Generatie van Stable transgene C. elegans Met behulp van micro-injectie

Sea elegance is een ongelooflijk nuttig modelorganisme vanwege zowel onze kennis van zijn cellijnen als de schat aan informatie die is geproduceerd door het hele genoom te hebben gesequenced en geanalyseerd. In deze video demonstreren we het proces van micro-injectie van plasmiden in sea elegance en de selectie van transgene nakomelingen met behulp van fluorescente microscopie. Als transparant en meercellig dier is sea elegance ideaal voor het visualiseren van transgenen die fluorescent gelabelde eiwitten in vivo tot expressie brengen. Hallo, mijn naam is Laura Berkowitz en ik ben onderzoeksmedewerker in het Caldwell Lab in de afdeling Biologische Wetenschappen hier aan de Universiteit van Alabama.

En ik ben Adam Knight, ook van het Calwell Lab aan de Universiteit van Alabama. Vandaag laat ik je zien hoe je je voorbereidt op en Plasmin Microinjectie uitvoert om transgene sea elegance te genereren, en ik zal je laten zien hoe je transgene seal elegance lijnen selecteert en onderhoudt. Dus laten we beginnen.

Voordat we beginnen met de micro-injectie, hebben we een paar voorbereidingsstappen, die ik je nu laat zien. Eerst, bereid het plasmide-DNA voor dat geïnjecteerd zal worden, er zijn twee plasmiden vereist, een die codeert voor de weefselspecifieke expressie van ons gen van belang, en de tweede die een selecteerbare transformatiemarker biedt. Meng de plasmiden in een één-op-één verhouding van 50 nanogram per microliter.

Vervolgens bereid auger pads voor, die zullen worden gebruikt om de wormen voor injectie te immobiliseren. Om de auger pads te maken, legt u eerst verschillende dekglasjes van 22 bij 50 millimeter op de werktafel. Gebruik een weidepijpje om een druppel gesmolten 2% agros op een dekglas te plaatsen, en plaats onmiddellijk een tweede dekglas erover in een hoek van 90 graden ten opzichte van de eerste.

Laat de aero enkele seconden stollen en verwijder vervolgens het bovenste dekglas. De diameter van de afgeplatte schijf van aero moet tussen de 15 en 20 millimeter zijn. Laat de pad, net als een huisdier, volledig drogen gedurende enkele uren of een nacht.

Zodra ze droog zijn, bewaar de pads in een dekglasdoos op kamertemperatuur. Bereid vervolgens de naaldladers voor de DNA-oplossing voor. Om dit te doen, neem een honderd microliter capillairbuisje en verwarm het in het midden van een open vlam en trek het snel naar ongeveer twee keer zijn lengte.

Zodra het capillairbuisje is afgekoeld, knip de twee helften uit elkaar. Sla 10 tot 20 naaldladers op voor injectie. Je kunt ze rechtop in een microcentrifugebuisje bewaren.

Voorzichtig, de punten van de naaldlader zijn erg scherp. Maak nu de micro-injectienaalden.

Deze naalden worden gemaakt van een speciaal capillairbuisje dat een intern glasfilament bevat. Dit filament dient als een lont voor de DNA-oplossing. Om de naalden te maken, gebruiken we een Niki PP acht 30 Polar met een warmte-instelling van 24,8, meerdere naalden worden tegelijk getrokken voor opslag.

Meerdere naalden kunnen op een strook modelklei worden gemonteerd. Kleine scherven van dekglas worden gebruikt om de getrokken naaldpunt open te breken. Deze scherven worden bereid door een dekglas van 18 bij 18 millimeter in een Kim doek te wikkelen en voorzichtig druk uit te oefenen tot het in verschillende stukken breekt.

Gebruik scherven van ongeveer drie bij vier millimeter. Naast het voorbereiden van het DNA en de naalden, bereid ongeveer 50 tot 100 goed geplaatste. Twee wilde type wormen voor elk expressievectorconstruct dat geïnjecteerd zal worden.

We zijn nu klaar om de micro-injectiemicroscoop op te zetten. Om te beginnen met het opzetten van de microscoop, opent u de hoofdklep op de heliumtank die is verbonden met de micro-injectienaalarm en houder. Sluit de regelaar om het gas in de leiding te laten komen.

Breng de druk naar 35 PSI, het gas kan worden vrijgegeven met behulp van een voetpedaal. Plaats vervolgens een naaldlader in een standaardmondpijpje slang en laat een kleine hoeveelheid van het plasmide-mengsel van ongeveer één microliter vallen. Plaats nu voorzichtig de lader door de micro-injectienaald tot weerstand wordt gevoeld.

Stoot de DNA-oplossing uit door voorzichtig te blazen en verwijder vervolgens de lader. Zodra het DNA is geladen, plaatst u de naald in de micro-injectiearm, zorg ervoor dat deze binnen de kleine interne rubberen afdichting wordt geplaatst en klemp deze vervolgens vast aan de arm van de manipulator. Plaats vervolgens een scherf van dekglas om de naald te breken op een rand van een augerpad.

Bedek de scherf evenals het hele oppervlak van het augerpad met hol carbon olie. Plaats vervolgens het augerpad op het podium van een omgekeerde microscoop. Nadat het augerpad op zijn plaats is, positioneer de naald in het midden van het kijkveld met behulp van de Forex objectief en heldere veldverlichting, maar laat hem nog niet in de olie zakken.

Positioneer vervolgens de binnenrand van de scherf van het dekglas in het midden en focus vervolgens daarop. Laat de naald in de olie zakken, waardoor deze in hetzelfde brandpuntsvlak komt als de scherf van het dekglas. Verhoog de vergroting door over te schakelen naar de 40 x objectief, focus vervolgens op de rand van de scherf en verplaats indien nodig de punt van de naald.

Nu breek de punt van de injectienaald open. Duw de naald voorzichtig tegen de rand van de scherf van het dekglas, terwijl u tegelijkertijd een korte puls gas toepast via het voetpedaal. De naald zal voldoende open breken.

Wanneer kleine druppels vloeistof uit het uiteinde van de naald ontsnappen, is de overtollige vloeistofvloei te groot, een opening is niet wenselijk omdat het de dieren zal doden. Zodra de naald klaar is, beginnen we met de micro-injectie. Verwijder vervolgens het augerpad van het podium door de naald omhoog te brengen.

Maar verander niet de X- of Y-aspositie. Schuif het podium uit onder de naald. Verwijder het augerpad en plaats het op een dissertatiemicoscoop.

Breng een worm over op het pad onder