Protocollen voor microapplicator-geassisteerde Infectie van lepidoptera Larven met Baculovirus
23 augustus 2008
In deze video, tonen we twee microapplicator technieken die worden gebruikt om infecteren van lepidoptera larven met baculovirus om insecten efficiency te bepalen.
Hoewel het arthropoden-specifieke baculovirus wordt gebruikt als standaard onderzoeksinstrument voor eukaryote eiwitexpressiesystemen, wordt het ook ontwikkeld als een milieuvriendelijk insecticide dat herbivore insecten, zoals lepidoptera in de natuur, kan doden. Lepidoptera-larven raken geïnfecteerd met baculovirussen wanneer zij geïnfecteerd loof eten. De larven of rupsen nemen het baculovirus op in een vorm die bekend staat als een polyhederon, wat een complex is van viruspartikels verpakt in een grote kristallijne proteïnestructuur die het virus beschermt tegen uitdroging.
Zodra de larve is geïnfecteerd, verspreidt het virus de infectie binnen het insect. Het virus kaapt het machinerie voor de synthese van nucleïnezuren en eiwitten van de gastheer om meer virus en polyhedra te produceren. Uiteindelijk raken de larven zo grondig geïnfecteerd met het virus dat ze oplossen in een stroperige massa van polyhedra die op plantoppervlakken druppelt die door het insect worden gegeten, waarna de cyclus opnieuw begint om de insecticide effectiviteit van een specifieke Baca te bepalen.
Technieken voor micro-applicatoren van virusstammen en bioassays kunnen worden gecombineerd. Leid-larven kunnen worden geïnfecteerd door injectie van het virus direct in de hemosol of de lichaamsholte, waarna de mortaliteitspercentages kunnen worden beoordeeld. Daarnaast kunnen larven worden geïnfecteerd met polyhedra via orale injectie met behulp van een micro-applicator, waarbij de timing van de infectie van de darm en andere weefsels kan worden geanalyseerd.
Hallo, ik ben Wendy Sparks uit het laboratorium van Brian E. Boning van de afdeling Entomologie aan de Iowa State University, en ik ben ook verbonden aan Boning Lab. Vandaag laten we u twee procedures zien voor het infecteren van lab-kweek-Drosophila met het baculovirus. Beide methoden maken gebruik van een micro-applicator.
Ten eerste laat ik u zien hoe u een micro-applicator gebruikt om het lichaamsvirus via de prole in de heni brengt. Vervolgens laat ik u zien hoe u de micro-applicator gebruikt om de polyheader via de mouse in de mid guard brengt. Laten we beginnen.
Wanneer ze worden ontwikkeld voor insecticide doeleinden, bevatten balo-virussen gewoonlijk het polyedergen om orale infectie van plaaglarven te vergemakkelijken. Er zijn echter soms redenen om een polyeder-negatief baccula-virus te testen op potentiële insecticide effecten of om de darmen van een insect te omzeilen. In dat geval kan injectie van het gebudde virus met behulp van een micro-applicator worden uitgevoerd om de larven te infecteren voordat de assay wordt gestart.
De titer van de werkvoorraad van het gebutte virus moet worden bepaald met behulp van een plaque-assay of endpoint-verdunningsassays. Voor fysiologische experimenten zouden injecties van five times 10 to the fourth PFU per vijfde instar H VNS typisch zijn. Om deze bioassay te starten, wordt elke verdunning van het gebutte virus geladen in een plastic one cc to hercule spuit met een scherpe naaldpunt van 28,5 of 32 gauge.
Meestal kunnen één tot drie microliter van een verdunde virusoplossing, met een titer van 10⁷ tot 10⁸ per milliliter, per larve worden gebruikt, waardoor het laden van 300 tot 500 microliter in de spuit voor de meeste doeleinden voldoende is. Drijf vervolgens luchtbellen uit de spuit door deze rechtop te houden zodat de lucht naar de naaldpunt beweegt, en doseer deze.
Bevestig vervolgens de spuit aan de ondersteuningsbuis voor de spuit. Stel nu het volume in op 1,0 microliter. Kalibreer voor elke druppel eerst de microprocessor-besturingseenheid van de micro-applicator om te garanderen dat het juiste volume wordt gedoseerd; de snelheid waarmee de druppel wordt gedoseerd kan worden ingesteld op een schaal van nul tot negen.
Er wordt gewoonlijk een bereik van nul tot één gebruikt. Druk op de voetpedaal om te controleren of de oplossing correct wordt gedoseerd. Houd er rekening mee dat wanneer er te veel oplossing wordt gedoseerd of als de toediening te traag verloopt, de volume- en snelheidsinstellingen kunnen worden aangepast totdat het juiste volume oplossing met de juiste snelheid wordt toegediend.
Ik ben nu klaar om te beginnen met de injectie voor H VNS-infectie. Larven in het vroege vijfde stadium worden doorgaans geïnjecteerd, aangezien de grotere omvang van de latere stadia het injectieproces vergemakkelijkt. Steek de naaldpunt door de plana van een van de prolegs en in de lichaamsholte.
Let op: wanneer de naaldpunt in de prole wordt ingebracht, verandert de positie van het larvenlichaam. Druk nu vier keer op de voetschakelaar om vier µL van de virusoplossing in de hemo seal te injecteren, om beschadiging van het darmkanaal en de lichaamswand te voorkomen. Plaats na voltooiing van de injecties alle larven terug in de incubator op 28 °C. Controleer regelmatig op dode larven en zorg ervoor dat er voldoende voedsel beschikbaar is voor de overlevende larven.
Hoewel late stadia niet sterven door beschadiging van de cuticula als gevolg van de injectie, moeten de larven 24 uur na injectie nog steeds worden gecontroleerd op beschadiging van het darmkanaal, wat het gevolg kan zijn van een bacteriële infectie. Deze vroege mortaliteit moet worden uitgesloten van de data-analyse. Indien de met een micro-applicator ondersteunde bioassay met gebutteerd virus wordt gebruikt voor bioassays voor de letale concentratie, moet de bioassay drie of vier keer op verschillende tijdstippen worden herhaald.
Gebruik 30 individuen per dosis voor elke virusbehandeling of controlebehandeling. Gebruik een geschikt programma voor probit-analyse, zoals polo of SAS, om de lc 50-waarden, 95%-betrouwbaarheidsintervallen en de relevante statistieken te berekenen. Deze bioassay kan ook worden gebruikt om ST 50-overlevingstijdwaarden te bepalen na inoculatie met een vaste dosis virus.
In dit geval wordt de mortaliteit van de larven elke vier tot acht uur gescoord, met frequentere observaties. Indien de mortaliteitssnelheid hoog is, worden de mediane overlevingstijden binnen de 95% betrouwbaarheidsgrenzen berekend met de Kaplan-Meier-estimator via een S-plus- of SAS-programma. Nu Harran u de bioassay met behulp van een micro-applicator met het butted virus heeft voorgedaan.
Ik zal u de assay laten zien. Bij het gebruik van polyhedra wordt orale inoculatie van polyhedra direct in het darmkanaal van het insect toegepast wanneer de exacte timing van de infectie kritiek is. Bijvoorbeeld bij het monitoren van hoe het virus zich binnen het insect verspreidt. Om deze assay te starten, suspendeert u polyhedra in een neutraal drijvende oplossing van glycerine en water in een verhouding van 3:2, met een concentratie van 10 tot 300.
Polyhedra kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt voor het vierde stadium van h ance. Laad deze oplossing vervolgens in een plastic of glazen tuberculinespuit van 1 CC met een stompe naald van 32 gauge. Plaats de spuit op de steunbuis van de micro-applicator terwijl u door een microscoop kijkt.
Houd de sterlarve in het vierde of vijfde stadium vast, steek de naald door de mond in het voorste gedeelte van de middendarm en breng vervolgens de polyhedra in. Deze techniek vereist enige oefening. Ten eerste kan het lastig zijn om de larven met handschoenen vast te houden zonder ze te pletten.
Ten tweede is er enige oefening nodig om de naald langs de monddelen te manoeuvreren. Wij raden aan om te oefenen met het inoculeren van ongeveer 30 larven met PBS. Mocht u per ongeluk de darm doorprikken, dan is dit duidelijk zichtbaar omdat de larven snel melaniseren en zwart worden.
Omdat orale inoculatie met behulp van een micro-applicator het exacte tijdstip van infectie vastlegt, is deze methode het meest nuttig voor experimenten waarbij het infectietijdstip van belang is om te bepalen hoe het virus zich in het insect verspreidt. Bijvoorbeeld, virussen die bèta-galactosidase tot expressie brengen, kunnen oraal worden geïnoculeerd in larven, die vervolgens op verschillende tijdstippen worden gedisseceerd om te bepalen welke weefsels geïnfecteerd raken. We tonen u twee methoden voor infectie met behulp van een micro-applicator in insecten met virus. De eerste is directe inoculatie via de proleg van het insect met het virus, wat het mogelijk maakt om de darmfysiologie te omzeilen en de letaliteit en de dodelijke tijd van het virus waarin u geïnteresseerd bent, te beoordelen.
De tweede techniek was directe inoculatie in de middendarm met behulp van polyhedra. Hiermee kan een zeer precieze dosis rechtstreeks in de middendarm worden toegediend, terwijl er ook een zeer nauwkeurige controle over het tijdstip van de gebeurtenis mogelijk is. Vervolgens kunnen de mortaliteit en andere fenotypen van het virus worden bestudeerd.
Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de door het cadavers baula-virus gedode larven doorgaans fragiel zijn en gemakkelijk kunnen scheuren, waarbij het virus vrijkomt. Steriliseer daarom de werkoppervlakken en voer besmette handschoenen en wegwerpmaterialen op een passende wijze af om contaminatie te voorkomen. Dat is alles.
Bedankt voor het kijken. Veel succes met uw experiment.
Overzicht
Deze video demonstreert twee microapplicatietechnieken voor het infecteren van lepidopteralarven met baculovirus om de insecticide-efficiëntie te beoordelen. De methoden omvatten directe injectie van gebufferd virus en orale inoculatie van polyhedra.
Belangrijkste Onderdeel van de Studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Entomologie
- Virologie
- Insecticidenonderzoek
Achtergrond
- Baculovirussen worden in het onderzoek gebruikt voor de expressie van eukaryote eiwitten.
- Ze worden ontwikkeld als milieuvriendelijke insecticiden.
- Lepidoptera-larven kunnen worden geïnfecteerd door consumptie van geïnfecteerd bladmateriaal.
- Het virus kan ervoor zorgen dat de larven oplossen in een polyhedrale slijmachtige substantie, waardoor de infectiecyclus wordt voortgezet.
Doel van de studie
- Om methoden aan te tonen voor het infecteren van larven met baculovirus.
- Om de insecticide effectiviteit van verschillende baculovirusstammen te evalueren.
- Om protocollen te bieden voor bioassays ter beoordeling van de larvale mortaliteit.
Gebruikte methoden
- Injectie van het virus in de hemocoele van larven.
- Orale inoculatie van polyhedra in het darmstelsel van larven.
- Gebruik van microapplicators voor de nauwkeurige toediening van virale oplossingen.
- Beoordeling van mortaliteitspercentages en timing van de infectie.
Belangrijkste resultaten
- Beide methoden infecteren lepidoptera-larven effectief met baculovirus.
- Injectie maakt een gecontroleerde beoordeling van de virale effecten mogelijk.
- Orale inoculatie geeft inzicht in de timing van de infectie.
- Bioassays kunnen dodelijke concentraties en overlevingstijden bepalen.
Conclusies
- Microapplicator-technieken zijn effectief voor het bestuderen van baculovirusinfecties.
- Deze methoden kunnen helpen bij het evalueren van het potentieel van baculovirussen als insecticiden.
- Verder onderzoek kan deze technieken optimaliseren voor diverse toepassingen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Nauwkeurige toediening van virale agentia aan insectmodellen maakt mechanische risicoreductie van baculovirus-gebaseerde biopesticiden mogelijk door infectievariabelen te isoleren en dosis-responsrelaties te kwantificeren. Dit ondersteunt de validatie van targets in entomologische pathways en het voorspellende vertrouwen in lethaliteitstesten voorafgaand aan inzet in het veld. De methode helpt bij het screenen van virale stammen op insecticide potentie en informeert go/no-go-beslissingen in de vroege fase van de ontwikkeling van biologics.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken door gecontroleerde doses baculovirus toe te dienen om de darmfysiologie te omzeilen en directe weefkeleffecten te beoordelen.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele doelwitvalidatie via gestandaardiseerde injectie van budded virus in de hemocoel met behulp van een microapplicator.
- Voorspellende waarde: Faciliteert mechanische risicoreductie door het isoleren van de timing van infectie en verspreidingspatronen voor de beoordeling van het dodelijke fenotype.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream workflows door orale inoculatie van polyhedra in de midgut mogelijk te maken met precieze temporele controle.
- Operationele waarde: Pakt assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid aan via calibrated microapplicator-toediening van gedefinieerde virustiters (10⁷–10⁸ PFU/mL).
- Schaalbaarheidswaarde: Benadrukt de geschiktheid voor screening via replicatie van bioassays drie tot vier keer met 30 individuen per dosis voor LC₅₀-bepaling.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele waarde: Ondersteunt ziekterelevante systemen door de studie naar virusverspreiding in weefsels na darmgerichte of systemische infectie mogelijk te maken.
- Preklinische continuïteit: Verbindt ontdekking met preklinische validatie door mortaliteit en overlevingstijd (ST₅₀) te meten met behulp van de Kaplan-Meier-estimator.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Informeert beslissingen over de selectie van virale stammen op basis van resultaten van letale concentratie en overlevingstijd.
Integratie van pipeline en workflow
De methode is geïntegreerd in het continuüm van ontdekking, van vroege doelwitvalidatie via lead-identificatie tot preklinische werkzaamheidstests, door kwantitatieve infectiemodellering in lepidoptera-gastheren mogelijk te maken.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypotheseonderzoek en de verduidelijking van signaalpaden door nauwkeurige toediening van het virus aan specifieke weefsels (hemocoel of middendarm) om pathogeniteitsmechanismen te isoleren.
- Screening: Beschrijft de gereedheid van assays via gestandaardiseerde microapplicator-protocollen voor het toedienen van polyhedra of geknopte virussen met volumecontrole (druppels van 1.0 µL) en snelheidsinstellingen (schaal 0–1).
- Analytica: Benadrukt kwantitatieve resultaten zoals mortaliteitsscoring elke 4–8 uur, LC₅₀-berekening via Polo of SAS, en ST₅₀-schatting met behulp van Kaplan-Meier-analyse.
- Translationeel onderzoek: Verbindt met preklinische continuïteit door tijdopgeloste dissectie van geïnfecteerde larven mogelijk te maken om weefselspecifieke infectiedynamiek te volgen.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Positioneert de microapplicator als een herbruikbaar platform voor gestandaardiseerde virale challenge binnen insecticide R&D-programma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid bij targetvalidatie, vermindering van mechanistische ambiguïteit in infectieroutes en verduidelijking van de kinetiek van virale verspreiding.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van virale toediening via microapplicator-kalibratie en dosering met injectiespuiten.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie bij het screenen van stammen en vermindering van biologische risico's in een laat stadium van de ontwikkeling van biopesticiden.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering van baculovirusstammen op basis van gekwantificeerde gegevens over letaliteit en infectietiming.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereiste expertise in entomologisch handmatige bewerkingen, het bedienen van microapplicatoren en het ontwerp van bioassays.
- De instrumentatie omvat een microapplicator met microprocessorbesturing, een ondersteuningsbuis voor spuiten, naalden met een maat van 28,5–32 gauge en incubatoren bij 28°C.
- Standaardisatie tussen teams vereist een consistente bepaling van de virustiter (plaque- of eindpuntverdunning), volumekalibratie en protocollen voor het scoren van mortaliteit.
- Overwegingen bij de aanpassing omvatten de selectie van het larvale stadium (vroege vijfde instar voor injectie, vierde/vijfde voor orale toediening), bewaking van de darmintegriteit en het voorkomen van bacteriële contaminatie na injectie.
- Praktische beperkingen omvatten de fragiliteit van larven na infectie, de noodzaak voor steriele afvoer van karkassen en uitsluiting van vroege sterfte door injectietrauma.
