Name: In vitro differentiatie van muis embryonale stamcellen (MES) cellen met behulp van de Opknoping neerzetten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-23T22:33:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Leer de in vitro differentiatie van muizenembryonale stamcellen met de hanging drop-methode. Deze techniek vormt embryoid bodies en ondersteunt onderzoek naar celtherapieën en regeneratieve geneeskunde.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li> Gelatineren T75 fles met behulp van een 0,1% gelatine-oplossing en incubeer plaat in een 37 ° C, 5% CO 2 weefselkweek incubator &#39;s nachts een dag voor. </li><li> Haal de MES-cellen van broeden, zuig het medium, spoel de ES-cel-cultuur met PBS, toe te voegen 0,05% trypsine oplossing voor laag de bodem van de schaal (2 ml/100mm plaat). </li><li> Incubeer bij 37 ° C gedurende ongeveer een minuut, totdat de cellen afstoten van de plaat. </li><li> Voorzichtig vermaal (pipet op en neer) de getrypsiniseerd cellen vier tot zes keer naar de ES-cellen met een aangesloten Pasteur pipet verspreiden,. Breng de verspreide ES-cellen in een 15-ml conische centrifugebuis met voorverwarmde (37 ° C) MES medium. </li><li> Verzamel cellen door centrifugeren. Zuig het supernatant, Voeg 10 ml van MES medium en pipet op en neer om een ​​enkele celsuspensie te vormen. </li><li> Breng de celsuspensie in een T75 fles pre-gecoat met 0,1% gelatine en incubeer bij 37 ° C met 5% CO 2 voor een uur * Na een uur, zijn de fibroblasten aan de plaat, maar de stamcellen blijven in het medium. Pipetteer het medium om de stamcellen te verzamelen. </li><li> Spin de cellen bij 1000 rpm gedurende 5 minuten en zuig uit de MES medium. Voeg vervolgens nog eens 10 ml van MES differentiatie medium en resuspendeer de cellen door repetitieve pipetteren totdat blijkt dat er een fijne suspensie van cellen. </li><li> Tellen cellen met een hemocytometer gebruik differentiatie medium om de stamcellen schorsing verdunnen tot een concentratie van 400 tot 500 cellen per 20ul (20ul/drop) in een steriele bekken. </li><li> Til het deksel voorzichtig omkeren en plaats deze op de top van het schaaltje met 10 ml PBS. Met behulp van een multichannel pipet, maken rijen van 20ul druppels op de up-keerde binnenkant van het deksel van de weefselkweek schotel. </li><li> Plaats voorzichtig de schaal in de incubator voor 2 dagen. Na twee dagen, voorzichtig draai het bord te dekken, aspiratie 180 ul vers medium differentiatie en doe enkele druppels in de put van een 96-well Ultra-wandplaat. Dan pick-up van de druppel met de pipet en overdracht druppels, een voor een, aan de 96-well plaat. Leg de platen in de incubator ongestoord gedurende 3 dagen. </li><li> Coat elk putje van een 48-well plaat met weefselkweek 300ul van 0,1% gelatine. Na het toevoegen van de gelatine, &#39;s nachts incuberen van de plaat bij 37 ° C een dag van tevoren vóór de overdracht van de Ebs. </li><li> De volgende dag, zuigen de gelatine uit de 48-well plaat. Voeg vervolgens 300 ul van differentiatie medium aan elk putje. Breng de EBS van de platen met 96 putjes om de 48 goed gelatine-gecoate platen een voor een. Verander het medium de volgende dag en wijzigt u vervolgens het medium om de andere dag naar de cellen te behouden. </li><li> Spontane cardiaomyocyte contracties moet blijken binnen 7 dagen. </li></ol>

<ol><li>Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+mouse+embryonic+stem+cells+are+able+to+differentiate+into+cardiomyocytes+expressing+chronotropic+responses+to+adrenergic+and+cholinergic+agents+and+Ca2%2B+channel+blockers%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers.</a> Differentiation. 48, 173-182 (1991).</li>
<li>Metzger, J. M., Lin, W. I., Samuelson, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+in+cardiac+contractile+sensitivity+to+calcium+during+the+in+vitro+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transition in cardiac contractile sensitivity to calcium during the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> J Cell Biol. 126, (1994).</li>
</ol>

De nadelen van opknoping drop methode zijn als volgt: de vloeistof volume van een druppel is beperkt tot minder dan 50ul te wijten aan het behoud van opknoping druppels op het deksel door oppervlaktespanning, en het is onmogelijk om het medium te veranderen voor opknoping druppels. Observatie van het vormen van EBS in druppels direct met microscopie is ook zeer moeilijk tijdens de teelt. Verder, de opknoping druppel methode bestaat uit twee stappen, kan daarom een ​​reeks stap van de opknoping drop methode lastig.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Reagens</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal runderserum (FBS)</td><td>Reagens</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Reagens</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Niet-essentiële aminozuren</td><td>Reagens</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline / Streptomycine</td><td>Reagens</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvaat</td><td>Reagens</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11360-70</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-mercapto&amp;#8211;ethanol</td><td>Reagens</td><td>Chemicon International</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>leukemia inhibitory factor (LIF)</td><td>Reagens</td><td>Chemicon International</td><td>LIF2005</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate met ultralage aanhechting</td><td>Instrument</td><td>Corning</td><td>3474</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro differentiatie van muis embryonale stamcellen (mes) cellen met behulp van de opknoping neerzetten

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method

Stamcellen hebben de opmerkelijke potentie uit te groeien tot een groot aantal verschillende celtypen. Wanneer een stamcel deelt, elke nieuwe cel de mogelijkheid om ofwel te blijven een stamcel of worden een ander type cel met een meer gespecialiseerde functie heeft, is deze veelbelovende van de wetenschap vooraanstaande wetenschappers de mogelijkheid van cel-gebaseerde therapieën voor behandeling van de ziekte te onderzoeken. Wanneer cultuur in suspensie zonder antidifferentiation factoren, embryonale stamcellen spontaan differentiëren en vormen drie-dimensionale meercellige aggregaten. Deze cel aggregaten worden genoemd embryoid organen (EB). Opknoping druppel cultuur is een veel gebruikt EB formatie inductie methode. De afgeronde onderkant van opknoping druppel maakt de samenvoeging van de ES-cellen die kunnen zorgen voor MES-cellen een goede omgeving voor het vormen van EBS. Het aantal van de ES-cellen aggregatied in een opknoping druppel kan worden geregeld door het variëren van het aantal cellen in de eerste celsuspensie te worden opgehangen als een druppel uit het deksel van de petrischaal. Met behulp van deze methode kunnen we reproduceerbare vorm homogene EBS vanuit een vooraf bepaald aantal ES-cellen.

Deze video laat zien hoe in vitro differentiatie van muis embryonale stamcellen te voeren om embryoid lichamen met behulp van de opknoping drop methode.

In vitro differentiatie van muis embryonale stamcellen (MES) cellen met behulp van de Opknoping neerzetten

Stamcellen hebben het opmerkelijke vermogen om zich te ontwikkelen tot veel verschillende celtypen. Wanneer een stamcel zich deelt, heeft elke nieuwe cel het potentieel om ofwel ...

Stamcellen hebben het opmerkelijke potentieel om zich te ontwikkelen tot vele verschillende celtypen in het lichaam. Ze dienen als een soort reparatiesysteem voor het lichaam en kunnen theoretisch onbeperkt delen om andere cellen aan te vullen.Wanneer een stamcel zich deelt, heeft elke nieuwe cel het potentieel om ofwel een stamcel te blijven of om uit te groeien tot een ander type cel met een meer gespecialiseerde functie. Dit veelbelovende vakgebied leidt ertoe dat wetenschappers de mogelijkheid van celgebaseerde therapieën onderzoeken om ziekten in vitro te behandelen. Differentiatie van embryonale stamcellen vindt plaats wanneer de cellen in staat worden gesteld om te aggregeren in suspensiecultuur.In de afwezigheid van embryonale muis-fibroblast-feeder-cellen en leukemie-remmende factor worden deze celaggregaten embryoblasten genoemd. De hanging drop-methode is een effectieve procedure voor de in vitro differentiatie van stamcellen tot embryoblasten. Hallo, ik ben Sha Juan van de afdeling Cardiovasculaire Geneeskunde aan de Stanford University.Vandaag laten we u een procedure zien voor de individuele differentiatie van embryonale stamcellen tot embryoïde lichamen met behulp van de hand-drop methode. Wij gebruiken deze methode doorgaans om embryonale stamcellen te differentiëren tot cardiomyocyten. Deze procedure omvat de volgende stappen: het bereiden van een enkelcellige suspensie van embryonale stamcellen, het genereren van hand-drop culturen, het overbrengen van hand-drop culturen naar platen met ultra-lage hechting en het uitplaten van de embryoïde lichamen op met gelatine gecoate platen.Oké, laten we beginnen. De eerste stap van de procedure is het voorbereiden van een suspensie van enkelvoudige embryonale stamcellen. Omdat we onze ongedifferentieerde embryonale stamcellen kweken op embryonale fibroblasten van muizen, moeten we de cellen losmaken en scheiden van de fibroblasten.Hiervoor trypsiniseren we de cellen volgens standaardprocedures. Zodra de trypsinbehandeling is voltooid, voegen we medium voor muizen embryonale stamcellen toe om de trypsine te neutraliseren. Verplaats vervolgens de celsuspensie naar een conische buis van 15 ml.Breek vervolgens de celkolonies op door herhaaldelijk met de pipet op en neer te bewegen tegen de bodem van de buis, totdat een fijne celsuspensie zonder zichtbare klonters is verkregen. Centrifugeer de cellen daarna 5 minuten lang bij 1000 RPMs. Aspireer na het centrifugeren het supernatant en resuspendeer de cellen in 10 ml mouse ES cell medium.Breng de celsuspensie over naar een T 75-fles die vooraf is gecoat met 0,1% gelatine en incubeer gedurende één uur bij 37 °C met 5% CO2. Na één uur zijn de fibroblasten aan de plaat gehecht, maar blijven de stamcellen in het medium. Pipetteer het medium op om de stamcellen te verzamelen.Centrifugeer de cellen vijf minuten lang bij 1000 RPM en aspireer het medium weg. Voeg vervolgens nog eens 10 ml differentiatiemedium toe en resuspendeer de cellen door herhaaldelijk te pipetteren tot er een fijne cellsuspensie ontstaat. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer.We zijn nu klaar om de cel-suspensie te kweken met de hanging drop-methode. Om de hanging drop-kweek te starten, wordt differentiatiemedium gebruikt om de stamcel-suspensie te verdunnen tot een concentratie van 500 cellen per 20 µL. Keer vervolgens het deksel van een 150 mm weefselkweekplaat om.Pipetteer vervolgens 20 µL van de cel-suspensie op het binnenoppervlak van de plaatdeksel. Voeg met een multichannel-pipet 10 mL PBS toe aan de plaat. Keer het plaatdeksel snel om en plaats het voorzichtig op de plaat om de hangende druppels te vormen.Zodra de plaatkap is geplaatst, wordt de plaat voorzichtig overgebracht naar de incubator. De cellen blijven gedurende twee dagen ongestoord. Wanneer de incubatie is voltooid, gaan we over tot het overbrengen van de hanging drop-cultuur naar ultra-low attachment platen.Draai na twee dagen voorzichtig de plaatdekking om, aspireer vervolgens 180 µL vers differentiatiemedium en breng enkele druppels over naar een 96-well ultra-low attachment plaat. Neem de druppels vervolgens op met een pipet en breng ze één voor één over naar de 96-well plaat. Plaats de platen gedurende drie dagen ongestoord in de incubator.De embryo-lichamen zullen verder groeien tot een bolvorm. Wanneer de incubatie is voltooid, zijn we klaar om de embryo-lichamen uit te platen om de embryo-lichamen te helpen verder te differentiëren.We brengen ze over naar een 48-well plaat gecoat met gelatine. Hiervoor coaten we eerst elke well van de plaat met 300 µL 0,1% gelatine. Na het toevoegen van de gelatine wordt de plaat een nacht geïncubeerd bij 37 °C.Aspirer de volgende dag de gelatine uit de 48-wellplaat. Voeg vervolgens 300 µL differentiatiemedium toe aan elke well. Verplaats nu de embryo-lichamen één voor één van de 96-wellplaat naar de met gelatine gecoate 48-wellplaten.Normaal gesproken vervangen we het medium de volgende dag en daarna om de dag om de cellen in stand te houden. We gebruiken deze methode om te zoeken naar betere protocollen voor de differentiatie van embryonale stamcellen. Wat betreft de cardiomyocyten, we hebben zojuist gedemonstreerd hoe u de in vitro differentiatie van embryonale stamcellen van muizen uitvoert met behulp van hanging drop-culturen.Deze methode is effectief omdat de ronde bodem van de hangende druppel de aggregatie van embryonale stamcellen mogelijk maakt, waardoor een goede omgeving ontstaat voor de vorming van embryoid bodies. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het aantal geaggregeerde embryonale stamcellen in een hangende druppel kan worden gecontroleerd door het aantal cellen in de initiële celsuspensie te variëren. Dat is alles.Bedankt voor het kijken. Veel succes met uw experiment.

in-vitro-differentiation-mouse-embryonic-stem-mes-cells-using-hanging

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol beschrijft de afleiding van transplanteerbare hematopoietische stamcellen uit muis embryonale stamcellen (ESC) en de daaropvolgende injectie in dodelijk bestraalde ontvangende muizen. In het kort, worden ESC gedifferentieerd embryoid lichamen, die vervolgens besmet zijn met retrovirale HoxB4 en co-gekweekt met OP9 stromale cellen en hematopoietische cytokines.

Afleiding van hematopoietische stamcellen van muriene embryonale stamcellen

We tonen een eenvoudige en snelle methode om vooraf gedefinieerde aantallen cellen te laden in microfabricated putten en te onderhouden voor embryoid lichaam ontwikkeling.

Shrinky-Dink Opknoping Drops: een eenvoudige manier om vorm en cultuur Embryoid Bodies

We beschrijven het gebruik van een muis ES-cel-gebaseerde test kritische tijdvensters voor de Wnt / β-catenine en BMP signaal activering tijdens cardiogene inductie te identificeren. De methode biedt een gestandaardiseerd platform dat betrouwbaar kwantificeert cardiogene efficiëntie, en het is van toepassing op de studie van andere cellijnen.

Gewijzigd muis embryonale stamcellen gebaseerde test voor het kwantificeren van Cardiogene Inductie Efficiency

We ontwikkelden een nieuw protocol om de efficiëntie van de in vitro differentiatie van muis embryonale stamcellen in motorneuronen te verbeteren. De gedifferentieerde ES-cellen verworven motorische neuronen heeft, zoals blijkt uit de expressie van neuronale en motor neuron markers met behulp van immunohistochemische technieken.

Efficiënte Differentiatie van muis embryonale stamcellen in de motorische neuronen

The video demonstrates the differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) to embryoid bodies (EBs) by the hanging drop method. Upon suspending the mESCs in hanging drops and incubating, the cells aggregate to form EBs, which are further differentiated into neuronal progenitor cells (NPCs) using a differentiation medium supplemented with retinoic acid (RA).

Generating Neural Progenitors from Mouse Embryonic Stem Cells by the Hanging Drop Method

This video demonstrates a method for the in vitro generation of neural progenitor cells (NPCs) from mouse embryonic stem cells (mESCs). The mESCs are cultured in suspension to form embryoid bodies (EBs), which are then guided to differentiate into NPCs via retinoic acid treatment in an adherent culture.

A Technique for Generating Neural Progenitor Cells from Mouse Embryonic Stem Cells

Dit protocol beschrijft in detail de methode voor het genereren van neurale progenitoren uit embryonale stamcellen met behulp van een serumvrije monolaagmethode. Deze progenitoren kunnen worden gebruikt om rijpe neurale celtypen te verkrijgen of om het proces van neurale specificatie te bestuderen en is geschikt voor schaalvergroting in multiwell-formaat voor compound screening.

Neurale differentiatie van muis embryonale stamcellen in serum-vrije monolaagkweek

Dit protocol wordt een methode voor het genereren van corticale interneuron progenitoren en post mitotische interneuron precursoren van muis embryonale stamcellen met een gewijzigde embryoid lichaam-aan-enkelgelaagde methode beschreven. Deze progenitoren/precursoren kunnen worden gebruikt in vitro fluorescently gesorteerd en getransplanteerd in neonatale neocortex voor het bestuderen van de bepaling van het lot of gebruikt in therapeutische toepassingen.

Differentiatie van muis embryonale stamcellen in de corticale Interneuron precursoren

Hier hebben we een goedkope en eenvoudig te bedienen methode opgezet die een snelle en efficiënte differentiatie van embryonale stamcellen naar neuronen stuurt. Deze methode is geschikt voor popularisering onder laboratoria en kan een nuttig hulpmiddel zijn voor neurologisch onderzoek.

Neuronale differentiatie van embryonale stamcellen van muizen in vitro

We beschrijven de procedure voor de in vitro differentiatie van embryonale stamcellen van muizen in neuronale cellen met behulp van de hanging drop-methode. Verder voeren we een uitgebreide fenotypische analyse uit via RT-qPCR, immunofluorescentie, RNA-seq en flowcytometrie.

Differentiatie en karakterisering van neurale voorlopercellen en neuronen uit embryonale stamcellen van muizen

Leer de in vitro differentiatie van muizenembryonale stamcellen met de hanging drop-methode. Deze techniek vormt embryoid bodies en ondersteunt onderzoek naar celtherapieën en regeneratieve geneeskunde.

In vitro differentiatie van muis embryonale stamcellen (MES) cellen met behulp van de Opknoping neerzetten

Meer video's verkennen