Interview: HIV-1 proviraal DNA Excisie Met behulp van een Evolved recombinase

Ik ben JohE Hvar en ik sta aan het hoofd van de Afdeling Celbiologie en Biologie van het HE Pet Instituut in Hamburg, Duitsland. Het HE PET Instituut is een fundamenteel onderzoeksinstituut dat zich uitsluitend richt op menselijke pe, pathogene virussen en aanverwante vraagstukken. Onze afdeling is primair geïnteresseerd in het onderzoeken van de regulatie van de HIV-genexpressie en de interactie, in het bijzonder de intracellulaire interactie, van HIV met componenten van de gastheercel.

Op basis van deze gegevens proberen we daarnaast nieuwe experimentele therapieën voor de HIV-ziekte te ontwikkelen. Het probleem met HIV is dat HIV een retrovirus of lentivirus is en, zoals elk retrovirus, bij infectie van de gastheercel het virale genoom in het genoom van de gastheercel integreert. Tot op heden is het niet mogelijk om het geïntegreerde provirus vervolgens weer te verwijderen.

Dat betekent dat we, in therapeutische zin, spreken over een chronische ziekte met een levenslange therapie en in essentie over alle problemen die verbonden zijn aan levenslange therapieën, zoals bijwerkingen van de medicatie, het ontstaan van resistentie enzovoort. In het fundamenteel onderzoek zijn we al vele jaren op de hoogte van zogenaamde recombinasen, die van nature voorkomen in recombinaties, bijvoorbeeld in gist of in bacteriën. Deze recombinasen herkennen specifieke DNA-sequenties en husselen genen, herstructureren het genoom enzovoort.

En in het bijzonder wordt een recombinase genaamd Cre-recombinase gebruikt in fundamenteel onderzoek en in situ in fundamenteel onderzoek. Cre herkent in wezen zijn specifieke sequentie. Als er een sequentie bevindt tussen twee herkenningsplaatsen, is Cre in staat om de tussenliggende sequentie uit te snijden.

Het idee bestaat al 10 tot 15 jaar om het virus vanuit medisch oogpunt uit te roeien en enerzijds recombinasen, zoals Cre, te gebruiken om het proviraal DNA uit te knippen. Dit zou in theorie mogelijk moeten zijn omdat HIV bij infectie zijn RNA-genoom omzet in DNA via reverse transcriptie. Door dit proces van reverse transcriptie worden sequenties gegenereerd die long terminal repeats worden genoemd; deze markeren in essentie het 5'-uiteinde (het begin) en het 3'-uiteinde (het einde) van het geïntegreerde proviraal DNA. In theorie zou het dus mogelijk zijn om een recombinase te ontwikkelen die specifiek een sequentie in de LTR herkent, waardoor Cre in feite het 5'-uiteinde en het 3'-uiteinde van het geïntegreerde proviraal DNA zou aanvallen, het DNA zou excideren en het virus zo uit de geïnfecteerde cel zou verwijderen. Het probleem met HIV is echter dat er verschillende isolaten zijn, mogelijk zelfs bij één persoon of één patiënt, hoewel we tot nu toe weten dat de sequenties aan het begin en aan het einde van het virale genoom behouden blijven.

Met andere woorden zijn de LTR's meer geconserveerd dan bijvoorbeeld de HIV-genen. Daarom denk ik dat er een goede kans is dat we kunnen volstaan met slechts enkele recombinanten die in feite de enorme variëteit van alle HIV-isolaten herkennen. En als dat niet het geval is, moeten we er in feite een nieuwe genereren via moleculaire evolutie, wat in de toekomst semi-geautomatiseerd kan worden.

En dat zal het ook zijn, het proces zal veel sneller gaan dan wanneer dit in het laboratorium wordt gedaan. Onze collega, dr. Frank van het Max Splunk Institute, kwam in beeld. In feite is hij een expert op het gebied van recombinase en aanverwante zaken.

In essentie maakt hij gebruik van wat we een moleculaire evolutiemethode noemen. Deze methode is gebaseerd op PCR-technologie (polymerasekettingreactie). Hij neemt het gen van de natuurlijk voorkomende recombinase Dre combs en stelt één of meerdere PCR-reacties op onder condities die op willekeurige wijze mutaties introduceren.

De truc is nu om de nieuwe versies van de recombinase te selecteren die een nieuwe capaciteit of activiteit hebben verworven, namelijk het herkennen van HIV-specifieke sequenties. Hij doet dit in herhaalde cycli. Hij heeft ongeveer 120 of meer dan 120 cycli nodig gehad om deze moleculaire evolutiemethode uit te voeren.

Toen hij uiteindelijk kwam met dit specifieke, nu genoemde three for LTR specifieke recombinant met deze nieuwe recombinant die nu specifiek HIV-sequenties herkent. De initiële studie hier was, de, de, de experimenten met de recombinanten werden hier uitgevoerd bij het HE PET Instituut in Hamburg. En wat we deden is dat we deze recombinant specifiek hebben afgeleverd met vectoren, genvectoren, in een menselijke celcultuur die was geïnfecteerd met een min of meer klinisch isolaat van HIV-1.

En na verloop van tijd, gedurende zes tot acht weken, waren we in staat geweest om dat aan te tonen. Nu is het recombinant kwantitatief interessant; zij integreerden het HIV-profiel DA, waarbij in feite de hele cultuur is genezen door HIV te verwijderen. Er zijn zeker talrijke problemen met deze technologie.

Ten eerste moeten we er zeker van zijn dat de expressie van recombinase geen toxische bijwerkingen veroorzaakt. Dit verwachten we niet, aangezien er voor natuurlijk voorkomende recombinaties, zoals gre, zogenaamde transgene dieren bestaan. Zij vertonen deze GRE-recombinatie en hoewel er enkele problemen zijn, zijn deze niet al te significant.

Dat kan ik op dit moment stellen. Er is dus hoop dat er geen toxische bijwerkingen zijn, maar dat weet je pas zeker wanneer je de experimenten uitvoert. Daarnaast zijn er problemen waarbij we mogelijk niet elk klinisch isolaat ermee zullen herkennen, waardoor we het dominante HIV-isolaat bij een patiënt niet kunnen elimineren.

Maar na verloop van tijd zullen we selecteren op basis van kleine, minimale isolaten. Dit is, zoals we nog niet weten, iets wat we via deze experimenten moeten uitzoeken. Daarnaast is er een groot probleem met de genoverdracht, met de vectortechnologie.

We moeten zogenaamde lentivirale vectoren of retrovirale vectoren gebruiken om het gen of het recombinasegen af te leveren. Zijn daar bijwerkingen aan verbonden? Zijn er zulke bijwerkingen, veroorzaken deze vectoren toxische effecten?

Dit zijn alle vragen die we hebben. Daarnaast hopen we de activiteit van de kammen te verbeteren. De recombinatie verloopt momenteel sneller dan we in de afgelopen weken aan de activiteit hebben kunnen zien.

Dit zijn dus allemaal openstaande vragen die we de komende jaren moeten uitwerken. En dit is nu zeker het probleem, omdat recombinases niet oraal beschikbaar zijn. Er zal dus geen pil zijn, geen recombinase-pil waarmee je simpelweg van het virus afkomt.

Kijkend naar toekomstige therapieën, moeten we denken aan gentherapeutische benaderingen. Men zou bijvoorbeeld kunnen bedenken om zogenaamde hematopoëtische stamcellen of CD 34-positieve cellen te isoleren uit het bloed van HIV-geïnfecteerde patiënten. Vervolgens kan in het laboratorium het gen voor de combs in deze cellen van de patiënt worden geïntroduceerd.

Ten slotte voeren we de genetisch gemodificeerde cellen van de patiënt opnieuw in, we infuseren deze cellen terug in de rug van dezelfde patiënt. Wat er vervolgens zou moeten gebeuren, is dat het immuunsysteem of het hematopoëtische systeem van de patiënt na verloop van tijd ten minste gedeeltelijk wordt hersteld met cellen die, bij een HIV-infectie, het virus kunnen elimineren omdat ze nu een recombinase tot expressie brengen. Het effect zou zijn dat de virale load bij de patiënt zal dalen, wat zeker de kwaliteit van leven zal verbeteren.

En we kunnen er ook op hopen dat het immuunsysteem bij deze patiënten ten minste gedeeltelijk wordt hersteld. De immuuncellen die volledig functioneel zijn, zullen nu hopelijk in staat zijn om de resterende latent geïnfecteerde cellen bij deze patiënten aan te vallen. Of we HIV werkelijk volledig en totaal uit een patiënt kunnen uitroeien, kunnen we op dit moment nog niet zeggen.