Sigma's Niet-specifieke protease activiteit Assay - caseïne als een substraat

Proteasen breken peptidebindingen af in het laboratorium. Het is vaak noodzakelijk om de activiteit van proteasen te meten en/of te vergelijken. De universele protease-activiteitsassay van Sigma kan worden gebruikt als een gestandaardiseerde procedure om de activiteit van proteasen te bepalen, wat wij doen tijdens onze kwaliteitscontroleprocedures.

In deze assay fungeert casiaïne als substraat wanneer de protease die we testen casiaïne verteert. Het aminozuur tyrosine komt vrij samen met andere aminozuren en peptidefragmenten. Vrije tyrosine reageert vervolgens met Folin-Ciocalteu-fenol of Folin-reagens om een blauwgekleurde chromofoor te produceren, die kwantificeerbaar is en wordt gemeten als een absorbentiewaarde op de spectrofotometer.

Hoe meer tyrosine er uit caseïne wordt vrijgegeven, hoe meer chromoforen er worden gegenereerd en hoe sterker de activiteit van het protease is. De absorbantie-waarden die door de activiteit van het protease worden gegenereerd, worden vergeleken met een standaardcurve die is opgesteld door bekende hoeveelheden tyrosine te laten reageren met het FC-reagens om veranderingen in absorbantie te correleren. Met de hoeveelheid tyrosine in micromol uit de standaardcurve kan de activiteit van protease-monsters worden bepaald in eenheden, wat de hoeveelheid micromol tyrosine-equivalenten is die per minuut uit caseïne worden vrijgegeven. Hallo, mijn naam is Carrie Cup Vineyard en ik ben wetenschapper bij onze Sigma Aldridge DeKalb-vestiging hier in St. Louis, Missouri.

Vandaag laat ik u een universeel toepasbare methode zien om de protease-activiteit bij Sigma Aldridge te testen. We gebruiken deze assay voornamelijk in onze kwaliteitscontroleafdeling om er zeker van te zijn dat onze protease voldoende activiteit heeft voordat we deze rechtstreeks naar uw laboratorium verzenden. Voordat we met de assay beginnen, moeten we controleren of de volgende reagentia correct zijn voorbereid.

Een 50 millimolair kaliumfosfaatbuffer, pH 7.5. De oplossing wordt vóór gebruik op 37 graden Celsius geplaatst; een 0,65% gewicht-volumekasian-oplossing, bereid door 6,5 milligram per milliliter in één liter te mengen. De temperatuur van de oplossing wordt geleidelijk verhoogd bij voorzichtig roeren naar 80 tot 85 graden Celsius gedurende ongeveer 10 minuten totdat een homogene dispersie is bereikt.

Het is zeer belangrijk om de oplossing niet te laten koken. De pH wordt vervolgens, indien nodig, bijgesteld met natriumhydroxide en zoutzuur. Een 110 millimolaire trichloorazijnzuuroplossing, bereid door een 6,1 normale voorraadoplossing in een verhouding van 1:55 te verdunnen met gezuiverd water, 0,5 millimolaire fallen en seal calts of fallen fenolreagens, wat de oplossing is die met tyrosine zal reageren om een meetbare kleurverandering te genereren.

Dit zal direct gerelateerd zijn aan de activiteit van proteasen. Een 500 millimolaire natriumcarbonaatoplossing, bereid met 53 mg/mL watervrij natriumcarbonaat in gezuiverd water, een enzymverdunningstutoplossing, bestaande uit 10 millimolaire natriumacetaatbuffer met 5 millimolair calcium bij pH 7,5 bij 37 °C. Deze oplossing wordt gebruikt om vaste protease-monsters op te lossen of enzymoplossingen te verdunnen.

De standaardvoorraadoplossing van L-tyrosine, die een initiële concentratie van 1,1 millimolair moet hebben (een oplossing van 0,2 milligram L-tyrosine per milliliter), wordt bereid in gezuiverd water en voorzichtig verwarmd totdat de tyrosine is opgelost. Net als bij de caseïne mag deze oplossing niet koken. Laat de L-tyrosine standaard afkoelen tot kamertemperatuur.

Deze oplossing zal indien nodig verder worden verdund om onze standaardcurve te maken; een vaste protease-monster met een vooraf bepaalde activiteit, dat wordt opgelost met enzymdiluent tot 0,1 tot 0,2 units per milliliter. Deze oplossing dient als positieve controle voor de kwaliteitscontrole-assay en als validatie voor de berekeningen die we zullen uitvoeren om de enzymactiviteit te bepalen. Nu we onze reagentia hebben voorbereid en deze allemaal op de juiste temperatuur zijn, zullen we beginnen met onze protease-assay.

Om deze analyse te starten, selecteer geschikte vials met een volume van ongeveer 15 milliliters. Voor elk enzym dat u test, heeft u vier vials nodig. Eén vial wordt gebruikt als blanco en de drie andere worden gebruikt om de activiteit van drie te analyseren.

Verdunning van het protease: drie verdunningen zijn nuttig bij het controleren van de uiteindelijke berekeningen tegen elkaar. Voeg aan elke set van vier flacons 5 mL van de 0,65% kasian-oplossing toe en laat deze ongeveer vijf minuten equilibreren in een waterbad van 37 °C. Voeg vervolgens variërende concentraties van de enzymoplossing toe aan drie van de testmonsterflacons, maar niet aan de blanco. Meng deze door te zwenken en incubeer gedurende exact 10 minuten bij 37 °C.

De proteaseactiviteit en de daaropvolgende vrijgave van tyrosine tijdens deze incubatietijd is wat gemeten en vergeleken zal worden tussen onze testmonsters. Voeg na deze incubatie van 10 minuten vijf milliliter van het TCA-reagens toe aan elke buis. Voeg vervolgens aan elke buis, inclusief de blanco, een passend volume enzymoplossing toe, zodat het uiteindelijke volume enzymoplossing in elke buis één milliliter is.

Dit wordt gedaan om rekening te houden met de absorbentiewaarde van het enzym zelf. Incubeer de oplossingen nu gedurende 30 minuten bij 30 °C. Tijdens deze incubatie van 30 minuten kunt u de verdunningsreeksen van de tyrosinestandaard voorbereiden, waarvoor zes DR-buisjes worden gebruikt.

Hierin passen gemakkelijk acht milliliter in de zes vials. De 1,1 millimolaire tyrosine-standaardoplossingen worden toegevoegd in de volgende volumes in milliliter: 0,05, 0,1, 0,2, 0,4 en 0,5. Voeg geen tyrosine-standaard toe aan de blanco.

Lagere standaarden kunnen nodig zijn voor IPU-testmonsters die weinig kleurverandering vertonen. Zodra de tyrosinestandaardoplossing is toegevoegd, wordt aan elke standaard een geschikt volume gezuiverd water toegevoegd om het volume aan te vullen tot twee milliliter. Filter na de incubatie elke testoplossing en de blanco.

Met behulp van een spuitfilter van 0,45 micron worden twee milliliter van de testmonsters en het blanco filtraat toegevoegd aan vier DR-buisjes met een minimale capaciteit van acht milliliter. U kunt hetzelfde type buisje gebruiken waarin de standaarden zijn bereid. Aan alle buisjes die de standaarden en de standaardblanco bevatten, worden vijf milliliter natriumcarbonaat toegevoegd en, voor optimale resultaten, direct daarna het betreffende reagens. Vervolgens wordt natriumcarbonaat toegevoegd aan de testmonsters en de testblanco. U zult merken dat deze oplossingen troebel worden na de toevoeging van natriumcarbonaat.

Vervolgens wordt het neerslagreagens toegevoegd, dat zal reageren met vrij tyrosine. De DRAM-buisjes worden daarna gemengd door te zwenken en na deze incubatie 30 minuten lang bij 37 graden Celsius geïncubeerd. U zult merken dat de standaarden een kleurgradiënt vertonen die correleert met de toegevoegde hoeveelheid tyrosine, waarbij de hoogste tyrosineconcentraties het donkerst verschijnen.

U kunt ook een aanzienlijke kleurverandering in onze testmonsters waarnemen. Twee milliliters van deze oplossingen worden gefiltreerd met een spuitfilter van 0,45 micron en overgebracht naar geschikte cuvetten. Nu de assay is voltooid, gaan we naar de spectrofotometer om de absorptiewaarden te registreren.

De absorbentie van onze monsters wordt gemeten met een spectrophotometer bij een golflengte van 660 nanometer. De lichtweg is ingesteld op één centimeter; registreer de absorbentiewaarden voor de standaarden, het standaard blanco, de verschillende testmonsters en een testblanco. Zodra alle gegevens zijn verzameld, kunnen we de standaardcurve opstellen.

Om de curve te genereren, moet het verschil in absorbantie tussen de standaard en de standaardblank worden berekend. Dit is de absorbantiewaarde die toe te schrijven is aan de hoeveelheid tyrosine in de standaardoplossingen. Na deze eenvoudige berekening maken we onze standaardcurve door de verandering in absorbantie van onze standaarden op de Y-as uit te zetten tegenover de hoeveelheid in micromol voor elk van onze vijf standaarden op de X-as.

Zodra we onze datapunten hebben ingevoerd en een best-fit-lijn hebben gegenereerd, bepalen we de verandering in absorptie in onze testmonsters door het verschil te berekenen tussen de absorptie van ons testmonster en de absorptie van onze testblank. Aan de hand van onze standaardcurve identificeren we de absorptiewaarde voor een van onze testmonsters op de Y-as. Vervolgens trekken we een lijn parallel aan de X-as tot het punt waarop we de standaardcurve raken.

Vanaf de X-coördinaat die op dit punt is bepaald, hebben we de hoeveelheid en micromol tyrosine die tijdens deze specifieke proteolytische reactie zijn vrijgekomen. Om de enzymactiviteit in eenheden per milliliter te bepalen, voert u de volgende berekening uit: neem het aantal vrijgekomen micromol tyrosine-equivalenten, verkregen uit de standaardcurve, en vermenigvuldig dit met het totale volume van de assay in milliliters, wat in ons geval 11 milliliter is. Deel deze waarde vervolgens door drie andere grootheden.

De duur van de assay, die we 10 minuten hebben uitgevoerd, het volume enzym dat in de assay is gebruikt, dat is gevarieerd. Laten we één milliliter gebruiken. Het volume in milliliters dat is gebruikt voor de colorimetrische detectie, wat kan variëren afhankelijk van uw Qvet.

We gebruiken twee milliliter. Micromolen tyrosine gedeeld door de tijd in minuten geeft ons de maat voor proteaseactiviteit die we eenheden noemen. We kunnen de eenheden voor volumemeting in de teller en noemer wegstrepen, waardoor we overblijven met een maat voor enzymactiviteit in termen van eenheden per milliliter.

Om de activiteit in een vaste protease-monster te bepalen dat is verdund in enzymdiluent, delen we de activiteit in eenheden per milliliter door de oorspronkelijk in deze assay gebruikte concentratie vast materiaal in milligram per milliliter, waardoor we de activiteit verkrijgen in eenheden per milligram. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u de protease-activiteit kunt analyseren met behulp van de universele protease-activiteitsassay van Sigma. Zoals u tijdens deze procedure heeft gezien, is het van cruciaal belang om te onthouden dat zowel de caseïne- als de tyrosine-oplossingen langzaam moeten worden verwarmd en niet mogen koken.

Daarnaast is het essentieel om verschillende blanco's voor te bereiden, zowel voor uw standaarden als voor elk testmonster dat u heeft. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw protease-activiteitsmetingen.