De MODS methode voor de diagnose van tuberculose en multidrug-resistente tuberculose
11 augustus 2008
De microscopische observatie-drug-gevoeligheid (MODS) test is een low-cost, low-tech tool voor high-performance detectie van tuberculose (TB) en multiresistente tuberculose (MDRTB). Deze video beschrijft de MODS vloeistof mediacultuur methode.
Van elke drie mensen in de wereld is er één besmet met tuberculose. Het diagnosticeren van actieve tuberculose voorkomt nieuwe infecties omdat patiënten met actieve tuberculose gemiddeld tussen de 10 en 15 andere mensen per jaar zullen infecteren totdat ze worden behandeld of sterven. MODS is een acroniem dat we gebruiken om te voorkomen dat we microscopische observatie, geneesmiddelgevoeligheidstest en de reden dat het zo wordt genoemd, moeten zeggen. Dit wordt duidelijk wanneer de methodologie wordt uitgelegd.
In de korte video zullen we de MODS-methodologie voor de snelle, goedkope diagnose van tuberculose en multidrug-resistente tuberculose schetsen. De video zal de methodologie stap voor stap uiteenzetten. We bespreken de bioveiligheidsimplicaties van het werken met vloeibare kweek en we leggen ook enkele van de belangrijke kwaliteitsborgingskwesties uit die vereist zijn voor het gebruik van deze methodologie.
De MODS-test werd ontwikkeld aan de Kayana Universiteit in Lima, Peru in het laboratorium van Bob Gilman. Na waarnemingen die aanvankelijk werden gedaan door loose cavi. LOOSE probeerde snelle manieren te identificeren om mycobacterium tuberculosis in kweek te detecteren met behulp van colormetrische indicatoren.
Maar ze merkte op dat de observatie van die kweek onder de microscoop de aanwezigheid van groei van microbacteriën verscheidene dagen voordat de colormetrische indicatoren van kleur veranderden, en op basis van die observatie werd de MOD's-test ontwikkeld. De MOD's-test werd ontwikkeld in een omgeving met beperkte middelen en is gericht op omgevingen met beperkte middelen, daarom kost het minder dan 3 per test voor vloeibare kweek voor detectie van TB en detectie van multidrug-resistentie. Het is uiterst aantrekkelijk en brengt voor het eerst dit soort diagnostische capaciteit naar plaatsen waar de middelen beperkt zijn.
Dus de MODS-test is gebaseerd op drie centrale principes. De eerste is dat mycobacterium tuberculosis veel sneller groeit in vloeibaar medium dan in vast medium. Dit is een feit dat al vele jaren bekend is.
Ten tweede is dat als we die vloeibare kweek onder de microscoop observeren, we de groei van myb-tuberculose veel sneller kunnen detecteren dan te wachten op het macroscopisch uiterlijk van kolonies op vast medium. En inderdaad is die groei volkomen karakteristiek, zodat we M. tuberculosis in vloeibaar medium kunnen onderscheiden van bacteriële of schimmelcontaminatie, of inderdaad van de groei van atypische niet-tuberculeuze mycobacteriën die aanwezig kunnen zijn. Ten slotte, en dit is misschien wel het meest opwindende aan de MODS-test, is dat we de geneesmiddelen rifampicine en dus multidrug-resistentie rechtstreeks uit sputum kunnen opnemen.
Door deze geneesmiddelen aan het begin van de test te gebruiken, kunnen we zowel tuberculose als tegelijkertijd detecteren of het isolaat resistent is tegen deze twee geneesmiddelen. En dit maakt het niet nodig om subcultuur te maken en een indirecte geneesmiddelgevoeligheidstest te creëren. Dus nu gaan we het apparatuur beschrijven dat nodig is om de MODS-test uit te voeren.
Er is een koelkast nodig om het bereide medium op te slaan. Een weegschaal is vereist om de is en rifampicine te wegen. Een vortex is nodig voor het mengen van sputum.
Met de decontaminatieoplossing is een centrifuge vereist voor het concentreren van het gedecontamineerde sputummonster, en deze moet in staat zijn om 3000 G te bereiken. De centrifuge hoeft niet gekoeld te worden, maar het is absoluut essentieel dat deze bios-veilig is en om bios-veilig te zijn. Voor mycobacteriële werkzaamheden is vereist dat de emmers van de centrifuge kunnen worden afgesloten met vergrendelbare deksels. Een incubator die 37 kan bereiken en 37 graden Celsius kan handhaven, is vereist.
Dit hoeft geen CO2-verrijkte niet te zijn. Een omgekeerde microscoop is vereist om de MODS-platen te lezen, en deze moet objectieven van vier x en 10 x hebben en een autoclaaf is nodig om medium te steriliseren en ook voor het weggooien van microbacteriële kweek, micros zijn vereist voor aliquot in medium, een biologische veiligheidskast. Klasse twee is vereist voor procedures waarbij manipulatie van sputummonsters en inoculatie van platen betrokken is.
De reagentia die nodig zijn om de MODS-test uit te voeren, zijn als volgt, Middlebrook zeven H negen media cascione en glycerol Panta, dat is het antibioticumsupplement en OADC. De voedingssupplementvoorraden van de antibiotica zijn en Rifampin dimethylsulfoxide, DMSO voor de bereiding van rifampicine, natriumhydroxide, natriumcitraat en nyl cysteïne voor sputumdecontaminatie di, natriumfosfaat en monokaliumfosfaat voor de bereiding van de fosfaatbuffer, 10% natriumhypochloriet voor het weggooien van geïnfecteerde afval en desinfectiemiddel voor het schoonmaken van werkoppervlakken. De volgende plastic en verbruiksartikelen zijn ook vereist: steriele glazen buisjes 0,2 micrometer filters voor waterige oplosmiddelen en 0,2 micrometer filters voor organische oplosmiddelen, microcentrifugebuisjes, 15 mil centrifugebuisjes, steriele 50 milliliter, 10 milliliter serologische peppes past peppes steriele micropipetpunten 24 welbewekbare weefselkweek type platen en afsluitbare Ziploc type ine zakjes waarin de 24 welbewekbare platen worden geplaatst nadat het sputummonster in het medium is geïnoculeerd.
Er zijn vier groepen voorraadoplossing die van tevoren kunnen worden bereid. De fosfaatbufferoplossing bestaat uit een combinatie van natriumfosfaat, diba en kaliumfosfaatmonobasisoplossingen, aangepast tot een pH van 6,8 plus of min 0,2. Deze oplossing wordt geautoclaveerd bij 121 tot 124 graden Celsius gedurende 15 minuten om te steriliseren, en een aliquot wordt gekweekt op voedingsagar om de steriliteit te bevestigen.
Deze kan in de koelkast worden bewaard bij twee tot acht graden Celsius gedurende maximaal één maand. Elk sputummonster vereist 10 milliliter fosfaatbufferoplossing. De voorraadoplossing voor sputumdecontaminatie is een natriumhydroxide-natriumcitraatcombinatie.
Deze oplossingen worden in gelijke volumes gecombineerd en geautoclaveerd bij 121 tot 124 graden Celsius gedurende
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
De drug-susceptibility assay op basis van microscopische observatie (MODS) is een goedkope, eenvoudig uitvoerbare methode voor hoogwaardige detectie van tuberculose (TB) en multidrugresistente tuberculose (MDRTB). Deze video beschrijft de MODS-methodologie voor de snelle diagnose van TB en MDRTB.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Microbiologie
- Infectieziekten
- Diagnostische methoden
Achtergrond
- Eén op de drie mensen wereldwijd is besmet met tuberculose.
- Actieve tuberculose kan leiden tot meerdere nieuwe infecties als het niet wordt gediagnosticeerd en behandeld.
- De MODS-assay is ontworpen om een snelle en goedkope diagnostische methode te bieden.
- Het begrijpen van de methodologie is cruciaal voor een effectieve implementatie.
Doel van de studie
- Om de MODS-methodologie voor het diagnosticeren van tuberculose te beschrijven.
- Om het belang van vroege diagnose bij het voorkomen van de verspreiding van TB te benadrukken.
- Om biosafety en kwaliteitsborging bij het gebruik van vloeibare kweek te bespreken.
Gebruikte methoden
- Microscopische observatie van geneesmiddelgevoeligheid.
- Vloeibaar medium cultuurmethode.
- Stapsgewijze uitleg van de methodologie.
- Discussie over biosafety-implicaties.
Belangrijkste resultaten
- De MODS-assay detecteert TB en MDRTB effectief.
- Het is een kosteneffectieve oplossing voor omgevingen met beperkte middelen.
- Kwaliteitsbewakingsmaatregelen zijn essentieel voor betrouwbare resultaten.
- Inzicht in de methodologie verbetert de diagnostische mogelijkheden.
Conclusies
- De MODS-assay is een waardevol instrument bij de diagnose van TB.
- Vroegtijdige detectie kan de transmissiesnelheid aanzienlijk verminderen.
- Een adequate training en kwaliteitscontrole zijn noodzakelijk voor een succesvolle implementatie.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
De MODS-assay maakt vroege detectie van tuberculose en multiresistente tuberculose mogelijk, wat direct bijdraagt aan targetvalidatie in programma's voor infectieziekten door snelle fenotypische bevestiging van de aanwezigheid van pathogenen en drugresistentie. Het kosteneffectieve formaat met vloeibare kweek maakt integratie in discovery-workflows mogelijk, waarbij mechanische risicoanalyse bevestiging vereist van target-engagement in klinisch relevante systemen. Dit positioneert MODS als een translationele brug voor preklinische screeningcampagnes gericht op TB-therapeutica, vooral in omgevingen met beperkte middelen waar de toegankelijkheid van assays invloed heeft op go/no-go-beslissingen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt fenotypische bevestiging mogelijk van de groei van Mycobacterium tuberculosis en patronen van geneesmiddelresistentie, wat hypotheseonderzoek naar doelen bij de ontdekking van antimicrobiële middelen ondersteunt.
- Operationele waarde: Maakt gelijktijdige detectie van TB en MDRTB mogelijk zonder subcultuur, waardoor de complexiteit van de workflow en de doorlooptijd voor resistentieprofielanalyse worden verminderd.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve, tijdopgeloste groeimetingen in vloeibare media, waardoor kinetische analyse van de effecten van verbindingen op de levensvatbaarheid van mycobacteriën mogelijk wordt.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van gestandaardiseerde, eenvoudige infrastructuur (incubator, omgekeerde microscoop, veiligheidskabinet) die compatibel is met gedecentraliseerde screeningplatformen.
- Strategische waarde: Ondersteunt de reproduceerbaarheid van assays tussen verschillende locaties vanwege gedefinieerde kritische concentraties van isoniazid (0.4 µg/mL) en rifampicine (1.0 µg/mL) voor de interpretatie van resistentie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Behoudt de relevantie voor de ziekte door gebruik te maken van sputum-afgeleide monsters, waardoor de kenmerken van klinische isolaten behouden blijven voor afstemming met preklinische modellen.
- Operationele waarde: Bevat ingebouwde kwaliteitscontroles (negatieve en positieve controlestammen) die de integriteit van de assay waarborgen gedurende longitudinale preklinische studies.
- Translationele waarde: Faciliteert continuïteit van vroege hit-validatie tot preklinische kandidaatbeoordeling door een consistente MDRTB-detectiemethodologie te bieden.
Integratie van Pipeline & Workflow
De MODS-assay past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot lead-optimalisatie, in het bijzonder voor antimicrobiële programma's waarbij fenotypische resistentieprofilering vereist is voordat verbindingen verder worden ontwikkeld.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-toetsing door Mycobacterium tuberculosis te onderscheiden van contaminanten via karakteristieke koordvorming, wat specifieke read-outs voor target engagement mogelijk maakt.
- Screening: Levert kwantitatieve gegevens over groeiremming in wells met geneesmiddelen, waardoor directe vergelijking van de gevoeligheid van verbindingen ten opzichte van resistente stammen mogelijk is.
- Analytics: Genereert binaire resistentie/gevoeligheid-outputs op basis van gedefinieerde drugconcentraties, wat duidelijke go/no-go-criteria mogelijk maakt voor verbindingen die gericht zijn op resistente TB.
- Translationeel Onderzoek: Maakt gebruik van klinische isolaten en behoudt fenotypische resistentieprofielen, wat de voortgang van discovery naar preklinische modellen ondersteunt in lijn met biomarkers.
- Enterprise Hergebruik: Maakt gebruik van niet-gepatenteerde, goedkope reagentia en gestandaardiseerde protocollen, waardoor brede implementatie over discovery- en preklinische units mogelijk is zonder licentiebeperkingen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door direct fenotypisch bewijs van drugresistentie te leveren, waardoor het voorspellend vertrouwen in targetvalidatie wordt verbeterd.
- Operationele waarde: Garandeert standaardisatie door vaste drugconcentraties en ingebouwde controles, wat de reproduceerbaarheid tussen locaties en teams vergroot.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroegtijdige resistentieprofilering mogelijk te maken, waardoor laatstadium-falen als gevolg van ongedetecteerde MDRTB in preklinische modellen wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Informeert risico-gecorrigeerde prioritering door verbindingen te identificeren die actief zijn tegen zowel drug-gevoelige als multidrug-resistente stammen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in microbiologische technieken, het hanteren van vloeibare culturen en biosafety level 2-praktijken voor werk met mycobacteriën.
- Afhankelijk van infrastructuur, waaronder een incubator (37°C), centrifuge (3000 G), omgekeerde microscoop (4x, 10x objectieven) en een biologische veiligheidskast.
- Vereist standaardisatie van de bereiding van reagentia, in het bijzonder de werkoplossingen van antibiotica (isoniazid 0.4 µg/mL, rifampicine 1.0 µg/mL) om een nauwkeurige interpretatie van de resistentie te waarborgen.
- Vereist overwegingen voor aanpassing bij uitbreiding naar niet-tuberculose mycobacteriën of schimmelcontaminanten, aangezien de groeimorfologie verschilt en orthogonale bevestiging kan vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak voor dagelijkse plaatlezing van dag 5 tot 14 en biosafety-protocollen om aerosolrisico's tijdens sputumdecontaminatie en centrifugatie te beheersen.
