voor het evolutieproces. Ik zie geen technische beperkingen. Het is echter de vraag hoe ver men dit kan doorvoeren.

Dus de locks LTR-zijde, de sequentie die u vindt in de LTR HA, vertoont 50% sequentie-overeenkomst met de natuurlijke locks P-zijde, de natuurlijke zijde die het queer-recombinase herkent. De vraag is dus of men zelfs nog verder kan gaan; dit weten we nog niet, maar het feit dat we slechts 50% sequentie-overeenkomst met de wild-type site hebben, suggereert dat dit nog verder gepusht kan worden. Het recombinase werkt goed in menselijke weefselkweekcellen, hoewel het, zoals ik al zei, niet zo actief is als het queer-recombinase op zijn eigen site.

De stabiliteit is waarschijnlijk iets lager dan die van de query-recombinase, het wildtype-enzym, waardoor meer selectie en meer evolutiecycli nodig zouden zijn om deze eigenschappen in de toekomst te verbeteren. De eerste stap is dus dat we de site verbeteren, deze specifieke recombinase, de drie-recombinase, actiever maken, mogelijk andere prominente sites vinden die goede doelwitten in een LTR zouden zijn, en een zeer geschikte recombinase hiervoor vinden. Vervolgens zouden we deze recombinase in verschillende assays moeten testen, eerst opnieuw in weefselkweekcellen, maar daarna zeer belangrijk, deze recombinase testen in diermodellen.

We zouden dus moeten controleren of deze recombinase ongewenste bijwerkingen heeft in een organisme. En vervolgens is een zeer uitdagend aspect het ontwikkelen van een goed afgiftesysteem voor deze recombinase, wat niet triviaal is. Het ontwikkelen hiervan is op zichzelf al een volledig onderzoeksgebied.

Het was in wezen een gentherapeutische benadering die we zouden moeten hanteren. Nou, ik denk dat we een verschuiving zien waarbij de geneeskunde steeds meer moleculair wordt. En hiervoor hebben we natuurlijk instrumenten nodig om op zo'n schaal te kunnen werken.

En hier zie ik waar de toekomst van het evolutieproces ligt. We moeten op maat gemaakte enzymen ontwikkelen die werken voor een proces dat we echt zouden willen kunnen gebruiken; in het geval van de recombinase zou men dit kunnen zien als een analogie met een instrument voor een chirurg die tijdens een operatie iets moet wegsnijden. We hebben nu dus instrumenten nodig waarmee een moleculaire chirurg in feite specifiek een bepaald stuk DNA uit het genoom kan excideren.

En hiervoor heeft hij de juiste instrumenten nodig om dit te kunnen doen. Moleculaire evolutie kan in feite aan deze functie voldoen. Er bestaan in de natuur veel enzymen die zeer gewenste eigenschappen hebben om dit mogelijk te maken.

We moeten ze simpelweg aanpassen aan onze behoeften om ze bruikbaar te maken. Ik denk dat moleculaire evolutie hier een zeer belangrijke rol kan spelen. Waar de beperkingen liggen, is op dit moment moeilijk te zeggen, omdat dit vakgebied zich nog echt in de beginfase bevindt.

De tijd zal uitwijzen waar de beperkingen liggen. Ik ben er zeker van dat er enkele zullen zijn, maar op dit moment denk ik dat er meer kansen zijn dan werkelijke beperkingen.