Protocollen voor microapplicator-geassisteerde Infectie van lepidoptera Larven met Baculovirus
23 augustus 2008
In deze video, tonen we twee microapplicator technieken die worden gebruikt om infecteren van lepidoptera larven met baculovirus om insecten efficiency te bepalen.
Terwijl het arthropode specifieke baccala-virus wordt gebruikt als standaard onderzoeksinstrument voor eukaryote eiwitexpressiesystemen, wordt het ook ontwikkeld als een milieuvriendelijk insectendodend middel, dat herbivore insecten zoals lepidoptera in de natuur kan doden. Lepidoptera-larven worden geïnfecteerd door baccala-virussen bij het eten van geïnfecteerde bladeren. De larven of rupsen nemen het baccala-virus op in een vorm die bekend staat als een polyhedron, wat een complex van virusdeeltjes is verpakt in een grote kristallijne eiwitstructuur die het virus beschermt tegen uitdroging.
Zodra de larve is geïnfecteerd, verspreidt het geblokte virus de infectie binnenin het insect. Het virus kapt de nucleïnezuur- en eiwitsynthesemachinerie van de gastheer om meer virus en polyhedra te maken. Uiteindelijk wordt de larve zo grondig geïnfecteerd met virus dat ze oplost in een rommelige vloeibare massa van polyhedra die op plantoppervlakken druppelt die door het insect zijn gegeten, en dan begint de cyclus opnieuw om de insectendodende werkzaamheid van een bepaalde Baca te bepalen.
Avir-stam micro applicatortechnieken en bioassays kunnen worden gecombineerd. Leid dorin-larven kunnen worden geïnfecteerd door het geblokte virus direct in de HemosIL of lichaamsholte te injecteren en de mortaliteitspercentages kunnen worden beoordeeld. Bovendien kunnen larven worden geïnfecteerd met polyhedra met behulp van orale micro applicator-ondersteunde injectie en kan de timing van infectie van de darm en andere weefsels worden beoordeeld.
Hallo, ik ben Wendy Sparks in het laboratorium van Brian e boning in het Department of Entomology aan de Iowa State University. Ik kom ook van boning snap. Vandaag laten we je twee procedures zien om lab duct DI te infecteren met het backlog-virus. Beide methoden gebruiken micro applicator.
Ten eerste zal ik je laten zien hoe je een micro applicator gebruikt om lichaamsvirus in de he in de heni te leveren door prole. Dan laat ik je zien hoe je de micro applicator gebruikt om poly header in de mid guard te leveren door muis. Dus laten we beginnen.
Wanneer ontwikkeld voor insectendodende doeleinden, bevatten balo-virussen meestal het polyhedron-gen om orale infectie van plaaginsectenlarven te vergemakkelijken. Er zijn echter soms redenen om een polyhedron-negatief baccala-virus te testen op potentiële insectendodende effecten of om het darmkanaal van een insect te omzeilen. In dit geval kan injectie van geblokt virus met behulp van een micro applicator worden uitgevoerd om larven te infecteren voordat de test wordt gestart.
Het titer van de werkende voorraad van geblokt virus moet worden bepaald met behulp van plaque-assay of endpoint-verdunningsassays. Voor fysiologische experimenten zijn injecties van vijf keer 10 tot de vierde PFU per vijfde stadium H VNS typisch. Om deze bioassay te starten, laadt u elke verdunning van het geblokte virus in een plastic een cc to hercule spuit met een scherpe naaldtip van 28,5 of 32 gauge.
Meestal kan een tot drie microliters geblokte virusoplossing. Met een titer van 10 tot de zevende, min 10 tot de achtste per milliliter worden gebruikt voor elke larve, zodat het laden van 300 tot 500 microliters in de spuit voldoende is voor de meeste doeleinden. Verwijder vervolgens luchtbellen uit de spuit door de spuit rechtop te houden om lucht naar de naaldtip te brengen en af te geven.
Bevestig vervolgens de spuit op de spuitondersteuningsbuis. Stel nu het volume in op 1,0 microliter. Voor elke druppel op de microprocessorbesturingseenheid van de micro applicator, kalibreer eerst de besturingseenheid om ervoor te zorgen dat het juiste volume wordt afgegeven, de snelheid waarmee de druppel wordt afgegeven kan worden ingesteld op een schaal van nul tot negen.
Een bereik van nul tot één wordt meestal gebruikt. Druk op de voetschakelaar om ervoor te zorgen dat de oplossing correct wordt afgegeven. Onthoud dat als er te veel oplossing wordt afgegeven of als de toepassing te langzaam is, de volume- en snelheidsinstellingen kunnen worden aangepast totdat het juiste volume oplossing met de juiste snelheid wordt aangebracht.
Ik ben nu klaar om te beginnen met de injectie voor H VNS-infectie. Vroeg vijfde stadium larven worden meestal geïnjecteerd, de grotere grootte van de latere stadia vergemakkelijkt het injectieproces. Steek de naaldtip door de plana van een van de pro legs en in de lichaamsholte.
Let op, wanneer de naaldtip in de prole wordt gestoken, verander de lichaamspositie van de larve. Om schade aan de darm en lichaamswand te voorkomen, druk nu vier keer op de voetschakelaar om vier microliters van de virusoplossing in de hemo-seal te brengen. Nadat de injecties zijn voltooid, brengt u alle larven terug naar de 28 graden Celsius incubator. Controleer regelmatig op dode larven en om ervoor te zorgen dat er voldoende dieet beschikbaar is voor overlevende larven.
Hoewel late stadia niet sterven door verwonding aan de cuticula als gevolg van injectie, moeten de larven nog 24 uur na injectie worden gecontroleerd op schade aan de darm, die kan resulteren uit bacteriële infectie. Deze vroege mortaliteit moet worden uitgesloten van gegevensanalyse. Als u de micro applicator-ondersteunde bioassay met geblokt virus gebruikt voor dodelijke concentratie bioassays, moet de bioassay drie of vier keer op aparte tijdstippen worden gerepliceerd.
Gebruik 30 individuen per dosis voor elke virus- of controlebehandeling. Gebruik een geschikt probate-analyseprogramma zoals polo of SAS om lc 50-waarden, 95% betrouwbaarheidsintervallen en de juiste statistieken te berekenen. Deze bioassay kan ook worden gebruikt om ST 50-overlevingstijden te bepalen na inoculatie van een vaste dosis virus.
In dit geval wordt de sterfte van larven elke vier tot acht uur geregistreerd met frequentere waarnemingen. Als de sterfteratio hoog is, worden de mediane overlevingstijden in de 95% betrouwbaarheidslimieten berekend met behulp van de Kaplan Meyer-schatting met behulp van een s plus of SAS-programma. Nu Harran je de micro applicator-ondersteunde bioassay met geblokt virus heeft laten zien.
Ik laat je de assay zien. Het gebruik van polyhedra Orale inoculatie van polyhedra direct in het insectendarmkanaal wordt
Overzicht
Deze video toont twee microapplicatortechnieken voor het infecteren van lepidoptera-larven met baculovirus om de insecticide efficiëntie te beoordelen. De methoden omvatten directe injectie van afgesneden virus en orale inoculatie van polyhedra.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Entomologie
- Virologie
- Insecticide onderzoek
Achtergrond
- Baculovirussen worden gebruikt in onderzoek voor eukaryotische eiwitexpressie.
- Ze worden ontwikkeld als milieuvriendelijke insecticiden.
- Lepidoptera-larven kunnen worden geïnfecteerd door het innemen van geïnfecteerd blad.
- Het virus kan ervoor zorgen dat de larven oplossen in een polyhedrale vloeistof, waardoor de infectiecyclus voortduurt.
Doel van het onderzoek
- Om methoden te demonstreren voor het infecteren van larven met baculovirus.
- Om de insecticide werkzaamheid van verschillende baculovirusstammen te evalueren.
- Om protocollen te bieden voor bioassays die de mortaliteit van larven beoordelen.
Gebruikte methoden
- Injectie van afgesneden virus in de hemocoel van larven.
- Orale inoculatie van polyhedra in de darm van larven.
- Gebruik van microapplicatoren voor nauwkeurige aflevering van virale oplossingen.
- Beoordeling van sterftecijfers en infectietijdstip.
Belangrijkste resultaten
- Beide methoden infecteren lepidoptera-larven effectief met baculovirus.
- Injectie maakt een gecontroleerde beoordeling van virale effecten mogelijk.
- Orale inoculatie geeft inzicht in de timing van infectie.
- Bioassays kunnen dodelijke concentraties en overlevingstijden bepalen.
Conclusies
- Microapplicatortechnieken zijn effectief voor het bestuderen van baculovirusinfecties.
- Deze methoden kunnen helpen bij het evalueren van het potentieel van baculoviruses als insecticiden.
- Verder onderzoek kan deze technieken optimaliseren voor verschillende toepassingen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Precise delivery of viral agents to insect models enables mechanistic de-risking of baculovirus-based biopesticides by isolating infection variables and quantifying dose-response relationships. This supports target validation in entomological pathways and predictive confidence in lethality assays prior to field deployment. The method aids in screening viral strains for insecticidal potency and informs go/no-go decisions in early-stage biologics development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by delivering controlled doses of baculovirus to bypass gut physiology and assess direct tissue effects.
- Operational Value: Supports functional target validation through standardized microapplicator-assisted injection of budded virus into the hemocoel.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by isolating infection timing and dissemination patterns for lethal phenotype assessment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by enabling oral inoculation of polyhedra into the midgut with precise temporal control.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through calibrated microapplicator delivery of defined virus titers (10⁷–10⁸ PFU/mL).
- Scalability Value: Highlights screening readiness via replication of bioassays three to four times with 30 individuals per dose for LC₅₀ determination.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Supports disease-relevant systems by enabling study of virus dissemination in tissues following gut-targeted or systemic infection.
- Preclinical Continuity: Connects discovery through preclinical validation by measuring mortality and survival time (ST₅₀) using Kaplan-Meier estimator.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs decisions on viral strain selection based on lethal concentration and survival time outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical efficacy testing by enabling quantitative infection modeling in lepidopteran hosts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by allowing precise delivery of virus to specific tissues (hemocoel or midgut) to isolate mechanisms of pathogenesis.
- Screening: Describes assay readiness through standardized microapplicator protocols for delivering polyhedra or budded virus with volume control (1.0 µL droplets) and speed settings (0–1 scale).
- Analytics: Highlights quantitative outputs such as mortality scoring every 4–8 hours, LC₅₀ calculation via Polo or SAS, and ST₅₀ estimation using Kaplan-Meier analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling time-resolved dissection of infected larvae to track tissue-specific infection dynamics.
- Enterprise Reuse: Frames the microapplicator as a reusable platform for standardized viral challenge across insecticidal R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in infection routes, and clarification of viral dissemination kinetics.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of viral delivery via microapplicator calibration and syringe-based dosing.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency in strain screening, and reduced late-stage biological risk in biopesticide development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of baculovirus strains based on quantified lethality and infection timing data.
Implementation Considerations
- Required expertise in entomological handling, microapplicator operation, and bioassay design.
- Instrumentation includes microapplicator with microprocessor control, syringe support tube, 28.5–32 gauge needles, and incubators at 28°C.
- Cross-team standardization requires consistent virus titer determination (plaque or endpoint dilution), volume calibration, and mortality scoring protocols.
- Adaptation considerations include larval instar selection (early fifth instar for injection, fourth/fifth for oral), gut integrity monitoring, and avoidance of bacterial contamination post-injection.
- Practical limitations include larval fragility post-infection, need for sterile disposal of cadavers, and exclusion of early mortality from injection trauma.
