Name: Generatie van Stable transgene C. elegans Met behulp van micro-injectie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-15T12:12:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Leer micro-injectie in de gonade van C. elegans om stabiele transgene lijnen te genereren. Deze methode maakt real-time visualisatie van fluorescerende eiwitexpressie in vivo mogelijk voor genetisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij willen de coöperatieve geest van alle Caldwell Lab-leden erkennen. Bewegingsstoornissen onderzoek in het lab is ondersteund door de Bachmann-Strauss Dystonie &amp; Parkinson Foundation, Verenigde Parkinson Foundation, American Ziekte van Parkinson Vereniging, de ziekte van Parkinson Vereniging van Alabama, de Michael J. Fox Foundation voor onderzoek van Parkinson, en een Undergraduate Research.

Expressieplasmide Bouw Twee plasmiden zijn nodig: een voor weefsel-specifieke expressie van het gen van interesse en een tweede als selecteerbare transformatie marker. Experimentele Plasmide <ol><li> Selecteer een promotor die wordt uitgedrukt in de weefsels / cellen soort belang, bijvoorbeeld, een zenuw of spier-specifieke promoter. Als men is om meerdere genen tot expressie in hetzelfde weefsel, kan een promotor cassette plasmide in het Gateway-systeem (Invitrogen) worden gebruikt. Deze aanpak maakt het inbrengen van een gen van belang stroomafwaarts van de promotor door recombinationele klonen 4. In het algemeen, 2-5 kb van de upstream-sequenties voldoende is om correcte en nauwkeurige uitdrukking hebben. </li><li> Het cDNA van het gen van belang gekloond kunnen worden op twee manieren: <ol><li> Conventionele klonen met behulp van restrictie-enzymen. </li><li> Voor het klonen van Gateway, is het PCR geamplificeerd met behulp van primers die de gateway att B recombinationele volgorde bevatten. De versterkte cDNA wordt eerst gerecombineerd in de donor vector pDONR201 om de invoer vector te maken en daarna getransformeerd in E. coli stam DH5a. Volgende selectie van succesvolle recombinanten en mini-prep isolatie van DNA, wordt het item vector gerecombineerde in de promotor-bevattende bestemming vector het maken van de expressieplasmide. Details over recombinationele klonen zijn verkrijgbaar bij zowel de Invitrogen Gateway handleiding of in Caldwell et al.. 5. </li></ol></li></ol> Selecteerbare Marker Plasmide Voorbeelden van transgene marker plasmiden zijn rol-6 of het gebruik van het lichaam muur spier promotor unc-54 tot en met fluorescerende eiwit expressie rijden. Deze marker plasmiden zijn meestal beschikbaar vanuit de onderzoeksgemeenschap op aanvraag. Micro-injectie van C. elegans Voorbereiding <ol><li> Een DNA-isolatie van de twee plasmiden die moeten worden geïnjecteerd. Kwantificeren en meng ze samen in een 1:1 verhouding van 50 ng / ul per stuk. </li><li> Bereid agar pads: <ol><li> Maak een 2% agarose-oplossing in water, hitte of in de magnetron totdat het is opgelost. </li><li> Aangegeven een aantal 22 x 50 mm bestrijken glazen op een benchtop. </li><li> Met behulp van een Pasteur pipet, plaats een daling van de gesmolten agarose op een dekking van glas en meteen een seconde afdekglas plaats over de daling bij een 90 hoek ten opzichte van de eerste. Herhaal dit voor verschillende andere dekglaasjes. De diameter van de afgeplatte schijf van agarose moet tussen de 15-20 mm. </li><li> Nadat de agarose is gestold (dit duurt maar even), verwijder dan de dekking van glas en laat het pad volledig aan de lucht drogen (enkele uren tot &#39;s nachts). </li><li> Bewaar de pads in een deksel glazen doos op kamertemperatuur. </li></ol></li><li> Maak naald laders voor DNA-oplossing: Naald laders zijn gemaakt van 100 ul capillaire buisjes die in het midden verwarmd boven een open vuur en snel getrokken om ongeveer twee keer hun lengte. De twee helften uit elkaar geklikt zodra de capillair afkoelt. Voorraad 10-20 naald laders voor injectie. Rechtop bewaren in een microcentrifugebuis rek. Wees voorzichtig om niet zichzelf te spiesen op de punten. </li><li> Maak micro-injectie naalden: De naald is gemaakt van een speciale capillaire buis dat een interne glas gloeidraad bevat; dit filament dient als een lont voor de DNA-oplossing. Deze zijn getrokken op een naald-trekker machine. We maken gebruik van een Narishige PP-830 trekker met een warmte-instelling van 24,8. Meerdere naalden zijn getrokken op een moment en worden opgeslagen in een klein plastic doosje. Meerdere naalden kunnen gemakkelijk worden &quot;gemount&quot; op een strip van boetseerklei voor langdurige opslag. </li><li> Punt van de naald &quot;branding&quot;: De tip van de micro-injectie naald wordt getrokken zo fijn dat het eigenlijk is gesloten op het einde en moet worden opengebroken met behulp van kleine scherven van de dekking glas. Deze worden bereid door wikkelen een 18 x 18 mm dekglas in een papieren handdoek en voorzichtig druk uit te oefenen totdat het breekt in stukken. Scherven van een bruikbare afmetingen zijn ongeveer 3 x 4 mm. </li><li> Grow wild type (N2) wormen aan het begin van de volwassen stadium voor injectie met behulp van standaardprocedures 6. Bereid ongeveer 100 goed geënsceneerd wormen / bouwen geïnjecteerd. </li></ol> Procedure <ol><li> Open de hoofdkraan op een helium tank die is aangesloten op een micro-injectie naald arm en houder. Sluit de regelventiel zodat het gas naar de regel in te voeren, waardoor de druk om 35 psi. Merk op dat het gas kan worden vrijgegeven met behulp van een voetpedaal. </li><li> Steek een naald lader in een standaard mond pipetter slangen (te vinden in verpakkingen van glas capillaire buizen) en het opstellen van een kleine hoeveelheid van het plasmide mengsel (~ 1 pi). </li><li> De naald lader wordt zorgvuldig geplaatst in de back-end van een injectienaald ingebracht en voorzichtig de weg door de lengte vande naald totdat u weerstand voelt. Verdrijf de DNA-oplossing door zachtjes te blazen, dan verwijdert u de lader. </li><li> Steek de naald in de micro-injectie arm, en let te plaatsen binnen de kleine interne rubberen pakking. </li><li> Plaats een naald-brekende scherf van de dekking glas op een rand van een agar pad. Dek de scherf, evenals het gehele oppervlak van de agar pad, met halogene olie. Plaats de agar pad op het podium van een omgekeerde microscoop. </li><li> Plaats de naald in het midden van het veld met behulp van het bekijken van de 4x objectieve en heldere gebied van verlichting, maar nog niet laten zakken in de olie. Ook de binnenkant van de scherf van de dekking glas in het midden, dan richten op het (nog steeds met behulp 4X doelstelling). Laat de naald in de olie, waardoor het in dezelfde focal plane als de scherf van de dekking glas. Verhoog de vergroting door over te schakelen naar de 40X doelstelling. Richten op de rand van de scherf en de positie van de punt van de naald, indien nodig. </li><li> Het openstellen van de punt van de injectienaald, zacht duwtje de naald tegen de rand van het deksel glas scherf, terwijl tegelijkertijd de toepassing van een korte puls van gas via het voetpedaal. De naald zal voldoende opengebroken wanneer kleine druppeltjes vloeistof ontsnappen aan de uiteinde van de naald. Overtollige vloeistof stromen als gevolg van een te grote opening is niet wenselijk, omdat het doden van de dieren. </li><li> Haal de agar pad vanaf het podium door het verhogen van de naald op, maar veranderen niets aan de X-of Y-as positie. Schuif de stage uit onder de naald, verwijder de agar pad en plaats deze op een dissectie microscoop. Overdracht van een worm op het pad, onder het oppervlak van de olie. Als de worm kronkelt voorzichtig aaien tot hij contact maakt met de agar pad. De vochtige worm dient te houden aan de droge agarose. </li><li> Injectie <ol><li> Plaats snel de agar pad weer op het podium, het centreren van de worm in het gezichtsveld. </li><li> Laat de naald in hetzelfde vlak van focus als de worm. </li><li> Zet de filters om Hoffman Verlichting (een soort contrast filter). Dit maakt morfologische detail van de worm om zichtbaar te worden. Als Nomarski / DIC optiek zijn beschikbaar op de omgekeerde ruimte die zo goed zal werken. Met behulp van de 40X doel, focus op de &quot;korrelig&quot; syncytieel midden van de worm gonaden, onder de &quot;honingraat&quot; patroon van de kiem kernen (kiezen welke gonaden is gepositioneerd aan de kant van de worm naar de naald). </li><li> Fijnafstemming van de positie van de naald totdat de tip ook in focus (hetzelfde vlak als de gonaden &quot;korreligheid&quot;). </li><li> Steek de naald in het midden van de gonaden en breng een korte puls van gas druk om een ​​druppel of twee van DNA te verdrijven in de gonaden arm. U moet zich aan een golf van vloeistof verspreid over de distale gonade. Denk niet dat meer vloeibaar is beter, want te veel vloeistof kan stromen in de proximale bocht van de gonaden arm, die kan stilgelegd eicel productie. Indien mogelijk, afhankelijk van de positie van de worm, injecteren de andere gonaden arm op dezelfde manier. </li><li> Het is belangrijk om snel te werken, terwijl het injecteren van een worm, omdat het gemakkelijk kan uitdrogen. De beslissing om de tweede gonaden arm injecteren is afhankelijk van hoe snel je kunt opnieuw de positie van de naald en worm. Het hele proces idealiter minder dan 1-2 minuten. </li></ol></li><li> Verwijder het deksel glas van het podium en plaats het op een dissectie reikwijdte. Van toepassing zijn 1μl van M9 buffer (22mm KH 2 PO 4, 42mm Na 2 HPO 4, 85mm NaCl, 1 mM MgSO 4) direct op de ingespoten worm (dit kan leiden tot onder te dompelen de pipetpunt onder het oppervlak van de halogene olie). De buffer moet hydrateren de worm, en wordt dan drijven uit de agarose pad oppervlak. Overdracht van de worm een ​​gewone plaat met behulp van een worm te kiezen. De agarose pad kan worden hergebruikt nog een aantal keren totdat het is geworden te verzadigd met buffer en de wormen niet meer houden. </li></ol> Transgene selectie <ol><li> Geïnjecteerd wormen, de P-0 generatie, worden overgebracht naar de individuele verse, bacterieel geplaatste platen (60 mm) en mag zich voort te planten. Typisch, worden geïnjecteerd dieren geïncubeerd bij 20 ° C gedurende 2-3 dagen totdat de nakomelingen verschijnen. </li><li> De F 1 nakomelingen zijn waargenomen voor het bewijs van de transgene marker (zoals fluorescentie) met behulp van een fluorescerende stereomicroscoop. Elke tl-licht, drager F 1, is dier afzonderlijk gekloond op een nieuwe plaat (sinds nakomelingen van elk F 1 zijn een duidelijke lijn beschouwd). De F 1 hermafrodieten mogen reproduceren. Nogmaals, is dit typisch uitgevoerd bij bij 20 ° C gedurende 2-3 dagen totdat de nakomelingen verschijnen. </li><li> De F-2 generatie is waargenomen voor transgene dieren. F 2 dieren die hebben geërfd en die de transgene array worden beschouwd als een &quot;stabiel&quot; lijn. OPMERKING: Bij de F 1 eleeftijd kunnen er tal van transgene dieren, maar ze zijn niet stabiel. De meerderheid van de F 1 transgene dieren zullen niet worden doorgegeven in de F 2 stabiele lijnen. OPMERKING: Om te bepalen voor de variabiliteit in het gen kopie-aantal, het genereren van een minimum van drie onafhankelijke stabiele lijnen per construeren geïnjecteerd. </li><li> Iedere onafhankelijke stabiele lijn moet worden gehandhaafd als een aparte lijn van de wormen. Elke lijn kan worden gepropageerd door de overdracht van verschillende transgene dieren om een ​​nieuwe plaat bij elke generatie, dit moet worden uitgevoerd met behulp van een fluorescerende stereomicroscoop als de selecteerbare merker is fluorescerend. </li></ol>

<ol><li>Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+DNA+transformation+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).</li>
<li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+in+C.elegans%3A+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li>
<li>Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+requirements+for+somatic+and+germline+expression+of+a+generally+expressed+Caenorhabditis+elegans+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene.</a> Genetics. 146, 227-238 (1997).</li>
<li>Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torsin-mediated+neuroprotection+from+cellular+stresses+to+dopaminergic+neurons+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans.</a> J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).</li>
<li>Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , John Wiley and Sons. West. Sussex, England. (2006).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
</ol>

Bij het doen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden: - Injecteren direct in het centrum van de gonaden - Injecteer niet te veel vloeistof - Snel werken om uitdroging te voorkomen. Als je in de problemen met de naald, zoals het is gebroken te groot is, is het het beste om remake een verse naald, in plaats van te proberen te injecteren met een minder dan ideale naald. De generatie van transgene wormen kent vele toepassingen, zoals: - Identificatie van gemuteerde genen, in de methode g...

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Ultrapuur</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Halogeenkoolstofolie, Voltalef</td><td>Hulle 10S</td><td>elfatochem, Frankrijk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dekglas 18x18 mm</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-A</td><td></td></tr><tr><td>Dekglas 20x30 mm</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5A</td><td></td></tr><tr><td>Dekglas 22x50 mm</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-E</td><td></td></tr><tr><td>100 µL capillair</td><td></td><td>VWR international</td><td>53432-921</td><td></td></tr><tr><td>Glazen capillair voor naalden</td><td>&quot;Kwik-Fil&quot;</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Naaldtrekker</td><td>Instrument</td><td>Narishige International</td><td>Model PP-830</td><td></td></tr><tr><td>microINJECTOR-systeem</td><td></td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>MINJ-1000</td><td>Microscoop, tafel, manipulator</td></tr><tr><td>Dissectie, met fluorescentie</td><td>Microscoop</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Dissectie</td><td>Microscoop</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ645</td><td></td></tr></tbody></table>

generatie van stable transgene c. elegans met behulp van micro-injectie

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgene Caenorhabditis elegans gemakkelijk kan worden aangemaakt via micro-injectie van een DNA-plasmide oplossing in de gonaden 1. Het plasmide DNA herschikt te vormen extrachromosomaal concatameren die stabiel zijn geërfd echter niet met dezelfde efficiëntie als de werkelijke chromosomen 2. Een gen van belang is co-geïnjecteerd met een duidelijke fenotypische marker, zoals rol-6 of GFP, om de selectie van transgene dieren mogelijk maken onder een microscoop dissectie. De exogene gen kan worden uitgedrukt van zijn eigen promotor voor cellulaire lokalisatie studies. Als alternatief kan het transgen worden aangedreven door een ander weefsel-specifieke promotor om de rol van het gen product in die bepaalde cel of weefsel te beoordelen. Deze techniek drijft efficiënte genexpressie in alle weefsels van C. elegans, behalve voor de geslachtscellen of vroege embryo 3. Creatie van transgene dieren wordt op grote schaal gebruikt voor een scala aan experimentele paradigma&#39;s. Deze video toont de micro-injectie procedure om transgene wormen genereren. Bovendien is selectie en het behoud van stabiele transgene C. elegans lijnen beschreven.

Deze video demonstreert de techniek van micro-injectie in de gonaden van C. elegans om transgene dieren te creëren.

Generatie van Stable transgene C. elegans Met behulp van micro-injectie

Transgene Caenorhabditis elegans kunnen eenvoudig worden gecreëerd via microinjectie van een DNA-plasmidoplossing in de gonade 1. Het plasmid-DNA herschikt zich tot ...

Sea elegance is een ongelooflijk nuttig modelorganisme dankzij zowel onze kennis van de cellijnen als de overvloed aan informatie die is voortgekomen uit het sequenceren en analyseren van het volledige genoom. In deze video demonstreren we het proces van micro-injectie van plasmiden in sea elegance en de selectie van transgene nakomelingen met behulp van fluorescentiemicroscopie; als transparant en meercellig dier is sea elegance ideaal voor het in vivo visualiseren van transgenen die fluorescent gelabelde eiwitten tot expressie brengen. Hallo, mijn naam is Laura Berkowitz en ik ben research associate in het Caldwell Lab van de afdeling Biological Sciences hier aan de University of Alabama.En ik ben Adam Knight, ook van het Calwell Lab aan de University of Alabama. Vandaag laat ik u zien hoe u zich voorbereidt op en het uitvoeren van plasmidmicro-injectie om transgene C. elegans te genereren, en ik zal u laten zien hoe u transgene C. elegans-lijnen selecteert en onderhoudt. Laten we beginnen.Voordat we beginnen met de micro-injectie, zijn er enkele voorbereidingsstappen die ik u nu zal tonen. Bereid eerst het plasmid-DNA voor dat geïnjecteerd moet worden; er zijn twee plasmiden nod

generation-of-stable-transgenic-c-elegans-using-microinjection

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Generatie van transgene C. elegans Door biolistische Transformatie

De mogelijkheid om transgenen te produceren...

De productie van C. elegans Transgenen via Recombineering met de GalK Selecteerbare marker

In model organismen, kan transgenese manipuleren genfuncties terwijl RNAi kan knockdown specifieke mRNA-transcripten 1-2. Dit protocol heeft tot doel illustratie van de technieken die nodig zijn om stabiel overgedragen DNA en van voorbijgaande aard dubbelstrengs RNA te brengen in de necromenic...

RNAi Mediated Gene Knockdown en Transgenese door micro-injectie in de Necromenic Nematode Pristionchus pacificus</em

Deze video beschrijft micro-injection, een veelgebruikte methode om transgene C. elegans stammen te creëren.  In het voorbeeld zien we micro-injection gebruikt om een ribonucleoproteïne (RNP) complex voor CRISPR-bases genbewerking te introduceren.

Gonad Microinjection: Een methode van samengestelde levering direct in de kiembaan van C. elegans

Dit protocol beschrijft een snelle en materiaalbesparende procedure voor de integratie van transgene extrachromosomale arrays in het Caenorhabditis elegans genoom met behulp van ultraviolette (UV) bestraling. Bovendien is dit protocol bijzonder geschikt voor transgene lijnen die extrachromosomale arrays met een hoge snelheid overdragen.

Een snelle protocol voor de integratie Extrachromosomaal Arrays Met High Transmission Rate in de<em&gt; C. elegans</em&gt; Genome

C. elegans is meestal gekweekt op vaste agar platen of in vloeibare culturen bezaaid met E. coli. Om te voorkomen dat bacteriële bijproducten van verstorende toxicologische en nutritionele studies, hebben we gebruik gemaakt van een axenische vloeibaar medium, CeHR, te groeien en te synchroniseren een groot aantal wormen voor een reeks afgeleide toepassingen.

Kweken Caenorhabditis elegans In Axenische Liquid Media en Creatie van transgene Worms door bombardement met microdeeltjes

De microinjectie van muis oocyten wordt vaak gebruikt voor zowel klassieke transgenese ( dwz de willekeurige integratie van transgenen) en CRISPR-gemedieerde gen targeting. Dit protocol beoordeelt de nieuwste ontwikkelingen in microinjectie, met speciale nadruk op kwaliteitscontrole en genotyping strategieën.

Generatie van genetisch gemodificeerde muizen via de microinjectie van oocyten

Met behulp van een voorgemonteerd Cas9 is ribonucleoprotein complex (RNP) een krachtige methode voor het bewerken van nauwkeurige en efficiënte genoom. Hier, wijzen wij op het nut ervan over een breed scala van cellen en organismen, met inbegrip van de primaire menselijke cellen en beide klassieke en opkomende modelorganismen.

Verbeterde genoom bewerken met Cas9 Ribonucleoprotein in verschillende cellen en organismen

Hier presenteren we protocollen voor het verzamelen en microinjecting precellular westelijke maïs rootworm embryo's bestemd voor de uitoefening van functionele-genomic assays zoals germline transformatie en CRISPR/Cas9-genoom bewerken.

Microinjection van Western maïswortelboorder, Diabrotica virgifera virgifera, embryo's voor Germline transformatie of CRISPR/Cas9 genoom bewerking

De functionele genomische toolkit voor de parasitaire nematoden Strongyloides stercoralis en Strongyloides ratti omvat transgenese, CRISPR/Cas9-gemedieerde mutagenese en RNAi. Dit protocol zal demonstreren hoe intragonadale micro-injectie kan worden gebruikt om transgenen en CRISPR-componenten in S. stercoralis en S. ratti te introduceren.

Het genereren van transgenen en knock-outs in strongyloides soorten door micro-injectie

Een CRISPR/Cas9 microinjectieworkflow voor endogene fluorescerende tagging in de Caenorhabditis elegans kiemlijn om homozygote knock-in-lijnen te verkrijgen voor in vivo eiwitlokalisatieanalyse.

CRISPR/Cas9-gemedieerde endogene fluorescerende tagging van kiemlijnspecifieke genen in Caenorhabditis elegans

Leer micro-injectie in de gonade van C. elegans om stabiele transgene lijnen te genereren. Deze methode maakt real-time visualisatie van fluorescerende eiwitexpressie in vivo mogelijk voor genetisch onderzoek.

Generatie van Stable transgene C. elegans Met behulp van micro-injectie

Meer video's verkennen