Phase Contrast en differentieel interferentie contrast (DIC) Microscopie
6 augustus 2008
Dit protocol benadrukt de principes en praktische toepassingen van Fase en differentieel interferentie contrast (DIC) Microscopie
Lichtmicroscopie is een van de meest essentiële instrumenten, zo niet het meest essentiële, in het veld van biomedisch onderzoek. Afhankelijk van de toepassing zijn verschillende verlichtingsmodi wenselijk voor het bekijken van preparaten. Deze video demonstreert twee optische modi van transmissieverlichting: fasecontrastmicroscopie en DIC-microscopie (differentieel interferentiecontrast).
Hallo, ik ben Victoria San Frolic van de kernfaciliteit Optische Beeldvorming aan het University of Texas Health Science Center in San Antonio. Vandaag laat ik u zien hoe u monsters correct kunt bekijken met behulp van fasecontrast- en differentieel-interferentiecontrastmicroscopie. Laten we beginnen.
Standaard helderveldmicroscopie is niet toereikend voor het bekijken van transparante en kleurloze preparaten. Fasencontrastmicroscopie wordt vaak gebruikt om contrast te creëren voor transparante biologische preparaten die geen licht absorberen. De techniek werd in 1942 ontdekt door Zernike, die de Nobelprijs ontving voor deze prestatie.
De fasecontrastmicroscoop is een lichtmicroscoop voor helderveldverlichting, maar dan voorzien van speciale fasecontrastobjectieven die een faseplaat of -ring bevatten, en een condensoranulus in plaats van een diafragma. De anulus bevindt zich meestal in de condensortoren en de grootte van de anulus moet worden afgestemd op de verschillende objectieven. Nadat de Kohler-verlichting is ingesteld, kiest u het juiste faseobjectief en draait u vervolgens de bijbehorende faseanulus in de condensor in de juiste positie.
Zodra de fase-ring van het objectief en de condensatorring correct zijn uitgelijnd zodat ze concentrisch en overlappend zijn, kunnen we het preparaat bekijken en de focus correct instellen. Laten we nu demonstreren hoe fasecontrast eruitziet door de microscoop. Hier is een beeld van een plakje ratlever.
Onder fasecontrast. Deze methode verbetert het uiterlijk van biologisch materiaal door het contrast te veranderen van verschillende grijstinten naar tinten van zwart tot wit. U zult echter merken dat monsters omgeven zijn door een halo, die de fijne structuur maskeert.
Deze halo is een artefact van de belichting door de fase-ring. U zult merken dat dit preparaat zeer moeilijk te zien is wanneer we overschakelen naar helderveld. Door terug te schakelen naar fasecontrast kunnen we de structuur en vorm van de cellen in het ratleverweefsel duidelijk zien, sinds de introductie hiervan aan het eind van de jaren 60.
Differentieel interferentiecontrast- of DIC-microscopie is populair in biomedisch onderzoek omdat het beelden met een hoge resolutie van fijne structuren produceert door de contrastrijke interfaces te versterken; het geproduceerde beeld is een zeer dunne optische sectie. In feite heeft het vermogen van DIC om optische secties te produceren het tot een nuttige modus van doorgelaat licht gemaakt voor complementaire confocale microscopie. De DIC-microscoop is een lichtmicroscoop voor helderveldmicroscopie met de toevoeging van de volgende elementen: een polarisator tussen de lichtbron en de condensor.
Een DIC-straalsplitterprisma in het condensordeel, een DIC-straalcombineerprisma direct achter het objectief en een analyzer in de oneindigheidsruimte vóór de twee lenzen. Om de beste prestaties uit DIC-optiek te halen, is het belangrijk om eerst de lichtmicroscoop af te stellen op Köhler-verlichting en vervolgens de DIC-elementen in het optische pad te plaatsen. Licht van de bron gaat door een polarisator en wordt vervolgens gesplitst door het eerste prisma.
Deze gepaarde stralen lopen vlak naast elkaar. Als beide stralen door hetzelfde materiaal in het preparaat passeren, zullen ze bij recombinatie door het tweede prisma niet met elkaar interfereren en daarom grijs verschijnen. Echter, bij de rand van een structuur passeert één straal van het paar een ander materiaal dan zijn partner, waardoor deze wordt beïnvloed.
Wanneer deze stralen door het tweede prisma worden samengevoegd, zullen ze ofwel constructief interfereren, wat een heldere plek oplevert, of destructief, wat een donkere plek oplevert. Hier is een weergave van diatomeeën onder DIC-contrast. U zult merken dat fijne details van de structuur van de diatomeeen gemakkelijk zichtbaar zijn.
Wanneer de DIC-optiek echter wordt verwijderd, verdwijnen deze details. Het contrast over het preparaat is aan de ene kant helder en aan de andere kant donkerder. Dit wekt de indruk van topografie, maar in feite is dit een illusie.
De richting van het schaduwwerking-effect kan worden omgekeerd door de polarisator via een crossover-punt naar het tegenovergestelde contrast te draaien. We hebben zojuist de optische modi van fasecontrast en DIC bekeken. Ter herinnering: fasecontrast-eliminatie verandert de contrastrijke specimens van zwart naar wit en is nuttig voor het bekijken van specimens die zowel kleurloos als transparant zijn.
DIC genereert ook contrast in het preparaat. Dit gebeurt door een afbeelding met een hoge resolutie van een dunne optische doorsnede te creëren. Dat is alles.
Bedankt voor het kijken en veel succes met uw microscopie.
Overzicht
Dit protocol belicht de principes en praktische toepassingen van fasecontrast- en differentieel-interferentiecontrastmicroscopie (DIC). Deze technieken verbeteren de visualisatie van transparante en kleurloze biologische monsters, waardoor ze essentiële instrumenten zijn in biomedisch onderzoek.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Biomedisch onderzoek
- Microscopietechnieken
- Optische beeldvorming
Achtergrond
- Lichtmicroscopie is essentieel voor het bekijken van biologische preparaten.
- Fasecontrastmicroscopie verhoogt het contrast voor transparante preparaten.
- DIC-microscopie levert beelden met een hoge resolutie van fijne structuren.
- Beide technieken zijn onmisbaar voor een effectieve analyse van preparaten.
Doel van de studie
- Om het gebruik van fasecontrast- en DIC-microscopie te demonstreren.
- Om de opstelling en uitlijning van microscopietechnieken toe te lichten.
- Om de voordelen van deze methoden bij het observeren van biologische materialen te benadrukken.
Gebruikte methoden
- Instellen van de Kohler-belichting voor een optimale lichtverdeling.
- Gebruik van fasecontrastobjectieven en annuli.
- Implementatie van DIC-optiek, inclusief polarisatoren en straalsplitsende prisma's.
- Vergelijking van de zichtbaarheid van preparaten onder verschillende microscopietechnieken.
Belangrijkste resultaten
- Fasecontrastmicroscopie brengt cellulaire structuren in transparante monsters in beeld.
- DIC-microscopie verbetert fijne details en zorgt voor een topografisch effect.
- Beide technieken verbeteren de helderheid van biologische monsters aanzienlijk.
- Artefacten, zoals halo's bij fasecontrast, worden vermeld en toegelicht.
Conclusies
- Fasecontrast is effectief voor het bekijken van kleurloze en transparante preparaten.
- DIC-microscopie biedt resolutie-rijke beelden van fijne structuren.
- Beide methoden zijn waardevol voor het bevorderen van onderzoek in de biologische wetenschappen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Fasecontrast- en DIC-microscopie maken de visualisatie van transparante, niet-lichtabsorberende biologische monsters mogelijk, wat ondersteuning biedt voor vroege ontdekkingsworkflows waarbij labelvrije beeldvorming vereist is. Deze technieken maken mechanische risicovermindering mogelijk door structurele details en functionele morfologie in levende cellen en weefsels te onthullen zonder fixatie of kleuring. Hun integratie in ontdekkingspipelines verhoogt het vertrouwen in de targetvalidatie door directe observatie van fenotypische responsen en cellulaire architectuur onder bijna-fysiologische condities mogelijk te maken.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt labelvrije observatie mogelijk van transparante monsters, zoals levende cellen en weefselcoupes, om morfologische veranderingen te beoordelen die gekoppeld zijn aan targetmodulatie.
- Operationele waarde: Ondersteunt snelle screening van cellulaire fenotypes zonder dat fluorescente labels of chemische fixatie nodig zijn, waardoor de voorbereidingstijd van de assay wordt verkort.
- Voorspellende waarde: Verhoogt het vertrouwen in target-hypothesen door directe visualisatie van structurele en functionele fenotypes in ziekterelevante systemen mogelijk te maken.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Biedt contrastrijke, labelvrije beeldvorming die geschikt is voor het ontwikkelen van fenotypische assays waarbij transparantie details in brightfield-microscopie maskeert.
- Operationele waarde: Maakt standaardisatie van beeldvormingscondities mogelijk via Koehler-verlichting en nauwkeurige uitlijning van faseplaten of DIC-prisma's, wat de reproduceerbaarheid tussen runs verbetert.
- Schaalbaarheid: Compatibel met multi-well plate-formaten bij integratie in geautomatiseerde microscopiesystemen, wat screeningcampagnes met een medium doorvoersnelheid ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen de ontdekkingsfase en de preklinische stadia door consistente beeldvorming van primaire cellen, explantaten en embryo-modellen in diverse workflows mogelijk te maken.
- Mechanische risicoreductie: Onthult fijne structurele details op weefselgrensvlakken, wat helpt bij het verduidelijken van werkingsmechanismen in complexe biologische systemen.
- Ziekterelevante systemen: Toepasbaar op dikke specimens, waaronder weefselcoupes, eicellen en embryo's, wat evaluatie in fysiologisch complexe modellen ondersteunt.
Integratie van Pipeline & Workflow
Fasecontrast- en DIC-microscopie fungeren als ondersteunende technologieën in het continuüm van ontdekkingen, waarbij ze hypothesetoetsing in de vroege biologie, assay-gereedheid bij screening en morfologische analyse in translationeel onderzoek ondersteunen.
- Discovery Biology: Faciliteert hypothese-testen door directe observatie van cellulaire responsen op perturbaties in transparante, niet-gekleurde specimens mogelijk te maken.
- Screening: Ondersteunt assay-ontwikkeling via reproduceerbare, hoogcontrast-imaging van labelvrije specimens, waardoor de variabiliteit in fenotypische read-outs wordt verminderd.
- Analytics: Genereert kwantitatieve intensiteits- en contrastmetingen bij structurele interfaces, wat een objectieve vergelijking van experimentele condities mogelijk maakt.
- Translationeel Onderzoek: Garandeert continuïteit door een consistente visualisatie van primaire weefsels en explantaten te bieden, van discovery tot preklinische validatie.
- Enterprise Reuse: Vertegenwoordigt een herbruikbare imaging-capaciteit voor verschillende afdelingen, waardoor redundantie in de allocatie van microscopieressources wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door fijne structurele details en topologische kenmerken in levende, niet-gekleurde preparaten onthuld te krijgen.
- Operationele waarde: Bevordert standaardisatie via gedefinieerde uitlijningsprocedures voor fase-annuli en DIC-optiek, wat de dagelijkse reproduceerbaarheid verbetert.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door het vertrouwen in fenotypische observaties te vergroten, waardoor uitval in een laat stadium door onverwachte biologische complexiteit wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt risicogebaseerde prioritering van targets mogelijk op basis van direct, labelvrij fenotypisch bewijs uit ziekte-relevante systemen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in optische uitlijning, inclusief Koehler-verlichting en nauwkeurige centrering van fasenplaten of DIC-prisma's.
- Afhankelijk van gespecialiseerde hardware: fasecontrastobjectieven met faseringen, condensorannuli, polarisatoren, straalsplitsende en straalcombinerende prisma's en analyseurs.
- Noodzaak tot standaardisatie van verlichtings- en uitlijningsprotocollen tussen teams om consistente resultaten tussen gebruikers en locaties te waarborgen.
- Overwegingen bij aanpassing omvatten het matchen van de brekingsindex en de dikte van het specimen, die de kwaliteit van de DIC-doorsneden en fasecontrast-halo-artefacten beïnvloeden.
- Praktische beperkingen omvatten halo-artefacten bij fasecontrast die fijne structuren kunnen maskeren, en het directionele schaduweffect bij DIC, wat een optische illusie is die de werkelijke topografie niet representeert.
