Name: Sigmas Niet-specifieke protease activiteit Assay - caseïne als een substraat (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-17T09:14:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Leer hoe je protease-activiteit kwantitatief meet met behulp van caseïne als substraat en tyrosine-vrijmaking als indicator. Deze gestandaardiseerde biochemische methode zorgt voor betrouwbare kwaliteitscontrole van enzympreparaten in het laboratorium.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Voor het begin van de test, moeten we ervoor zorgen dat de volgende reagentia correct zijn bereid: <ol><li> Een 50 mM kalium fosfaatbuffer, pH 7,5. Voor te bereiden met behulp van 11,4 mg / ml van kalium fosfaat tweebasisch, trihydraat in gezuiverd water en aanpassing van de pH met 1M HCl. Deze oplossing wordt geplaatst bij 37 ° C voor gebruik. </li><li> Een 0,65% gewicht / volume caseïne-oplossing, bereid door het mengen van 6,5 mg / ml van caseïne in de 50 mM kalium fosfaat buffer. Geleidelijk verhoogd de oplossing temperatuur met zacht roeren tot 80-85 ° C gedurende ongeveer 10 minuten tot een homogene dispersie is bereikt. Het is zeer belangrijk niet aan de kook de oplossing. De pH wordt vervolgens aangepast, indien nodig met NaOH en HCl. </li><li> Een 110 mm Trichloorazijnzuuroplossing, bereid door verdunning van een 6.1N voorraad 01:55 met gezuiverd water. Trichloorazijnzuur is een sterk zuur en moet met zorg worden behandeld. </li><li> 0,5 mM Folin &amp; Ciolcaltea, of fenol reagens Folin, die is de oplossing die zal reageren met tyrosine tot een meetbare kleur verandering die rechtstreeks zal worden gerelateerd aan de activiteit van proteasen te genereren. Fenol Reagens Folin is een zuur en moet met zorg worden behandeld. </li><li> Een 500 mM natriumcarbonaatoplossing, bereid met 53 mg / ml anyhydrous natriumcarbonaat in gezuiverd water. Een enzym verdunningsmiddel oplossing, die van 10 mM natriumacetaatbuffer met 5mm calciumacetaat, pH 7,5, bestaat bij 37 ° C. Deze oplossing is wat we gebruiken om vast protease monsters te ontbinden of enzym-oplossingen te verdunnen. </li><li> 1,1 mM L-tyrosine Standard stamoplossing. Bereid met behulp van 0,2 mg / ml L-tyrosine in gezuiverd water en voorzichtig verwarmd tot het tyrosine oplost. Net als bij de caseïne, niet koken deze oplossing. Laat de L-tyrosine standaard afkoelen tot kamertemperatuur. Deze oplossing wordt verder verdund tot onze standaard curve te maken. </li><li> Protease oplossing. Vlak voor het gebruik, oplossen protease-enzym in verdunningsmiddel bereide oplossing in stap 6. </li></ol> Indien nodig, gebruik dan een stevige protease steekproef van vooraf bepaalde activiteit, die wordt opgelost met behulp van enzym verdunningsmiddel tot 0,1-0,2 eenheden / ml. Deze oplossing dient als een positieve controle voor de kwaliteitscontrole assay en als validatie voor de berekeningen zullen we uitvoeren om enzymactiviteit te bepalen. Het opzetten van de Protease Assay en Standard Curves <ol><li> Om te beginnen deze test vinden van geschikte injectieflacons die houdt ongeveer 15 ml. Voor elke enzym dat zal worden getest, zijn vier flacons nodig. Een flacon zal gebruikt worden als een blanco, en drie anderen zullen worden gebruikt om de test activiteit van drie verdunningen van het protease. Drie verdunningen zijn handig bij het controleren van definitieve berekeningen tegen elkaar. <ol><li> Aan elke set van vier flacons, voeg 5mls van ons 0,65% caseïne-oplossing. Laat ze in een waterbad evenwicht bij 37 ° C gedurende ongeveer 5 minuten. </li><li> Voeg variërende hoeveelheden enzym-oplossing die zal worden getest om drie van het monster flacons, maar niet de blanco. Meng door zwenken en incubeer gedurende 37 ° C gedurende precies tien minuten. De protease-activiteit en als gevolg bevrijding van tyrosine in deze incubatietijd is wat er zal worden gemeten en vergeleken tussen de te testen monsters. </li></ol></li><li> Na deze 10 minuten incubatie, voeg de 5 ml van de TCA reagens aan elke buis om de reactie te stoppen. Voeg vervolgens een geschikt volume van enzymoplossing aan elke buis, zelfs de lege, zodat het uiteindelijke volume van het enzym oplossing in elke buis is 1 ml. Dit wordt gedaan om rekening te houden met deze extinctie van het enzym zelf en ervoor te zorgen dat de uiteindelijke volume in elke buis gelijk is. Incubeer de oplossingen bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Tijdens deze 30 minuten incubatie, kunt u om uw tyrosine standaard verdunningen. Gebruik 6 dram flacons (dram flacons kan worden vervangen met polypropyleen buizen) die gemakkelijk kan houden 8 ml. Om de zes flacons, voeg de 1,1 mM tyrosine standaard voorraad oplossingen met de volgende hoeveelheden in de MLS: 0.05, 0.10, 0.20, 0.40, 0.50. Voeg geen tyrosine standaard naar de lege. Lagere normen kunnen nodig zijn voor onzuiver proefmonsters dat er weinig kleur te veranderen zal opleveren. Zodra de tyrosine standaard-oplossing is toegevoegd, voeg toe een passende hoeveelheid gezuiverd water aan elk van de normen om het volume op 2 ml te brengen. </li><li> Na de 30 minuten incubatie, filter elk van de testoplossingen en de blanco met behulp van een 0,45 um polyethersulfon spuitfilter. Filtratie is nodig om een ​​onoplosbaar residu te verwijderen uit de monsters. <ol><li> Voeg de filtratie 2 ml van de test monsters en blanco filtraat 4 dram flesjes die ten minste 8 ml. Hetzelfde type flesje waarin de normen zijn opgesteld kan worden gebruikt. </li><li> Als u alle van de injectieflacons met de normen en standaard blanco, voeg 5mls van natriumcarbonaat. Voor het beste resultaat, voeg 1 ml reagens Folin is onmiddellijk daarna. </li><li> Voeg natriumcarbonaat aan een pH-daling die door de toevoeging van reagens van de Folin&#39;s te regelen. </li><li> Voeg natriumcarbonaat op de proef monsters en test leeg. Deze oplossingen troebel na toevoeging van natriumcarbonaat. Voeg de Folin-reagens, die vooral zal reageren met gratis tyrosine. </li><li> Meng de dram flacons door zwenken en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten. </li></ol> Na deze incubatie, dient u merkt dat de normen een gradatie van kleur correleren met de hoeveelheid tyrosine toegevoegd hebben, de hoogste concentraties van tyrosine verschijnen donkerste. U kunt ook merken aanzienlijke kleur veranderen in onze test monsters. 2mls van deze oplossingen worden gefilterd met behulp van een 0,45 um polyethersulfon spuitfilter in geschikte cuvetten. Nu dat de test is uitgevoerd, kunt u overgaan tot de spectrofotometer om onze absorptiewaarden te nemen. </li></ol> Meten en berekenen Absorbance enzymactiviteit <ol><li> De absorptie van de monsters wordt gemeten door een spectrofotometer met een golflengte van 660nm. Het licht pad is ingesteld op 1 cm. Noteer de extinctie waarden voor de normen, standaard leeg, de verschillende proefmonsters, en test leeg. Zodra alle gegevens zijn verzameld, kan de standaard curve worden gemaakt. Om de curve te genereren, verschil in absorptie tussen de standaard en standaard blanco moet worden berekend. Dit is de absorptie waarde toe te schrijven aan de hoeveelheid tyrosine in de standaard oplossingen. Na deze eenvoudige berekening maken van de standaard curve met behulp van een grafische programma om de verandering in absorptie van onze normen op de Y-as, ten opzichte van het bedrag in micromol voor elk van onze vijf normen op de X-as plot. <table style="width: 416px; height: 118px;" border="0"><tbody><tr><th style="text-align:center"> Volume van Tyrosine Standard </th><th style="text-align:center"> uMoles Tyrosine </th></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.05 </td><td style="text-align:center"> 0.055 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.10 </td><td style="text-align:center"> 0.111 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.20 </td><td style="text-align:center"> 0.221 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.40 </td><td style="text-align:center"> 0.442 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.50 </td><td style="text-align:center"> 0.553 </td></tr></tbody></table></li><li> Na de datapunten zijn ingevoerd, het genereren van een lijn van de beste pasvorm en bijbehorende helling vergelijking. Zoek de verandering in absorptie in de test monsters door het verschil te berekenen tussen het proefmonster absorptie en de absorptie van de test leeg. Het plaatsen van de extinctie voor een van de proefmonsters in de helling vergelijking en het oplossen van zal resulteren in de micromol tyrosine bevrijd tijdens deze bijzondere proteolytische reactie. Om de activiteit van het enzym in eenheden per / ml, voert u de volgende berekening: (Umole tyrosine equivalenten vrijgegeven) x (11) Eenheden / ml Enzyme = __________________________________________ (1) x (10) x (2) 11 = Totaal volume (in milliliters) van test 10 = Tijd van de test (in minuten) volgens de definitie van Unit 1 = Volume van Enzyme (in milliliter) van enzym dat wordt gebruikt 2 = Volume (in milliliter) die wordt gebruikt in de colorimetrische bepaling Neem het aantal micromol tyrosine equivalenten vrijgegeven verkregen uit de helling vergelijking en vermenigvuldigen met het totale volume van de test in de MLS, die in ons geval is 11mls. Deel deze waarde door drie andere hoeveelheden: de tijd van de test, die we renden gedurende 10 minuten, het volume van de enzym gebruikt in de test, die was gevarieerd (laten we het gebruik van 1 ml), het volume van de milliliters gebruikt in de colorimetrische detectie, die kan verschillen op basis van uw cuvette. We gebruikten 2 ml. </li><li> Micromol tyrosine gedeeld door de tijd in minuten opbrengst meting van de protease activiteit genaamd &quot;eenheden&quot;. We kunnen opheffen van de eenheden voor volume-meting in de teller en de noemer, waardoor een Measurment van de enzymactiviteit in termen van eenheden / ml. Om de activiteit in een stevige protease monster verdund in enzym verdunningsmiddel te bepalen, verdelen we onze activiteiten in eenheden / ml door de concentratie van vaste gebruikt in deze test die oorspronkelijk in mg / ml., Waardoor we met een activiteit in termen van eenheden / mg . Eenheden / ml enzym Eenheden / mg solide = _____________________ mg vaste / ml enzym </li></ol>

<ol><li>Anson, M. L. J. Gen. Physiol. 22, 79-89 (1938).</li>
<li>Folin, O., Ciocalteau, V. J. Biol. Chem. 73, 627- (1929).</li>
</ol>

We hebben net zien hoe je protease-activiteit te analyseren met behulp van universele protease Sigma activiteit assay. Daarnaast is deze test is nuttig om ervoor te zorgen dat onze proteases precies hebben activiteit bepaald voordat u ze ontvangt voor uw experimenten. Zoals u hebt gezien, bij het uitvoeren van deze procedure, is het van het grootste belang om te onthouden om zowel de caseïne en tyrosine oplossingen warmte langzaam en niet om ze te koken. Ook is het van cruciaal belang voor verschillende blanks voor te bereiden op zowel uw normen en voor elke test sample die je hebt.

<table><tbody><tr><td>Protease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4630</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat, dibasisch, trihydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5504</td><td></td></tr><tr><td>Caseïne</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7078</td><td></td></tr><tr><td>Trichloorazijnzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0699</td><td></td></tr><tr><td>Folin &amp;amp; Ciocalteu fenolreagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9252</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcarbonaat, watervrij</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetaat, trihydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8625</td><td></td></tr><tr><td>Calciumacetaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1000</td><td></td></tr><tr><td>L-Tyrosine, vrije base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>Protease Profiler Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PP0500</td><td></td></tr><tr><td>Protease Fluorescent Detection Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PF0100</td><td></td></tr></tbody></table>

sigma&#39;s niet-specifieke protease activiteit assay - caseïne als een substraat

Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

Proteasen breken peptide-bindingen. In het lab, is het vaak noodzakelijk om te meten en / of vergelijk de activiteit van proteasen. Sigma&#39;s niet-specifieke protease activiteit test kan worden gebruikt als een standaard procedure om de activiteit van proteasen, dat is wat we doen tijdens onze procedures voor kwaliteitscontrole bepalen. In deze test, caseïne fungeert als een substraat. Wanneer de protease we testen caseïne verteert, het aminozuur tyrosine wordt bevrijd, samen met andere aminozuren en peptide fragmenten. Folin en Ciocalteus Fenol, of Folin&#39;s reagens reageert in de eerste plaats met gratis tyrosine om een ​​blauw gekleurde chromofoor, die kwantificeerbaar en gemeten als een absorptie waarde op de spectrofotometer te produceren. Hoe meer tyrosine dat vrijkomt uit caseïne, hoe meer de chromoforen worden gegenereerd en hoe sterker de activiteit van het protease. Absorptiewaarden gegenereerd door de activiteit van het protease worden vergeleken met een standaard curve, die wordt gegenereerd door omzetting van bekende hoeveelheden van tyrosine met de FC reagens op veranderingen in de absorptie correleren met de hoeveelheid tyrosine in micromol. Van de standaard curve van de activiteit van protease monsters kan worden bepaald in termen van Units, waarvan het bedrag wordt in micromol tyrosine equivalenten vrijgelaten uit caseïne per minuut. Om dit artikel in het Chinees, <a href="http://jove.com/index/details.stp?ID=910">klik hier</a>

Proteasen breken peptide-bindingen. In het lab, is het vaak noodzakelijk om te meten en / of vergelijk de activiteit van proteasen. Sigma&#39;s niet-specifieke protease activiteit test kan worden gebruikt als een gestandaardiseerde procedure om de activiteit van proteasen te bepalen.

Sigma&#39;s Niet-specifieke protease activiteit Assay - caseïne als een substraat

Proteasen breken peptidebindingen. In het laboratorium is het vaak noodzakelijk om de activiteit van proteasen te meten en/of te vergelijken. De aspecifieke protease van Sigma ...

Proteasen breken peptidebindingen af in het laboratorium. Het is vaak noodzakelijk om de activiteit van proteasen te meten en/of te vergelijken. De universele protease-activiteitsassay van Sigma kan worden gebruikt als een gestandaardiseerde procedure om de activiteit van proteasen te bepalen, wat wij doen tijdens onze kwaliteitscontroleprocedures.In deze assay fungeert casiaïne als substraat wanneer de protease die we testen casiaïne verteert. Het aminozuur tyrosine komt vrij samen met andere aminozuren en peptidefragmenten. Vrije tyrosine reageert vervolgens met Folin-Ciocalteu-fenol of Folin-reagens om een blauwgekleurde chromofoor te produceren, die kwantificeerbaar is en wordt gemeten als een absorbentiewaarde op de spectrofotometer.Hoe meer tyrosine er uit caseïne wordt vrijgegeven, hoe meer chromoforen er worden gegenereerd en hoe sterker de activiteit van het protease is. De absorbantie-waarden die door de activiteit van het protease worden gegenereerd, worden vergeleken met een standaardcurve die is opgesteld door bekende hoeveelheden tyrosine te laten reageren met het FC-reagens om veranderingen in absorbantie te correleren. Met de hoeveelheid tyrosine in micromol uit de standaardcurve kan de activiteit van protease-monsters worden bepaald in eenheden, wat de hoeveelheid micromol tyrosine-equivalenten is die per minuut uit caseïne worden vrijgegeven. Hallo, mijn naam is Carrie Cup Vineyard en ik ben wetenschapper bij onze Sigma Aldridge DeKalb-vestiging hier in St. Louis, Missouri.Vandaag laat ik u een universeel toepasbare methode zien om de protease-activiteit bij Sigma Aldridge te testen. We gebruiken deze assay voornamelijk in onze kwaliteitscontroleafdeling om er zeker van te zijn dat onze protease voldoende activiteit heeft voordat we deze rechtstreeks naar uw laboratorium verzenden. Voordat we met de assay beginnen, moeten we controleren of de volgende reagentia correct zijn voorbereid.Een 50 millimolair kaliumfosfaatbuffer, pH 7.5. De oplossing wordt vóór gebruik op 37 graden Celsius geplaatst; een 0,65% gewicht-volumekasian-oplossing, bereid door 6,5 milligram per milliliter in één liter te mengen. De temperatuur van de oplossing wordt geleidelijk verhoogd bij voorzichtig roeren naar 80 tot 85 graden Celsius gedurende ongeveer 10 minuten totdat een homogene dispersie is bereikt.Het is zeer belangrijk om de oplossing niet te laten koken. De pH wordt vervolgens, indien nodig, bijgesteld met natriumhydroxide en zoutzuur. Een 110 millimolaire trichloorazijnzuuroplossing, bereid door een 6,1 normale voorraadoplossing in een verhouding van 1:55 te verdunnen met gezuiverd water, 0,5 millimolaire fallen en seal calts of fallen fenolreagens, wat de oplossing is die met tyrosine zal reageren om een meetbare kleurverandering te genereren.Dit zal direct gerelateerd zijn aan de activiteit van proteasen. Een 500 millimolaire natriumcarbonaatoplossing, bereid met 53 mg/mL watervrij natriumcarbonaat in gezuiverd water, een enzymverdunningstutoplossing, bestaande uit 10 millimolaire natriumacetaatbuffer met 5 millimolair calcium bij pH 7,5 bij 37 °C. Deze oplossing wordt gebruikt om vaste protease-monsters op te lossen of enzymoplossingen te verdunnen.De standaardvoorraadoplossing van L-tyrosine, die een initiële concentratie van 1,1 millimolair moet hebben (een oplossing van 0,2 milligram L-tyrosine per milliliter), wordt bereid in gezuiverd water en voorzichtig verwarmd totdat de tyrosine is opgelost. Net als bij de caseïne mag deze oplossing niet koken. Laat de L-tyrosine standaard afkoelen tot kamertemperatuur.Deze oplossing zal indien nodig verder worden verdund om onze standaardcurve te maken; een vaste protease-monster met een vooraf bepaalde activiteit, dat wordt opgelost met enzymdiluent tot 0,1 tot 0,2 units per milliliter. Deze oplossing dient als positieve controle voor de kwaliteitscontrole-assay en als validatie voor de berekeningen die we zullen uitvoeren om de enzymactiviteit te bepalen. Nu we onze reagentia hebben voorbereid en deze allemaal op de juiste temperatuur zijn, zullen we beginnen met onze protease-assay.Om deze analyse te starten, selecteer geschikte vials met een volume van ongeveer 15 milliliters. Voor elk enzym dat u test, heeft u vier vials nodig. Eén vial wordt gebruikt als blanco en de drie andere worden gebruikt om de activiteit van drie te analyseren.Verdunning van het protease: drie verdunningen zijn nuttig bij het controleren van de uiteindelijke berekeningen tegen elkaar. Voeg aan elke set van vier flacons 5 mL van de 0,65% kasian-oplossing toe en laat deze ongeveer vijf minuten equilibreren in een waterbad van 37 °C. Voeg vervolgens variërende concentraties van de enzymoplossing toe aan drie van de testmonsterflacons, maar niet aan de blanco. Meng deze door te zwenken en incubeer gedurende exact 10 minuten bij 37 °C.De proteaseactiviteit en de daaropvolgende vrijgave van tyrosine tijdens deze incubatietijd is wat gemeten en vergeleken zal worden tussen onze testmonsters. Voeg na deze incubatie van 10 minuten vijf milliliter van het TCA-reagens toe aan elke buis. Voeg vervolgens aan elke buis, inclusief de blanco, een passend volume enzymoplossing toe, zodat het uiteindelijke volume enzymoplossing in elke buis één milliliter is.Dit wordt gedaan om rekening te houden met de absorbentiewaarde van het enzym zelf. Incubeer de oplossingen nu gedurende 30 minuten bij 30 °C. Tijdens deze incubatie van 30 minuten kunt u de verdunningsreeksen van de tyrosinestandaard voorbereiden, waarvoor zes DR-buisjes worden gebruikt.Hierin passen gemakkelijk acht milliliter in de zes vials. De 1,1 millimolaire tyrosine-standaardoplossingen worden toegevoegd in de volgende volumes in milliliter: 0,05, 0,1, 0,2, 0,4 en 0,5. Voeg geen tyrosine-standaard toe aan de blanco.Lagere standaarden kunnen nodig zijn voor IPU-testmonsters die weinig kleurverandering vertonen. Zodra de tyrosinestandaardoplossing is toegevoegd, wordt aan elke standaard een geschikt volume gezuiverd water toegevoegd om het volume aan te vullen tot twee milliliter. Filter na de incubatie elke testoplossing en de blanco.Met behulp van een spuitfilter van 0,45 micron worden twee milliliter van de testmonsters en het blanco filtraat toegevoegd aan vier DR-buisjes met een minimale capaciteit van acht milliliter. U kunt hetzelfde type buisje gebruiken waarin de standaarden zijn bereid. Aan alle buisjes die de standaarden en de standaardblanco bevatten, worden vijf milliliter natriumcarbonaat toegevoegd en, voor optimale resultaten, direct daarna het betreffende reagens. Vervolgens wordt natriumcarbonaat toegevoegd aan de testmonsters en de testblanco. U zult merken dat deze oplossingen troebel worden na de toevoeging van natriumcarbonaat.Vervolgens wordt het neerslagreagens toegevoegd, dat zal reageren met vrij tyrosine. De DRAM-buisjes worden daarna gemengd door te zwenken en na deze incubatie 30 minuten lang bij 37 graden Celsius geïncubeerd. U zult merken dat de standaarden een kleurgradiënt vertonen die correleert met de toegevoegde hoeveelheid tyrosine, waarbij de hoogste tyrosineconcentraties het donkerst verschijnen.U kunt ook een aanzienlijke kleurverandering in onze testmonsters waarnemen. Twee milliliters van deze oplossingen worden gefiltreerd met een spuitfilter van 0,45 micron en overgebracht naar geschikte cuvetten. Nu de assay is voltooid, gaan we naar de spectrofotometer om de absorptiewaarden te registreren.De absorbentie van onze monsters wordt gemeten met een spectrophotometer bij een golflengte van 660 nanometer. De lichtweg is ingesteld op één centimeter; registreer de absorbentiewaarden voor de standaarden, het standaard blanco, de verschillende testmonsters en een testblanco. Zodra alle gegevens zijn verzameld, kunnen we de standaardcurve opstellen.Om de curve te genereren, moet het verschil in absorbantie tussen de standaard en de standaardblank worden berekend. Dit is de absorbantiewaarde die toe te schrijven is aan de hoeveelheid tyrosine in de standaardoplossingen. Na deze eenvoudige berekening maken we onze standaardcurve door de verandering in absorbantie van onze standaarden op de Y-as uit te zetten tegenover de hoeveelheid in micromol voor elk van onze vijf standaarden op de X-as.Zodra we onze datapunten hebben ingevoerd en een best-fit-lijn hebben gegenereerd, bepalen we de verandering in absorptie in onze testmonsters door het verschil te berekenen tussen de absorptie van ons testmonster en de absorptie van onze testblank. Aan de hand van onze standaardcurve identificeren we de absorptiewaarde voor een van onze testmonsters op de Y-as. Vervolgens trekken we een lijn parallel aan de X-as tot het punt waarop we de standaardcurve raken.Vanaf de X-coördinaat die op dit punt is bepaald, hebben we de hoeveelheid en micromol tyrosine die tijdens deze specifieke proteolytische reactie zijn vrijgekomen. Om de enzymactiviteit in eenheden per milliliter te bepalen, voert u de volgende berekening uit: neem het aantal vrijgekomen micromol tyrosine-equivalenten, verkregen uit de standaardcurve, en vermenigvuldig dit met het totale volume van de assay in milliliters, wat in ons geval 11 milliliter is. Deel deze waarde vervolgens door drie andere grootheden.De duur van de assay, die we 10 minuten hebben uitgevoerd, het volume enzym dat in de assay is gebruikt, dat is gevarieerd. Laten we één milliliter gebruiken. Het volume in milliliters dat is gebruikt voor de colorimetrische detectie, wat kan variëren afhankelijk van uw Qvet.We gebruiken twee milliliter. Micromolen tyrosine gedeeld door de tijd in minuten geeft ons de maat voor proteaseactiviteit die we eenheden noemen. We kunnen de eenheden voor volumemeting in de teller en noemer wegstrepen, waardoor we overblijven met een maat voor enzymactiviteit in termen van eenheden per milliliter.Om de activiteit in een vaste protease-monster te bepalen dat is verdund in enzymdiluent, delen we de activiteit in eenheden per milliliter door de oorspronkelijk in deze assay gebruikte concentratie vast materiaal in milligram per milliliter, waardoor we de activiteit verkrijgen in eenheden per milligram. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u de protease-activiteit kunt analyseren met behulp van de universele protease-activiteitsassay van Sigma. Zoals u tijdens deze procedure heeft gezien, is het van cruciaal belang om te onthouden dat zowel de caseïne- als de tyrosine-oplossingen langzaam moeten worden verwarmd en niet mogen koken.Daarnaast is het essentieel om verschillende blanco's voor te bereiden, zowel voor uw standaarden als voor elk testmonster dat u heeft. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw protease-activiteitsmetingen.

sigma-s-non-specific-protease-activity-assay-casein-as-a-substrate

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De Protease Fluorescent Detection Kit is ontworpen voor de meting van de protease-activiteit met behulp van fluorometrie. Het is ook geschikt voor de detectie van sporen van protease besmetting. De methode is gebaseerd op de proteolytische hydroysis van een eigen formulering van een FITC-gelabelde caseïne substraat.

Gebruik van de Protease Fluorescerende Detection Kit om Protease activiteit te bepalen

We passen label-free eiwit interactie analyse met behulp van Biacore X100 voor structuur-functie analyse van de binding van verschillende cystatine B mutanten te papaïne door kinetische karakterisering. Kalibratie-vrije concentratie analyse (CBVC) meet de concentratie van het eiwit met behoud van bindende activiteit, zonder de noodzaak van een standaard curve. We tonen aan dat de bevestiging van de concentraties met behulp van CFCA verhoogt de betrouwbaarheid van de kinetische analyse en dat...

Het belang van correcte eiwitconcentratie voor Kinetics en affiniteit Bepaling in structuur-functie analyse

This video demonstrates a conductimetric biosensor assay to study the interaction of an antibody with a target antigen immobilized on a transducer chip. The biosensor is engineered to have a bifunctional chimeric protein — a β-lactamase enzyme with a functional catalytic site fused to a nanobody for binding to the immobilized target antigen. Upon binding, the catalytic hydrolysis of an antibiotic substrate by the β-lactamase enzyme generates an electrical signal — confirming the...

&beta;-Lactamase-Based Conductimetric Biosensor Assay for Protein-Protein Interactions

This video demonstrates an assay to screen for the proteolytic activity of proteases using fluorogenic peptides. The protease recognizes its cleavage site on the peptide, cleaving it and separating the quencher from the fluorophore, enabling its fluorescence emission. The fluorescence signal is detected and analyzed to check for the cleavage efficiency of different peptide variants.

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen the Proteolytic Activity of Proteases

This video demonstrates how to measure proteasome activity in different subcellular compartments of the lateral amygdala from fear-conditioned and control rat brains using a fluorogenic peptide assay. The proteasome cleaves the fluorogenic peptide substrate, releasing fluorescent molecules, which are quantified using a plate reader to assess proteasome activity in the nuclear and synaptic protein fractions. Increased nuclear activity suggests changes in gene expression, while reduced synaptic...

Measuring Proteasome Activity in Different Subcellular Compartments of the Rat Brain

Hier presenteren we protocollen om snel enzymen te screenen en te karakteriseren op antimicrobiële activiteit. De microslide-diffusietest en de kleurstof-releasetest maken gebruik van doelbacteriële substraten voor kwalitatieve en kwantitatieve evaluatie van enzymatische activiteit.

Kwalitatieve en Kwantitatieve Testen voor detectie en karakterisering van proteïne Antimicrobials

Hier presenteren we een protocol bij het bepalen van protease specificiteit in ruwe muis weefsel extracten met behulp van spectrometrie van de MALDI-TOF.

De vaststelling van specificiteit uit Protease in muis weefsel extracten met behulp van de Spectrometrie van de massa van de MALDI-TOF: manipuleren van de PH veroorzaken specificiteit wijzigingen

Presenteren we een fluorogenic peptide decollete assay waarmee een snelle screening van de proteolytic activiteit van proteasen op peptiden die vertegenwoordigen de breukzijde van virale fusion peptiden. Deze methode kan ook worden gebruikt op elke andere aminozuur motief binnen een eiwit sequentie om te testen voor de protease-activiteit.

Een Fluorogenic Peptide decollete Assay aan het scherm voor Proteolytic activiteit: toepassingen voor coronavirus spike eiwit activering

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor een gewijzigde zymographic techniek waarin fluorescerende peptides worden gebruikt als het afbreekbaar substraat in plaats van de inheemse proteïnen. Elektroforese van biologische monsters in fluorescerende peptide zymograms maakt detectie van een breder scala van proteasen dan vorige zymographic technieken.

Opsporen van Protease-activiteit door fluorescerende Peptide Zymography

In dit manuscript opgericht wij een hoge doorvoersnelheid methode om te kwantificeren van alkalische fosfatase activiteit in S. aureus biofilm cultuur van weefselkweek...

Colorimetrische analyse van alkalische fosfatase activiteit in S. aureus Biofilm

Deze methode beschrijft een op lectine gebaseerde in vitro sedimentatietest om de bindingsaffiniteit van glucaanfosfatase en amylopectine te kwantificeren. Deze co-sedimentatietest is betrouwbaar voor het meten van glucaanfosfatasesubstraatbinding en kan worden toegepast op verschillende opgeloste glucaansubstraten.

Concanavaline A-gebaseerde sedimentatietest om substraatbinding van glucaanfosfatasen te meten

Leer hoe je protease-activiteit kwantitatief meet met behulp van caseïne als substraat en tyrosine-vrijmaking als indicator. Deze gestandaardiseerde biochemische methode zorgt voor betrouwbare kwaliteitscontrole van enzympreparaten in het laboratorium.

Sigma's Niet-specifieke protease activiteit Assay - caseïne als een substraat

Meer video's verkennen