In vitro differentiatie van muis embryonale stamcellen (MES) cellen met behulp van de Opknoping neerzetten

Stamcellen hebben het opmerkelijke potentieel om zich te ontwikkelen tot vele verschillende celtypen in het lichaam. Ze dienen als een soort herstelsysteem voor het lichaam. Ze kunnen zich theoretisch onbeperkt delen om andere cellen aan te vullen.

Wanneer een stamcel zich deelt, heeft elke nieuwe cel het potentieel om ofwel een stamcel te blijven of zich te ontwikkelen tot een ander type cel met een meer gespecialiseerde functie. Dit veelbelovende gebied van de wetenschap leidt wetenschappers ertoe om de mogelijkheid van cel-gebaseerde therapieën te onderzoeken om ziekten in vitro te behandelen. Differentiatie van embryonale stamcellen vindt plaats wanneer de cellen worden toegestaan om zich te bundelen in suspensiecultuur.

In afwezigheid van muis embryonale, fibroblast feeders en leukemie remmende factor, worden deze celaggregaten embryo lichamen genoemd. De hangende druppel methode is een effectieve procedure voor de differentiatie van stamcellen in embryo lichamen in vitro. Hallo, ik ben Sha Juan van de afdeling Cardiologische Geneeskunde aan de Stanford Universiteit.

Vandaag zullen we u een procedure laten zien voor individuele differentiatie van embryonale stamcellen tot embryo lichamen met behulp van de handdruppelmethode. We gebruiken deze methode meestal om embryonale stamcellen te differentiëren in cardiomyocyten. Deze procedure, inclusief de volgende stappen, bereidt een enkele cel suspensie van embryonale stamcellen, genereert handdruppelculturen, brengt handdruppelculturen over naar ultra lage hechtingsplaten, en plaatst de embryo lichamen op met jut gecoate platen.

Oké, laten we beginnen. De eerste stap van de procedure is het bereiden van een enkele cel suspensie van embryonale stamcellen. Omdat we onze ongedifferentieerde embryonale stamcellen kweken door ze op muis embryonale fibroblasten te laten groeien, moeten we de cellen losmaken en scheiden van de fibroblasten.

Om dit te doen, tryps aniseren we de cellen met behulp van standaardprocedures. Zodra de try en behandeling voltooid is, voegen we muis embryonaal stamcelmedium toe om de trypsin te neutraliseren. Breng vervolgens de celsuspensie over in een conische buis van 15 ml.

Breek vervolgens de celkolonies op door omhoog en omlaag te pipetteren tegen de bodem van de buis totdat je een fijne suspensie van cellen verkrijgt zonder zichtbare klonters. Draai nu de cellen gedurende vijf minuten op duizend RPM. Na het centrifugeren van de cellen, zuigt u het supernatant af en suspendeert u de cellen opnieuw met 10 ml muis ES-celmedium.

Breng de celsuspensie over in een T 75-kolf voorgecodeerd met 0,1%gelatine en incubeer bij 37 graden met 5%CO2 gedurende één uur. Na één uur zijn de fibroblasten aan de plaat gehecht, maar de stamcellen blijven in het medium. Pipet het medium op om de stamcellen te verzamelen.

Centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten op duizend RPM en zuig het medium af. Voeg vervolgens nog eens 10 ml differentiatiemedium toe en suspendeer de cellen door repetitief pipetteren tot er een fijne suspensie van cellen lijkt te zijn. Tel de cellen met behulp van een hemo cytometer.

Nu zijn we klaar om de celsuspensie te kweken met behulp van de hangende druppelmethode. Om de hangende druppelcultuur te beginnen, gebruikt u differentiatiemedium om de stamcelsuspensie te verdunnen tot een concentratie van 500 cellen per 20 microliters. Draai vervolgens een 150 millimeter weefselcultuurplaatdeksel om.

Pipet vervolgens 20 microliters van de celsuspensie op het binnenoppervlak van het plaatdeksel. Gebruik een multikanaals pipettor om 10 ml PBS op de plaat toe te voegen. Draai het plaatdeksel snel om en plaats het voorzichtig op de plaat om de hangende druppels te vormen.

Zodra het plaatdeksel op zijn plaats is, brengt u de plaat voorzichtig over naar de incubatorcultuur. Laat de cellen twee dagen ongestoord. Zodra de incubatie voltooid is, zullen we doorgaan met het overbrengen van de hangende druppelcultuur naar ultra lage hechtingsplaten.

Na twee dagen draait u het plaatdeksel voorzichtig om en aspireert u vervolgens 180 microliters vers differentiatiemedium, en plaatst u verschillende druppels in een 96-wel ultra lage hechtingsplaat. Neem vervolgens de druppels op met een pipet en breng ze één voor één over naar de 96-welplaat. Plaats de platen drie dagen ongestoord in de incubator.

De embryo lichamen zullen verder groeien tot een balvorm. Wanneer de incubatie voltooid is, zijn we klaar om de embryo lichamen te plateren. Om de embryo lichamen te helpen verder te differentiëren.

We brengen ze over naar een 48-wel gelatine gecoate plaat. Om dit te doen, coaten we eerst elke wel van de plaat met 300 microliters 0,1%gelatine. Na het toevoegen van de gelatine, incubeer de plaat een nacht bij 37 graden Celsius.

De volgende dag aspireert u de gelatine van de 48-wel plaat. Voeg vervolgens 300 microliters differentiatiemedium toe aan elk. Wel, nu één voor één de embryo lichamen overbrengen van de 96-wel naar de 48-wel gelatine gecoate platen.

We verversen het medium de volgende dag en vervolgens om de andere dag om de cellen te onderhouden. We gebruiken deze methode om betere protocollen te zoeken voor het differentiëren van embryonale stamcellen. In de cardiomyocyten hebben we u net laten zien hoe u in vitro differentiatie van muis embryonale stamcellen uitvoert met behulp van hangende druppelculturen.

Deze methode is effectief omdat de ronde bodem van de hangende druppel de aggregatie van embryonale stamcellen mogelijk maakt, waardoor een goede omgeving voor de vorming van Embry-lichamen wordt geboden. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het aantal embryonale stamcellen dat in een hangende druppel wordt geaggregeerd, kan worden gecontroleerd door het aantal cellen in de initiële celsuspensie te variëren. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken. Veel succes met uw experiment.