Name: In vitro Labeling van menselijke embryonale stamcellen voor Magnetic Resonance Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-03T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: Leer hoe u menselijke embryonale stamcellen labelt met mangaanchloride voor MRI-beeldvorming. Deze methode maakt nauwkeurige tracking van levensvatbare cellen mogelijk via voltage-gated calciumkanalen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Mangaan Labeling van menselijke embryonale stamcellen <ol><li> Trypsinize de menselijke embryonale stengels die zijn gekweekt in feeder-vrije omstandigheden gedurende 5 minuten. Neutraliseer de trypsine door het toevoegen van cultuur media. </li><li> Spin down de cellen door centrifugeren bij 800 rpm gedurende 5 minuten bij 20 ° Celsius. Na opnieuw de opschorting van de celpellet, tel het aantal cellen door trypan blauwe vlekken. Op basis van de verkregen cellen, delen de cellen in vier porties van 3 miljoen cellen in conische buizen. Pellet de cellen weer door centrifugeren. </li><li> Net voor het starten van de mangaan etikettering, de ontbinding van verse mangaanchloride met 0,9% natriumchloride-oplossing voor een 0.1mm mangaanchloride oplossing te maken. </li><li> Om de calcium-kanaal-activiteit te observeren, werden vier monsters voorbereid. Het eerste monster is onze bepalen welke cellen geïncubeerd in 0,9% natriumchloride alleen bevat. Het tweede monster bevat cellen geïncubeerd in 0,1 mM MnCl 2. Voorbeeld 3 en 4 bevatten cellen geïncubeerd in 0,1 mM MnCl 2 met ofwel 5 pM van het Ca 2 +-kanaals agonist, (s )-(-)- Bay K8644, of 250 pM van het Ca 2 +-kanaal antagonist, verapamil. Incubeer de vier monsters bij 37 ° Celsius met 5% CO 2 gedurende 30 minuten. </li><li> Na 30 minuten, spin down de cellen op 800 rpm gedurende 5 minuten bij 20 ° Celsius. Dan het supernatans aspireren en twee keer was de gelabelde cellen met PBS. Na het wassen, opnieuw te schorsen elk pellet met 200 pi PBS en de overdracht naar PCR-buizen. Deze pellets zijn meestal wit. </li></ol> Ijzeren Labeling van menselijke embryonale stamcellen <ol><li> Mix klinisch-grade protaminesulfaat met gedestilleerd water tot een 1 mg / ml stockoplossing te krijgen. </li><li> In een buis met menselijke embryonale stamcellen cultuur media, toe te voegen ferumoxides op 100 ug / ml gevolgd door toevoeging van 12 microgram / ml protamine sulfaat. Krachtig Meng de oplossing voor vijf minuten. </li><li> Voeg gemengde oplossing om de gelijke hoeveelheid van de celkweek media tot een uiteindelijke concentratie van 50 ug / ml ferumoxides en 6 ug / ml van de protamine sulfaat te labelen cellen te bereiken. Incubeer de cellen in deze oplossing voor 12 uur. </li><li> Twee keer wassen van de cellen met PBS, de laatste was met 10U/ml heparine aan de extracellulaire ferumoxides-protaminesulfaat complex te ontbinden. Na het wassen, trypsinize cellen tot een enkele cel suspensie te verkrijgen. </li><li> Tel het aantal cellen en hoeveelheid in het vereiste aantal monsters. Na het wassen, opnieuw te schorsen elk pellet met 200 pi PBS en de overdracht naar PCR-buizen. Deze pellets moet donker oranje bruin van kleur. </li></ol> Het uitvoeren van Cellular Magnetic Resonance Imaging <ol><li> Maak een fantoom om de buizen die de cel pellets te stabiliseren en ook om voorwerpen uit de omringende lucht te vermijden tijdens het scannen. Om dit te doen, mix 0,8% van de agar en 1% van kopersulfaat in gedestilleerd water en breng het aan de kook met de magnetron 5-7 minuten. Cool dit mengsel gedurende tenminste 1 uur voor van het scannen naar een gel te bereiken. </li><li> De buizen met daarin de gelabelde cel pellets worden geplaatst in het fantoom voor het scannen. In vitro cellulaire MRI wordt uitgevoerd bij Signa HDX 3T MRI (GE Medical Systems) met behulp van de klinische knie spoel. </li><li> Scan de mangaan gelabelde cellen voor elk van de drie monsters met behulp van een spin-echo sequentie: TR; Herhaling tijd = 800 msec. TE; Echo tijd = minimum, FOV, gezichtsveld = 12 x 12 cm; matrix = 256x256, NEX 1. </li><li> Scan de ijzeren gemerkte cellen met behulp van een gradiënt-echo sequentie. We gebruiken de volgende parameters voor deze beeldvorming: TR = 100 msec; TE = 10 msec, FA, flip hoek = 30 °; FOV = 12 x 12 cm; matrix = 256 x 256, NEX 1. </li></ol> Het analyseren van de MRI-resultaten <ol><li> Analyseren van beelden van de MRI-scan uit 4 verschillende monsters van mangaan-gemerkte cellen: <ul><li> Sample # 1 is onze controle welke cellen geïncubeerd in 0,9% natriumchloride alleen bevat. </li><li> Voorbeeld # 2 bevat cellen geïncubeerd in 0,1 mM MnCl 2. </li><li> Sample # 3 bevat cellen geïncubeerd in 0,1 mM MnCl 2 met 5 uM van de Ca 2 +-kanaals agonist, (s )-(-)- Bay K8644. </li><li> Sample # 4 bevat cellen geïncubeerd in 0,1 mM MnCl 2 met 250 pM van het Ca 2 +-kanaal antagonist, verapamil. </li></ul></li><li> Zoals voorspeld, de verschillen in signaal intensiteit van mangaan gelabelde cellen zichtbaar zijn. In vergelijking met de cellen puur gelabeld met mangaan, de signaal intensiteit verhoogt duidelijk in de aanwezigheid van de calcium-kanaal agonist en dalingen in de aanwezigheid van calcium kanaal antagonist. Het gebied waar de intensiteit van het signaal is toegenomen voor mangaan gelabelde cellen worden gemeten door gebruik te maken Image J (NIH, Bethesda, MD, USA). Dezelfde software wordt gebruikt voor het analyseren van het gebied van donkere off-resonantie-signaal van ijzer gelabelde cellen. De grootte van de donkere signaal van de ijzer-gelabelde cellen is afhankelijk van het aantal cellen of het aantal van de ijzerdeeltjes opgenomen door cellen. In dit geval, Een miljoen cellen geeft een kleiner gebied van donkere signaal in vergelijking met het signaal van de drie miljoen cellen. </li></ol>

<ol><li>Bruvold, M., Nordhoy, W., Anthonsen, H. W., Brurok, H., Jynge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manganese-calcium+interactions+with+contrast+media+for+cardiac+magnetic+resonance+imaging%3A+a+study+of+manganese+chloride+supplemented+with+calcium+gluconate+in+isolated+Guinea+pig+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Radiol%22%5BJournal%5D)">Manganese-calcium interactions with contrast media for cardiac magnetic resonance imaging: a study of manganese chloride supplemented with calcium gluconate in isolated Guinea pig hearts.</a> Invest Radiol. 40, 117-125 (2005).</li>
<li>Aoki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+labeling+for+magnetic+resonance+imaging+with+the+T1+agent+manganese+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">Cell labeling for magnetic resonance imaging with the T1 agent manganese chloride.</a> NMR Biomed. 19, 50-59 (2006).</li>
<li>Arbab, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+magnetic+cell+labeling+with+protamine+sulfate+complexed+to+ferumoxides+for+cellular+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient magnetic cell labeling with protamine sulfate complexed to ferumoxides for cellular MRI.</a> Blood. 104, 1217-1223 (2004).</li>
<li>Arbab, A. S., Frank, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+MRI+and+its+role+in+stem+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Cellular MRI and its role in stem cell therapy.</a> Regen Med. 3, 199-215 (2008).</li>
</ol>

Deze resultaten geven aan dat mangaan heeft betreden via de voltage-gated calcium kanalen, en mangaan kan worden gebruikt als MRI contrastmiddel, dat ook kunnen laten zien van de levensvatbaarheid van de cellen. Daarom stellen wij voor dat mangaan-geleide MRI kan nuttig zijn om levensvatbaarheid van de cellen te controleren na de transplantatie van menselijke embryonale stamcellen in de hartspier.

<table><tbody><tr><td>Mangaanchloride tetrahydraat</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8054</td><td></td></tr><tr><td>(S)-(-)-Bay K8644 </td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B133</td><td></td></tr><tr><td>(+)-Verapamilhydrochloride, minimum 99,0% titratie </td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride 0,85-0,90% w/v</td><td>Reagens</td><td>VWR international</td><td>VW 3257-1</td><td></td></tr><tr><td>Feridex I.V. </td><td>Reagens</td><td>Berlex Laboratories</td><td>NDC 59338-7035-5</td><td>ferumoxide injectieve oplossing 11,2 mg ijzer/mL</td></tr><tr><td>Protaminesulfaat</td><td>Reagens</td><td>American Pharmaceutical Partners</td><td>NDC 63323-229-05</td><td>50 mg (10 mg/mL)</td></tr><tr><td>Knockout SR (serumvervanger voor ES-cellen)</td><td>Reagens</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10828</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1)</td><td>Reagens</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>2-mercapto&amp;#8211;ethanol 98+%</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M 3148</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine 200 mM 100x</td><td>Reagens</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine 10.000 units/ml</td><td>Reagens</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>MEM niet-essentiële aminozuren 100x oplossing</td><td>Reagens</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Signa HDx 3T MRI</td><td>Instrument</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>klinische kniespoel</td><td>Instrument</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Reagens</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro labeling van menselijke embryonale stamcellen voor magnetic resonance imaging

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Menselijke embryonale stamcellen (hESC) hebben aangetoond over het vermogen om de gewonde myocard te herstellen. Magnetic resonance imaging (MRI) heeft ontpopt als een van de belangrijkste beeldvormende modaliteiten aan het herstel van de geblesseerde myocard te beoordelen. Verder zijn ex-vivo labeling middelen, zoals ijzer-oxide nanodeeltjes, in dienst op te sporen en te lokaliseren de getransplanteerde stamcellen. Echter, deze methode niet volgen van een fundamentele celbiologie eigendom met betrekking tot de levensvatbaarheid van de getransplanteerde cellen. Het is bekend dat mangaan chloride (MnCl 2) van de cellen via de voltage-gated calcium (Ca 2 +) kanalen wanneer de cellen zijn biologisch actief binnenkomt, en accumuleert intracellulair voor het genereren van T een verkorting effect. Daarom stellen wij voor dat mangaan-geleide MRI kan nuttig zijn om levensvatbaarheid van de cellen te controleren na de transplantatie van hESC in het myocard. In deze video laten we zien hoe de hESC label met MnCl 2 en hoe deze cellen is duidelijk te zien door gebruik te maken MRI in vitro. Op hetzelfde moment, biologische activiteit van Ca 2 +-kanalen worden gemoduleerd gebruik te maken van zowel Ca 2 +-kanaals agonist en antagonist co-signaal veranderingen te evalueren.

In deze video laten we zien hoe de menselijke embryonale stamcellen (hESC) met mangaan chloride (MnCl label<sub&gt; 2</sub&gt;) Die cellen via voltage-gated calciumkanalen in te voeren wanneer de cellen zijn biologisch actief. Daarnaast tonen we het gebruik van MnCl<sub&gt; 2</sub&gt; Als cellulaire MRI-contrastmiddel aan de in vitro levensvatbaarheid van hESC te bepalen.

In vitro Labeling van menselijke embryonale stamcellen voor Magnetic Resonance Imaging

Menselijke embryonale stamcellen (hESC) hebben het vermogen aangetoond om het beschadigde myocard te herstellen. Magnetic resonance imaging (MRI) is naar voren gekomen als een van ...

Magnetic Resonance Imaging of MRI is uitgegroeid tot een vooraanstaande beeldvormingsmodaliteit om getransplanteerde stamcellen te lokaliseren en het regeneratiemechanisme beter te begrijpen. Deze MRI-studies maken doorgaans gebruik van ijzeroxide-nanodeeltjes als contrastmiddel voor de beeldvorming. IJzerdeeltjes kunnen echter in het weefsel achterblijven na de dood van de stamcellen en kunnen door macrofagen worden opgenomen, wat resulteert in suboptimale omstandigheden voor het volgen van de levensvatbare getransplanteerde cellen.Deze video zal demonstreren dat mangaanchloride een effectief alternatief is. Het labelen van contrastmiddelen met mangaanchloride biedt verschillende voordelen ten opzichte van labelen met ijzeroxide. Zo geeft mangaan een positief signaal, terwijl ijzerdeeltjes een negatief signaal produceren.Daarnaast is bekend dat mangaanionen cellen binnendringen via spanningsafhankelijke calciumkanalen. De aanwezigheid ervan in MRI duidt daarom op levensvatbare, biologisch actieve cellen. Hallo, ik ben Uni mother van het laboratorium van Philip Yang in de afdeling Cardiovasculaire Geneeskunde aan de Stanford University.Vandaag laat ik u zien hoe u menselijke embryo

in-vitro-labeling-human-embryonic-stem-cells-for-magnetic-resonance

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Voor de evaluatie van nieuwe stamcellen therapieën is het belangrijk om niet-invasief spoor de geïnjecteerde cellen in vivo. Deze video toont u hoe de menselijke mesenchymale en embryonale stamcellen met ijzeroxide gebaseerde contrastmiddelen label in vivo voor latere MR imaging in vivo.

Etikettering hESC &#39;s en hMSCs met ijzeroxide nanodeeltjes voor niet-invasieve in vivo Tracking met MR Imaging

Deze video toont technieken voor de etikettering van menselijke embryonale stamcellen en mesenchymale stamcellen met fluorescerende kleurstoffen. Deze techniek kan worden gebruikt voor een in-vivo volgen van getransplanteerde stamcellen met optische beeldvorming en voor histopathologisch correlaties met fluorescentie microscopie.

Labeling stamcellen met fluorescente kleurstoffen voor niet-invasieve detectie met optische beeldvorming

Met de groeiende belangstelling voor stamceltherapieën, moleculaire imaging technieken zijn ideaal voor de bewaking stamceltransplantatie gedrag na transplantatie. Luciferase reporter genen hebben ingeschakeld non-invasieve, repetitieve evaluatie van de overleving van de cel, de locatie en de proliferatie in vivo. Deze video zal laten zien hoe je hESC proliferatie track in een levende muis.

In vitro en in vivo bioluminescente reportergen-beeldvorming van menselijke embryonale stamcellen

Doel van de presentatie is om aan te tonen een zeer reproduceerbare methode om matrix geassocieerd stamcelimplantaten genereren in kraakbeen defecten, die kunnen worden gevisualiseerd met MRI. Stamcellen zijn gelabeld met de FDA-goedgekeurde Ferumoxides, vermengd met agarose, geïmplanteerd in letsels aan het kraakbeen en afgebeeld met een 7T MR-scanner.

Implantatie van Ferumoxides Gelabelde humane mesenchymale stamcellen in kraakbeenletsels

We beschrijven een techniek voor etikettering en het bijhouden van stamcellen met FDA-goedgekeurde, superparamagnetische ijzeroxide (SPIO), ferumoxytol (Feraheme). Deze cellulaire beeldvorming techniek die magnetische resonantie (MR) beeldvorming maakt gebruik van voor visualisatie, is gemakkelijk toegankelijk voor de lange termijn monitoring en diagnose van succesvolle of mislukte stamcellen engraftments bij patiënten.

Labeling stamcellen met Ferumoxytol, een FDA-goedgekeurd ijzeroxide Nanodeeltje

Dit artikel beschrijft een optimale volgorde van de gebeurtenissen voor de multimodale beeldvorming van cellulaire grafts in knaagdier hersenen met behulp van: (i) in vivo bioluminescentie en magnetische resonantie beeldvorming, en (ii) post mortem histologische analyse. De combinatie van deze beeldvorming op een enkel dier laat cellulaire graft evaluatie met een hoge resolutie en gevoeligheid en specificiteit.

Multimodal Imaging van Stem Cell implantatie in het centrale zenuwstelsel van Muizen

Het volgen van cellen met behulp van MRI heeft opgedaan opmerkelijke aandacht in de afgelopen jaren. Dit protocol beschrijft de etikettering van dendritische cellen met fluor...

Monitoring Dendritische cel-migratie met behulp van<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Magnetic Resonance Imaging

We beschrijven een algemeen protocol voor in vivo cell tracking met MRI in een muismodel met ex vivo gemerkte cellen. Een typische protocol voor mobiele etikettering, beeldaanwinst verwerking en kwantificering is inbegrepen.

In vivo 19 F MRI voor mobiele Tracking

We beschrijven een aantal methoden om kleurstoffen injecteren van DNA vectoren, virussen en cellen om zowel cellot en fenotype van endogene en geënte cellen uit embryonale of pluripotente cellen in muizenembryo's op embryonale dag (E) 9,5 en latere stadia bewaken ontwikkeling.

Cell Labeling en Injectie in ontwikkelingslanden Embryonale Mouse Hearts

Chondrogenese uit stamcellen vereist fine tuning van de kweekomstandigheden. Hier presenteren we een magnetische aanpak voor het condenseren van cellen, een essentiële stap om chondrogenese te initiëren. Bovendien tonen wij aan dat dynamische rijping in een bioreactor zijn mechanische stimulatie van de cellulaire constructen en verbetert kraakbeenachtige extracellulaire matrix productie.

3D Magnetic Stem Cell Samenvoeging en Bioreactor rijping voor het herstel van kraakbeen

Gepresenteerd hier is een protocol voor niet-invasieve mesenchymale stamcel (MSC) levering en tracking in een muismodel van traumatisch hersenletsel. Superparamagnetische ijzeroxide nanodeeltjes worden gebruikt als een magnetische resonantie imaging (MRI) sonde voor MSC labeling en niet-invasieve in vivo tracking na intranasale levering met behulp van real-time MRI.

Het volgen van superparamagnetische ijzer oxide-gelabelde mesenchymale stamcellen met behulp van MRI na intranasale levering in een traumatisch hersenletsel Murine model

Leer hoe u menselijke embryonale stamcellen labelt met mangaanchloride voor MRI-beeldvorming. Deze methode maakt nauwkeurige tracking van levensvatbare cellen mogelijk via voltage-gated calciumkanalen.

In vitro Labeling van menselijke embryonale stamcellen voor Magnetic Resonance Imaging

Meer video's verkennen